崔 祺，吳 凡，詹 鵬，汪蓮娟，韓蕊蓮, 3，吳 昀*

(1 浙江理工大學(xué) 建筑工程學(xué)院，杭州310018；2 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，教育部林木花卉育種實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083；3 西北農(nóng)林科技大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，陜西楊陵 712100)

百合屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生具有地下鱗莖的單子葉草本植物，是重要的商品花卉和園林綠化植物。近年來(lái)，隨著從國(guó)外引進(jìn)種球數(shù)量的不斷增加，中國(guó)百合栽培面積也在不斷擴(kuò)大。然而，各種病害的發(fā)生對(duì)百合生產(chǎn)的危害不容小覷，其中由灰霉菌(Botrytiselliptica)引起的灰霉病是最為普遍發(fā)生的病害。B.elliptica專性侵染百合的莖、葉及花器官，病害發(fā)生后常常出現(xiàn)葉片焦枯、莖稈軟腐、花苞畸形、花瓣萎蔫等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可造成種植區(qū)內(nèi)百合成片死亡，是切花栽培和種球繁育的重要障礙[1]。生產(chǎn)實(shí)踐證明，應(yīng)用抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效又符合環(huán)保要求的病害防治措施。

前人對(duì)百合種質(zhì)資源進(jìn)行了灰霉病的抗性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)部分野生百合，如岷江百合(L.regale)、宜昌百合(L.leucanthum)、大理百合(L.taliense)和湖北百合(L.henryi)[2]，以及栽培品種中的東方百合和OT(Oriental × Trumpet)百合雜種系對(duì)灰霉病的抗性較強(qiáng)，亞洲百合和喇叭百合系列品種則較為感病[3]。目前少數(shù)百合對(duì)灰霉病表現(xiàn)出一定的抗性，并不存在完全免疫的種或品種。通過(guò)挖掘高抗種質(zhì)材料中參與抗灰霉病反應(yīng)的關(guān)鍵基因，并利用植物基因工程將其轉(zhuǎn)入百合中，培育抗病新品種，已成為防治百合病蟲(chóng)害，促進(jìn)百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要方向之一。

植物幾丁質(zhì)酶(chitinase)是一類由多基因家族編碼的糖苷水解酶(glucoside hydrolase)，各類同功酶的酶活性、氨基酸序列、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白等電點(diǎn)、功能位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位等存在一定差異[4]。前人根據(jù)氨基酸的序列特性，將其分為糖苷水解酶18家族(GH-18)和糖苷水解酶19家族(GH-19)，這兩大家族又進(jìn)一步分為5類(Ⅰ-Ⅴ)，其中Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類屬于GH-19家族，Ⅲ類和Ⅴ類屬于GH-18家族[5]。正常狀況下，幾丁質(zhì)酶表達(dá)量很低或者不表達(dá)，但在受到病原菌或昆蟲(chóng)感染時(shí)，其含量迅速升高，通過(guò)水解病原菌細(xì)胞壁或昆蟲(chóng)外骨骼的幾丁質(zhì)達(dá)到抑制其生長(zhǎng)與增殖的目的[6]。目前已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、水稻(Oryzasativa)[8]、水仙(Narcissustazetta)[9]和菊花(Chrysanthemummorifolium)[10]等多種植物中分離獲得幾丁質(zhì)酶基因。玉米(Zeamays)[11]、番茄(Solanumlycopersicum)[12]、芥菜(Brassicajuncea)[13]和馬鈴薯(Solanumtuberosum)[14]等植物的幾丁質(zhì)酶家族成員已經(jīng)在全基因組范圍內(nèi)得到了鑒定。

