許新銳，周頌東，何興金

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064)

滇芎屬(PhysospermopsisH.Wolff)是傘形科(Apiaceae)芹亞科(Apioideae)美味芹族(Smyrnieae)中的一個(gè)較為原始的屬，多年生草本植物，全世界約有11個(gè)種[1-4]?！禙lora of China》記錄了8種滇芎屬植物，其中4種為中國(guó)特有種[5]。然而多數(shù)學(xué)者[3, 6-7]已經(jīng)根據(jù)形態(tài)和分子證據(jù)將楔葉滇芎(PhysospermopsiscuneataH.Wolff)從滇芎屬劃分出去，楔葉滇芎真正的歸屬還需進(jìn)一步的研究。該屬植物主要分布于喜馬拉雅山脈以及橫斷山脈地區(qū)，主要生長(zhǎng)于海拔2 250～4 800 m的松林下、高山草甸以及灌叢中[8-12]。滇芎屬是芹亞科中一個(gè)分類比較困難的類群，種間界限不清晰，與鄰近屬如瘤果芹屬(TrachydiumLindl.)、棱子芹屬(PleurospermumHoffm.)以及東俄芹屬(TongoloaH.Wolff)的屬間界限也存在很多問(wèn)題。

到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從分子系統(tǒng)學(xué)、果實(shí)解剖學(xué)及微形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)等方面對(duì)該屬植物進(jìn)行了部分研究[6-7, 13-20]，但是對(duì)滇芎屬葉表皮微形態(tài)特征研究的報(bào)道還未曾有過(guò)。在傘形科的形態(tài)分類學(xué)研究方面，植物葉表皮的形態(tài)經(jīng)常被作為分類依據(jù)之一[21-24]。這是由于植物的葉表皮形態(tài)較為穩(wěn)定,氣孔器特征、葉片表面紋飾、細(xì)胞垂周壁式樣等特征具有種間差異，研究這些特征具有一定的分類學(xué)意義。另外，花粉形態(tài)學(xué)研究是傘形科植物分類學(xué)研究的重要依據(jù)，大量研究表明[25-29]，花粉形態(tài)、萌發(fā)孔類型和外壁紋飾等特性為傘形科植物的分類提供了許多有價(jià)值的信息。席以珍等[19]報(bào)道了1種滇芎花粉形態(tài)，王萍莉等[20]報(bào)道了5種滇芎形態(tài)，發(fā)現(xiàn)滇芎屬的花粉立體形狀為三棱球形，赤道面分為菱形、近菱形、近矩形3種形態(tài)，極面為3裂圓形或三角形，萌發(fā)孔類型、外壁、紋飾在種間無(wú)顯著差異，反映了該屬的自然性。

本研究報(bào)道了滇芎屬7種植物的花粉形態(tài)以及葉表皮微形態(tài)，其中3種的花粉形態(tài)為首次報(bào)道，7種葉表皮微形態(tài)為首次報(bào)道。本研究通過(guò)掃描電子顯微鏡對(duì)滇芎屬植物的花粉形態(tài)和葉表皮形態(tài)進(jìn)行觀察比較，為滇芎屬的種間關(guān)系與屬下系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究的7種滇芎屬物種分別為滇芎[Physospermopsisdelavayi(Franchet) H.Wolff]、全葉滇芎[P.alepidioides(H.Wolff & Handel-Mazzetti) R.H.Shan]、木里滇芎(P.muliensisR.H.Shan & S.L.Liou)、麗江滇芎(P.shanianaC.Y.Wu & F.T.Pu)、紫脈滇芎[P.rubrinervis(Franchet) C.Norman]、波棱滇芎[P.obtusiuscula(Wallich ex de Candolle) C.Norman]、小滇芎[P.kingdon-wardii(H.Wolff) C.Norman]，研究材料為干燥后的葉片和花粉，材料來(lái)源見(jiàn)表1，憑證標(biāo)本保存于四川大學(xué)標(biāo)本館(SZ)，憑證材料保存于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物系統(tǒng)與分子進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