前人研究發(fā)現(xiàn)灰霉菌侵染能有效誘導(dǎo)辣椒(Capsicumannuum)[15]、草莓(Fragaria×ananassa)[16]和葡萄(Vitisvinifera)[17]中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)。幾丁質(zhì)酶基因也可由非生物脅迫如鹽堿[18]、寒冷[19]和干旱[20]，以及植物激素茉莉酸(jasmonic acid, JA)和水楊酸(salicylic acid, SA)誘導(dǎo)表達(dá)[14]。將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入檸檬(Citruslimon)[21]、矮牽牛(Petuniahybrida)[22]和番茄[23]中可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)灰霉病的抗性。此外，轉(zhuǎn)化了幾丁質(zhì)酶基因的植物對(duì)其他病害的抗性也得到了增強(qiáng)，如茶樹(shù)(Camelliasinensis)對(duì)茶餅病的抗性[24]、花生(Arachishypogaea)對(duì)黑斑病的抗性[25]、大豆(Glycinemax)對(duì)菌核病的抗性[26]以及蘋(píng)果(Malus×domestica)對(duì)炭疽病和褐斑病的抗性[27]。這些研究說(shuō)明幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

通過(guò)檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，百合屬中只有岷江百合與麝香百合(L.longiflorum)登錄了幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，同其他植物相比較，有關(guān)百合幾丁質(zhì)酶基因生物學(xué)功能的研究鮮有報(bào)道。本課題組前期通過(guò)分析灰霉菌侵染后的百合葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)差異表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因家族成員，分別為Ⅲ類和Ⅴ類成員。對(duì)Ⅴ類成員進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)：接種灰霉菌12和24 h后，該基因在抗病百合中的表達(dá)水平分別為感病百合的8和4倍，推測(cè)其可能參與到百合的抗病反應(yīng)中[28]。鑒于幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步開(kāi)展百合幾丁質(zhì)酶基因家族其他成員的研究，具有潛在的理論與現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究以高抗品種東方百合‘索邦’(L.oriental hybrid ‘Sorbonne’)接種灰霉菌12 h后的葉片為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆到了上述差異表達(dá)的Ⅲ類幾丁質(zhì)酶基因成員，命名為L(zhǎng)oChi2，通過(guò)生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)分析了目標(biāo)基因推導(dǎo)的編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)借助qRT-PCR的方法，對(duì)灰霉菌侵染以及SA/JA處理?xiàng)l件下LoChi2基因在百合中的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，以期為百合幾丁質(zhì)酶基因的抗病功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

本研究選取的植物材料為課題組收集的東方百合‘索邦’、新鐵炮百合‘雷山3號(hào)’以及亞洲百合‘穿梭’，它們分別對(duì)灰霉病的抗性水平為高抗、中感和高感[3]，將其種植于浙江理工大學(xué)人工氣候室中，栽培期間為長(zhǎng)日照條件(光照/黑暗：16 h/8 h)，晝/夜溫為 25 ℃/18 ℃，通風(fēng)良好，定期澆水?；颐咕?B.elliptica, 菌株編號(hào)為ACCC36423)由百合葉片上分離純化獲得，購(gòu)買于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，并將培養(yǎng)基置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，10 d后用于百合葉片的接種試驗(yàn)。

在百合現(xiàn)蕾期，分別選取上述3個(gè)品種健康完整無(wú)病害的葉片進(jìn)行菌塊接種。首先將葉片放入底面鋪有2層濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌打孔器從培養(yǎng)基中切取大小一致的菌塊(菌絲面朝下)接種于葉片背面，對(duì)照接種大小一致、不含灰霉菌的培養(yǎng)基，將接種后的葉片置于塑料托盤(pán)中，噴灑少量無(wú)菌水后使用保鮮膜密封保濕，于25 ℃條件下的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。依據(jù)前期研究結(jié)果[29]，分別于未接種(0 h)，接種6、12、24、48和72 h后收集葉片。為探究LoChi2基因能否對(duì)外源激素做出響應(yīng)，使用0.1 mmol/L SA和0.1 mmol/L JA溶液分別噴灑‘索邦’百合葉片，對(duì)照噴灑無(wú)菌水，采樣時(shí)間同上述灰霉菌處理一致[30]。所有處理在同一時(shí)間點(diǎn)均收集3片葉子，各時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，液氮速凍后將樣品保存在-80 ℃冰箱中以備提取RNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成使用RNA快速提取試劑盒(RN38，艾德萊生物，北京)提取百合葉片中的總RNA，操作流程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。RNA濃度與純度通過(guò)NanoDrop 2000分光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))與1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，檢測(cè)合格的RNA進(jìn)行cDNA合成，操作方法參見(jiàn)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-301，Toyobo，日本)說(shuō)明書(shū)。

1.2.2LoChi2基因編碼序列的克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的LoChi2基因序列，設(shè)計(jì)克隆引物F1/R1(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，包含1 μL cDNA模板、5 μL dNTP(2 mmol/L)、3 μL MgCl2(25 mmol/L)、5 μL PCR 緩沖液(10×)、1 μL高保真PCR酶(1 U/μL)(KOD-401，Toyobo，日本)、32 μL ddH2O以及上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min, 之后98 ℃ 10 s、68 ℃ 1 min進(jìn)行45個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后68 ℃延伸10 min。割膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的cDNA依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)(VT205，天根生化，北京)連接到pLB載體上。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，菌液PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得編碼序列。

1.2.3LoChi2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析基于幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列，采用MEGA6.0最大似然法的方式構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap = 1 000)，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的17條擬南芥幾丁質(zhì)酶序列(本研究將其編號(hào)為AtChi1-AtChi17，表2)為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)百合LoChi2及其同源基因進(jìn)行分類。

表1 引物序列表

表2 擬南芥不同類別幾丁質(zhì)酶信息

1.2.4 LoChi2蛋白的生物信息學(xué)分析利用在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預(yù)測(cè)LoChi2蛋白的理化性質(zhì)。利用SignalP(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/)、NetPhos(http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos/)和NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分別預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽、磷酸化和糖基化位點(diǎn)。利用TMPRED(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和(https://swissmodel. expasy.org/interactive)分別預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用TargetP(http://www.cbs.dtu. dk/services/TargetP-1.1/index.php)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。

1.2.5LoChi2基因的表達(dá)分析以百合真核延伸因子基因EF1(Eukaryotic elongation factor 1, NCBI登錄號(hào)KJ543461)為內(nèi)參，分別設(shè)計(jì)LoEF1和LoChi2的熒光定量引物F2/R2和F3/R3(表1)，以灰霉菌或SA/JA處理后的葉片組織cDNA為模板，參照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa, 寶生生物，大連)說(shuō)明書(shū)，配制qRT-PCR反應(yīng)液，使用CFX Connect Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min, 隨后95 ℃變性10 s、60 ℃(LoChi2)/55.0 ℃(LoEF1)值條件下反應(yīng)30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，之后以每5 s升溫0.5 ℃的速度從65 ℃升至95 ℃，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。每份樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，利用2-ΔΔCt計(jì)算LoChi2基因的相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式表示，在SPSS17.0中通過(guò)單變量方差分析(One-way ANOVA)計(jì)算不同處理與對(duì)照之間基因表達(dá)水平的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LoChi2基因的克隆、氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用RT-PCR的方法，以‘索邦’百合葉片cDNA為模板，獲得了一條清晰的擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期相一致，經(jīng)純化回收、連接轉(zhuǎn)化和測(cè)序，成功得到‘索邦’幾丁質(zhì)酶基因完整的編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為915 bp，編碼304個(gè)氨基酸。將其氨基酸序列提交至NCBI在線Blastn檢索，下載同源性較高的候選序列，使用DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行序列的多重比對(duì)。如圖1所示，‘索邦’幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列與同屬植物麝香百合LlChi2的氨基酸序列同源性最高，其次是菠蘿(Ananascomosus)AcChi2、梅花(Prunusmume)PmChi2和煙草(Nicotianatabacum)NtChi2，序列相似度分別為90%、64%、63%和62%，因此將其命名為‘索邦’LoChi2，NCBI登錄號(hào)為MW310626。通過(guò)分析LoChi2與其同源基因編碼氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)他們無(wú)幾丁質(zhì)酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，無(wú)C-端延伸區(qū)，但具有GH-18家族典型的結(jié)構(gòu)特征：存在1個(gè)GH-18 narbonin催化結(jié)構(gòu)域及8個(gè)糖類物質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。