表1 材料來(lái)源

1.2 方 法

1.2.2 葉表皮掃描電鏡觀察先將葉片酒精梯度脫水(15%、30%、50%、70%、85%、95%Ⅰ, 95%Ⅱ, 100%Ⅰ, 100%Ⅱ, 每個(gè)梯度時(shí)間間隔1 min左右)，然后避開(kāi)明顯的葉脈，剪取葉片近軸面(上表皮)和遠(yuǎn)軸面(下表皮)中部的材料，將其粘在導(dǎo)電膠上，噴金鍍膜后，置于JSM-7500F型掃描電鏡下觀察后拍照保存并分析。葉表皮描述的術(shù)語(yǔ)參照Baranova[33]和Wilkinson[34]的描述。數(shù)據(jù)測(cè)量工作用軟件KaryoType[30]完成，在遠(yuǎn)軸面隨機(jī)選取10個(gè)氣孔來(lái)測(cè)量氣孔的大小，取均值作為各物種氣孔的平均大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇芎屬花粉形態(tài)特征

本研究報(bào)道的滇芎屬植物中，花粉形態(tài)分為3種類型，即菱形類型、橢圓形類型和近矩形類型。(1)滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的花粉屬于菱形類型，其花粉粒的赤道面觀均為菱形，赤道中心位置向外突出。滇芎的極面觀為三角形，全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的極面觀則均為三角圓形。極軸長(zhǎng)19.57～23.19 μm，赤道軸長(zhǎng)13.99～17.42 μm，極軸與赤道軸之比P/E為1.22～1.48。(2)紫脈滇芎和小滇芎為橢圓形類型。它們的赤道面觀均為橢圓形，赤道中心位置稍向外突出。紫脈滇芎的極面觀為三角形，小滇芎的極面觀為鈍三角形。(3)木里滇芎為近矩形類型。其赤道面為近矩形，赤道兩側(cè)近乎平直，極面觀為鈍三角形。

2.2 滇芎屬葉表皮微形態(tài)特征

觀察近軸面的微形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，滇芎屬植物葉片上表皮的細(xì)胞輪廓大都不清晰(圖版Ⅱ，A1、B1、D1、E1、F1、G1)，只有木里滇芎的葉片上表皮細(xì)胞為規(guī)則的多邊形(圖版Ⅱ，C1)。大部分滇芎屬植物的角質(zhì)膜紋飾為不規(guī)則的條紋(圖版Ⅱ，A1、D1、E1、F1、G1)，滇芎和波棱滇芎還有明顯的脊?fàn)钔黄?，紫脈滇芎和小滇芎具有不太突出的脊?fàn)钔黄?；而全葉滇芎和木里滇芎的角質(zhì)膜接近光滑，其中也存在少量的條紋，且全葉滇芎的葉片上表皮也可以看到一些不太明顯的脊?fàn)钔黄?圖版Ⅱ，B1、C1)。

觀察遠(yuǎn)軸面的微形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，除了木里滇芎的葉片上表皮細(xì)胞為規(guī)則的多邊形(圖版Ⅱ，C2)，滇芎屬其他植物葉片上表皮的細(xì)胞輪廓還是大都不清晰(圖版Ⅱ，A2、B2、D2、E2、F2、G2)。滇芎、麗江滇芎、紫脈滇芎、小滇芎的角質(zhì)膜紋飾為密集的條紋(圖版Ⅱ，A2、D2、E2、G2)，全葉滇芎的較致密具少量條紋及顆粒(圖版Ⅱ，B2)，木里滇芎和波棱滇芎的角質(zhì)膜接近光滑，且在氣孔器周圍有少量條紋(圖版Ⅱ，C2、F2)。

觀察發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)軸面的氣孔數(shù)量及密度均大于近軸面。我們對(duì)氣孔的觀察和統(tǒng)計(jì)均來(lái)自遠(yuǎn)軸面。滇芎屬植物的氣孔器的形狀均為橢圓形及卵圓形。其中，滇芎、麗江滇芎和小滇芎的氣孔形狀為橢圓形(圖版Ⅱ，A3、D3、G3)，其長(zhǎng)寬比L/W為1.6～2.0，全葉滇芎、木里滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎的氣孔形狀為卵圓形(圖版Ⅱ，B3、C3、E3、F3)，其長(zhǎng)寬比L/W為1.3～1.6。滇芎屬植物氣孔器的長(zhǎng)為14.90～25.40 μm，寬為9.76～17.49 μm，其中全葉滇芎的氣孔器最大，木里滇芎的氣孔器最小。滇芎屬植物氣孔器的內(nèi)緣為波狀、淺波狀、嚙蝕狀，氣孔器的外拱蓋形態(tài)為隆起或較扁平。在掃描電鏡下7種滇芎屬植物葉表皮的微形態(tài)特征詳見(jiàn)表3。