為進(jìn)一步明確LoChi2在幾丁質(zhì)酶家族中所屬類別，本研究構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，該系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)包含了擬南芥幾丁質(zhì)酶GH-18和GH-19家族共5類(Ⅰ～Ⅴ)成員，依據(jù)擬南芥中的分類情況，百合LoChi2及其同源基因AcChi2和PmChi2與擬南芥GH-18家族第Ⅲ類成員AtChi1、AtChi8和AtChi9親緣關(guān)系較近，聚為一簇，與其他結(jié)構(gòu)類型的幾丁質(zhì)酶關(guān)系較遠(yuǎn)，表明LoChi2屬于GH-18家族Ⅲ類幾丁質(zhì)酶成員。

2.2 LoChi2蛋白結(jié)構(gòu)特征與亞細(xì)胞定位分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析表明LoChi2蛋白的分子量為32.52 kD，原子組成為C1480H2204N358O461S4，理論等電點(diǎn)為4.16，不穩(wěn)定系數(shù)為27.43，平均親水性為0.10，預(yù)測(cè)LoChi2是一個(gè)穩(wěn)定的疏水蛋白。功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LoChi2存在1個(gè)潛在的信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)，1個(gè)糖基化位點(diǎn)以及多個(gè)磷酸化位點(diǎn)?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示LoChi2蛋白共有10個(gè)跨膜區(qū)域，其中有7個(gè)由內(nèi)到外的蛋白跨膜區(qū)域和3個(gè)由外到內(nèi)的跨膜區(qū)域，推斷LoChi2屬于跨膜蛋白(圖3，A)。另外，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明LoChi2含有38.82%的α-螺旋，18.09%的β-折疊，17.76%的延伸鏈，36.84%的不規(guī)則卷曲；進(jìn)一步分析其三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)LoChi2的立體結(jié)構(gòu)外形類似橢圓狀(圖3，B)，與目標(biāo)模板(SMTL ID: 4rl3.1)結(jié)構(gòu)的相似度為60.53%，主要結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋和不規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。同時(shí)對(duì)LoChi2進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示該蛋白作為分泌蛋白分泌于細(xì)胞外的可能性最大，概率高達(dá)99%，推測(cè)LoChi2可能定位于細(xì)胞外。

圖2 百合與其他植物幾丁質(zhì)酶基因編碼氨基酸 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of chitinase genes from lily and other plants

圖3 LoChi2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)(A)及其三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)的預(yù)測(cè)Fig.3 Transmembrane (A) and tertiary structure (B) predictions of LoChi2 protein

2.3 不同抗性百合接種灰霉菌后LoChi2基因的表達(dá)分析

為比較不同抗性百合‘索邦’、‘雷山3號(hào)’和‘穿梭’中LoChi2基因在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)灰霉菌侵染的差異，本研究對(duì)這3種百合進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果表明：接種灰霉菌后，LoChi2基因在3種百合中均能被誘導(dǎo)，表達(dá)量各有不同程度的增加(圖4)。在高感百合品種‘穿梭’中，接種6 h后LoChi2的表達(dá)量微微上調(diào)，24 h后達(dá)到峰值，表達(dá)量與對(duì)照相比增加了2.6倍，在這之后表達(dá)量顯著降低，差不多降至初始水平。而在中感和高抗百合中，表達(dá)量在接種6 h后顯著增加，并在之后維持著較高的水平。其中，中感百合‘雷山3號(hào)’在整個(gè)接種期呈現(xiàn)先增加后降低的表達(dá)趨勢(shì)，接種48 h后表達(dá)量最大，約為對(duì)照的15倍；高抗百合‘索邦’在整個(gè)接種期內(nèi)表達(dá)量較為多變，呈現(xiàn)先增加后降低，再增加又降低的折線變化趨勢(shì)，于接種12 和48 h后出現(xiàn)峰值，分別為對(duì)照的25 和23倍。整體來(lái)看，接種灰霉菌12、24、48和72 h后，‘索邦’中LoChi2基因表達(dá)量的增加幅度要明顯高于‘雷山3號(hào)’和‘穿梭’，分別為‘雷山3號(hào)’的4.5、1.3、1.5和1.5倍，‘穿梭’的25.0、3.7、20.9和10.3倍。