表2 滇芎屬7種植物花粉形態(tài)特征

表3 滇芎屬7種植物葉表皮微形態(tài)特征

3 討 論

3.1 花粉形態(tài)在滇芎屬中的分類意義

傘形科的分類主要把果實(shí)的形態(tài)作為其分類依據(jù)，屬間及屬下物種分類困難，因此需要更多的形態(tài)特征來(lái)作為其分類依據(jù)。前人的研究發(fā)現(xiàn)花粉的形態(tài)特征為傘形科的分類提供了重要信息。滇芎屬的屬下種間界限一直以來(lái)都存在問(wèn)題，因此增加花粉形態(tài)作為其分類依據(jù)有助于厘清滇芎屬下的種間關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎、波棱滇芎的花粉形態(tài)相似，赤道面觀均為菱形，極軸與赤道軸之比P/E分別為1.28、1.22、1.45和1.48，均小于1.5。極面觀為三角形或三角圓形，萌發(fā)孔為角孔，赤道區(qū)外壁紋飾皆為典型的腦狀紋飾，其中麗江滇芎的赤道區(qū)外壁紋飾為片狀腦紋，其余3種皆為短棒狀腦紋。這些特征表明上述4種滇芎屬植物均屬于菱形花粉，此類型花粉為傘形科中最為原始的花粉類型。這表明滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎在滇芎屬中處于較原始的地位。

紫脈滇芎和小滇芎的赤道面觀為橢圓形，極軸與赤道軸之比P/E分別為1.69和1.74，均大于1.5，小于2.0。紫脈滇芎的極面觀為三角形，小滇芎的極面觀為鈍三角形，角孔，赤道區(qū)外壁紋飾皆為短棒狀腦紋。這2種花粉屬于橢圓形花粉類型，是一種過(guò)渡花粉類型，比菱形花粉進(jìn)化。這表明紫脈滇芎和小滇芎是滇芎屬內(nèi)較為進(jìn)化的種，可能是由滇芎屬內(nèi)的原始物種逐漸分化而來(lái)的。

木里滇芎的赤道面觀為近矩形，極軸與赤道軸之比P/E為2.07，大于2.0。極面觀為鈍三角形，角孔，赤道區(qū)外壁紋飾為短棒狀腦紋。這種花粉屬于近矩形花粉類型，是傘形科里一種比較進(jìn)化的花粉類型。這表明木里滇芎為滇芎屬內(nèi)最為進(jìn)化的物種。

滇芎屬內(nèi)物種的演化趨勢(shì)是從滇芎、全葉滇芎、麗江滇芎、波棱滇芎等較原始的種，逐漸分化為紫脈滇芎和小滇芎等較為進(jìn)化的種，最后發(fā)展成木里滇芎等最為進(jìn)化的種類。這與王萍莉等[23]的研究存在沖突，對(duì)滇芎和木里滇芎的研究結(jié)果不一致，但是分子證據(jù)[35]支持本研究結(jié)果。滇芎屬的花粉在萌發(fā)孔類型，外壁紋飾上均無(wú)顯著的種間差異，這表明花粉形態(tài)并沒(méi)有發(fā)生急劇的演化，這可能是因?yàn)榉制鐣r(shí)間較短，或者是花粉形態(tài)對(duì)于環(huán)境選擇壓力較為穩(wěn)定。

波棱滇芎和小滇芎在外形上極為相似，在野外僅根據(jù)有無(wú)主莖來(lái)將它們區(qū)分開(kāi)來(lái)。且它們的分布地存在重疊，波棱滇芎在中國(guó)主要分布在云南的德欽，西藏的亞?wèn)|、聶拉木等地；小滇芎主要分布在西藏的聶拉木，波棱滇芎的分布范圍更廣。由于它們?cè)谛螒B(tài)上的相似性，Pimenov[3]認(rèn)為波棱滇芎和小滇芎是一個(gè)物種。從花粉形態(tài)來(lái)看，波棱滇芎是較為原始的菱形花粉，而小滇芎是比較進(jìn)化的橢圓形花粉，可以看出小滇芎的花粉是比波棱滇芎的花粉更為進(jìn)化的，可以根據(jù)花粉特征將兩個(gè)種區(qū)分開(kāi)來(lái)，但是在赤道面紋飾和萌發(fā)孔的類型上，這兩個(gè)物種存在一定的一致性。

3.2 葉表皮微形態(tài)在滇芎屬中的分類意義

對(duì)滇芎屬7種植物的葉表皮微形態(tài)的觀察結(jié)果表明：滇芎屬植物的葉表皮大都沒(méi)有明顯的細(xì)胞輪廓，只有木里滇芎可見(jiàn)多邊形的細(xì)胞輪廓。角質(zhì)膜紋飾都具有明顯或不明顯的條紋。故滇芎屬植物在細(xì)胞形狀和角質(zhì)膜紋飾都不具顯著的差異，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。在氣孔的分布、氣孔形狀、氣孔的內(nèi)緣形態(tài)以及外拱蓋形態(tài)上出現(xiàn)了一定的種間差異。滇芎、麗江滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎的氣孔只在遠(yuǎn)軸面有分布，全葉滇芎、木里滇芎和小滇芎的氣孔在近軸面和遠(yuǎn)軸面皆有分布，其中，木里滇芎的氣孔在近軸面分布的密集程度要大于全葉滇芎和小滇芎；氣孔形狀為橢圓形的有滇芎、麗江滇芎和小滇芎，氣孔形狀為卵圓形的有全葉滇芎、木里滇芎、紫脈滇芎和波棱滇芎；滇芎、木里滇芎、小滇芎的氣孔內(nèi)緣為淺波狀，全葉滇芎、麗江滇芎和波棱滇芎的氣孔內(nèi)緣為波狀，而紫脈滇芎的氣孔內(nèi)緣為嚙蝕狀；紫脈滇芎、波棱滇芎及小滇芎氣孔的外拱蓋為較扁平的，其余4種滇芎植物氣孔的外拱蓋均隆起。滇芎屬植物的每個(gè)種都有其特定的葉表皮微形態(tài)特征，所以葉表皮微形態(tài)特征也可以作為一項(xiàng)重要的分類依據(jù)，幫助解決滇芎屬的種間親緣關(guān)系問(wèn)題。根據(jù)7種滇芎屬植物的葉表皮微形態(tài)特征，編制分類檢索表如下。

對(duì)于波棱滇芎和小滇芎的親緣關(guān)系問(wèn)題，從葉表皮微形態(tài)來(lái)看，波棱滇芎與小滇芎均不具清晰的細(xì)胞輪廓，近軸面的角質(zhì)膜紋飾均為條紋紋飾，但是波棱滇芎遠(yuǎn)軸面的角質(zhì)膜接近光滑，而小滇芎遠(yuǎn)軸面的角質(zhì)膜紋飾依然為密集的條紋紋飾。波棱滇芎的氣孔形狀為卵圓形，小滇芎的氣孔形狀為橢圓形，二者氣孔的外拱蓋均為較扁平的類型，內(nèi)緣為波狀或淺波狀。上述葉表皮微形態(tài)特征在波棱滇芎和小滇芎之間展現(xiàn)出一定的變化，然而在某些特征上也存在一定的相似性，所以本研究結(jié)果不支持Pimenov[3]把這兩個(gè)種合并為一個(gè)種的處理，但是這兩個(gè)種的親緣關(guān)系應(yīng)該比較近。分子研究[35]也表明，這兩個(gè)物種完全分開(kāi)了，且在滇芎屬中的親緣關(guān)系最近，是姐妹類群。

本研究結(jié)果表明，花粉形態(tài)和葉表皮微形態(tài)特征對(duì)于滇芎屬的分類具有一定的參考價(jià)值，可以幫助解決依靠宏觀形態(tài)難以解決的種間分類問(wèn)題。然而，從Pimenov[3]的研究看來(lái)，中國(guó)滇芎屬的種類還不只有《Flora of China》上面記載的8種，更多的種類還需要進(jìn)一步的研究，該屬更大范圍的花粉形態(tài)以及葉表皮微形態(tài)還有待研究。

圖版Ⅰ電鏡下滇芎屬植物花粉形態(tài)
A. 滇芎；B. 全葉滇芎；C. 木里滇芎；D. 麗江滇芎；E. 紫脈滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 極面觀；2. 赤道面觀；3. 赤道面紋飾
PlateⅠ Pollen morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Polar view; 2. Equatorial view; 3. Equatorial sculpture

圖版Ⅱ電鏡下滇芎屬植物葉表皮微形態(tài)
A.滇芎；B.全葉滇芎；C.木里滇芎；D.麗江滇芎；E. 紫脈滇芎；F. 波棱滇芎；G. 小滇芎；1. 近軸面；2. 遠(yuǎn)軸面；3. 氣孔
PlateⅡ Leaf epidermal micro-morphology ofPhysospermopsisH.Wolff under SEM
A.P.delavayi; B.P.alepidioides; C.P.muliensis; D.P.shaniana; E.P.rubrinervis; F.P.obtusiuscula; G.P.kingdon-wardii; 1. Adaxial epidermis; 2. Abaxial epidermis; 3. Stoma