2.4 SA/JA處理?xiàng)l件下LoChi2基因在百合中的表達(dá)分析

許多幾丁質(zhì)酶家族成員通過(guò)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與植物抗病反應(yīng)，因此進(jìn)一步分析了LoChi2基因?qū)ν庠醇に豃A和SA的響應(yīng)情況。結(jié)果表明：LoChi2基因在SA和JA分別處理后的‘索邦’葉片中均有不同程度的上調(diào)表達(dá)(圖5)。JA處理6 h后，LoChi2的表達(dá)量顯著增加，在12 h處微微下調(diào)，之后又迅速增加，48 h達(dá)到峰值，約為對(duì)照的7.9倍。相比而言，LoChi2對(duì)SA的響應(yīng)要遲緩，SA處理6 和12 h后，LoChi2的表達(dá)量變化較小，直至24 h后開(kāi)始明顯增加，78 h表達(dá)量增至最高，約為對(duì)照的8.1倍。

星號(hào)代表處理與對(duì)照之間基因表達(dá)水平存在顯著性差異 (*. 0.01 < P < 0.05, **. P < 0.01)。下同圖4 不同抗性百合接種灰霉菌后葉片中 LoChi2基因的表達(dá)分析Asterisks indicate significant differences of gene expression levels between treatments and CK (*. 0.01 < P < 0.05, **. P < 0.01). The same as belowFig.4 Expression analysis of LoChi2 gene observed from lily leaves with different levels of resistance after inoculation with B. elliptica.

圖5 JA/SA處理下LoChi2基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of LoChi2 gene in response to JA/SA treatments

3 討 論

植物受病原菌侵染后，誘導(dǎo)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶蛋白能夠直接與病原體的侵染結(jié)構(gòu)接觸，抑制、干擾病菌的生長(zhǎng)進(jìn)程，激發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，發(fā)揮廣譜抗病作用。植物中不同類型的幾丁質(zhì)酶在結(jié)構(gòu)上存在較大差異，Ⅰ類幾丁質(zhì)酶成員在N末端存在幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端催化結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中間包含一段鏈接區(qū)域。Ⅱ類成員的催化域同Ⅰ類具有較高同源性，但缺乏幾丁質(zhì)結(jié)合域和鏈接區(qū)域。Ⅲ類和Ⅴ類成員與其他類成員序列相似度較低，但均具有GH18 narbonin催化結(jié)構(gòu)域。Ⅳ類與Ⅰ類較為相似，但幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度均小于Ⅰ類[6]。本研究從東方百合‘索邦’中分離到了1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因LoChi2(MW310626)完整的編碼區(qū)序列，大小為915bp，編碼304個(gè)氨基酸殘基。蛋白保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)LoChi2屬于GH-18家族的Ⅲ類幾丁質(zhì)酶成員，存在保守的GH18 narbonin催化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及信號(hào)肽、糖基化、磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)為疏水的分泌蛋白，且定位于細(xì)胞外。這一結(jié)果與楊郁文等[31]研究類似，他們發(fā)現(xiàn)棉花(Gossypiumhirsutum)Ⅲ類幾丁質(zhì)酶成員也為分泌蛋白，且具有信號(hào)肽位點(diǎn)，定位于細(xì)胞外。周潔等[32]在柳樹(shù)(SalixJiangsuensis2345)中獲得了1個(gè)Ⅲ類幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)cDNA 序列，該序列編碼的蛋白為疏水蛋白，具有GH-18家族特征性催化結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步證明了不同植物中Ⅲ類幾丁質(zhì)酶的保守性。此外，朱晨等[20]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)Ⅰ類幾丁質(zhì)酶成員也具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，由此推測(cè)不同類型幾丁質(zhì)酶成員在蛋白翻譯中可能發(fā)生過(guò)多次磷酸化修飾。

病原菌侵染后，多數(shù)情況下抗病品種中幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量要高于感病品種。例如，Ebrahim等[33]發(fā)現(xiàn)接種鐮刀菌后，抗病芒果(Mangiferaindica)品種中幾丁質(zhì)酶活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感病品種，因此認(rèn)為幾丁質(zhì)酶活性可作為篩選抗病和感病品種的標(biāo)記，在抗病和感病荔枝(Litchichinensis)品種中也存在同樣的現(xiàn)象[34]?；虮磉_(dá)方面，Vasanthaiah等[35]發(fā)現(xiàn)，葡萄幾丁質(zhì)酶基因在抗病品種中的高效表達(dá)是其產(chǎn)生高抗性，抵御炭疽病的重要原因之一。同樣，棉花[31]和甘蔗[36](Saccharumofficinarum)幾丁質(zhì)酶基因在抗性品種中表達(dá)水平也要高于感病品種。本研究發(fā)現(xiàn)，在高抗品種‘索邦’和中感品種‘雷山3號(hào)’葉片接種灰霉菌6、12、24、48和72 h后，LoChi2基因的相對(duì)表達(dá)量大幅度增加，且‘索邦’明顯高于‘雷山3號(hào)’，而高感品種‘穿梭’僅在接種6、24和72 h處有明顯增加，增加幅度較為平穩(wěn)。百合中LoChi2基因的轉(zhuǎn)錄水平與品種間抗病性呈現(xiàn)出正相關(guān)，說(shuō)明LoChi2是參與灰霉菌防御反應(yīng)的關(guān)鍵抗病基因。

幾丁質(zhì)酶的表達(dá)受抗病相關(guān)激素JA和SA的調(diào)節(jié)，異源表達(dá)某些幾丁質(zhì)酶基因會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物激素信號(hào)通路的改變，從而影響其對(duì)病原菌的抵御能力。前人通過(guò)對(duì)馬鈴薯噴施JA和SA發(fā)現(xiàn)有3個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量在處理24 h以內(nèi)顯著增加[14]，外源噴施SA和JA還可誘導(dǎo)茶樹(shù)[37]、花生[38]和小麥[39](Triticumaestivum)中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)植株抵御病蟲(chóng)害的能力。在擬南芥中過(guò)表達(dá)草莓幾丁質(zhì)酶基因Chit2可通過(guò)激活SA通路關(guān)鍵防御基因PR1(Pathogenesis-related protein 1)以及JA通路關(guān)鍵基因PDF1.2(Plant defensin 1.2)的表達(dá)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)炭疽病的抗性[40]。本研究中，LoChi2基因表達(dá)量在JA和SA處理后的‘索邦’百合葉片中均有不同程度的增加，暗示了該基因可能在這兩條抗病信號(hào)通路中扮演著重要角色。

灰霉菌與植物的互作非常復(fù)雜，它是很多基因相互作用的過(guò)程[28]，幾丁質(zhì)酶作為一類重要的病程相關(guān)蛋白，在植物抗灰霉病轉(zhuǎn)基因育種中具有潛在的優(yōu)勢(shì)。郭林霞等[23]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)杜仲(Eucommiaulmoides)幾丁質(zhì)酶基因EuChit1番茄提高對(duì)灰霉病的抗性，與抗氧化酶SOD、POD和CAT活性提高以及病程相關(guān)基因PR1、PR2和PR5表達(dá)量上調(diào)密切相關(guān)。Núez deGonzlez等[41]將水稻幾丁質(zhì)酶基因RCH10成功轉(zhuǎn)入了百合品種‘Star gazer’中，對(duì)9個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的葉片接種灰霉菌后測(cè)定孢子數(shù)量，發(fā)現(xiàn)所有株系均極顯著低于野生型，各株系對(duì)灰霉病的抗性水平與RCH10基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，并且在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段植株的表型性狀，包括株高、莖粗、葉片和種球大小以及花色、花量和花期并未發(fā)生明顯改變。類似研究在矮牽牛中也獲得了成功，轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的矮牽牛對(duì)灰霉病抗性顯著強(qiáng)于野生型, 且葉片中蛋白提取液能夠有效抑制灰霉菌菌絲生長(zhǎng)[22]。由此推測(cè)LoChi2基因在百合抗灰霉病育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，高抗百合品種‘索邦’中的幾丁質(zhì)酶基因LoChi2具有植物GH-18家族Ⅲ類成員典型的結(jié)構(gòu)特征?；颐咕秩竞螅琇oChi2在抗病百合品種中的表達(dá)量顯著高于感病品種，且受外源激素JA/SA誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)LoChi2是參與百合灰霉病防御反應(yīng)的關(guān)鍵抗病基因，隨著百合基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，LoChi2將成為百合抗灰霉病轉(zhuǎn)基因育種中新的候選基因。