黃 蕾，邢曉成，張雨曲，任 毅

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西安 710119)

生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性三個(gè)層次，是指全部陸地或水域中生物所擁有的基因、細(xì)胞、物種乃至多個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的總稱(chēng)。其中，遺傳多樣性是生物多樣性研究的核心和基礎(chǔ)，廣義是指地球上所有的生物所攜帶的全部遺傳信息的總和；狹義的遺傳多樣性則是指種內(nèi)不同居群間以及居群內(nèi)的遺傳變異，即種內(nèi)基因的變化[1-3]。一般認(rèn)為，影響物種水平上的遺傳多樣性因素可能包括該物種的進(jìn)化歷史、分布范圍、繁育系統(tǒng)等，通常認(rèn)為分布地域廣、基因流較強(qiáng)、種子較多的物種其遺傳多樣性較高，一個(gè)物種包含的等位基因越豐富，說(shuō)明它對(duì)環(huán)境適應(yīng)性就越強(qiáng)，進(jìn)化潛力也越大[4]。

影響植物居群遺傳多樣性的內(nèi)部因素包括物種的繁育系統(tǒng)(生殖方式), 遺傳漂變, 自然選擇, 基因突變[5]和基因流[6], 同時(shí)還包括由于環(huán)境變化和人為干擾引起的種群隔離和生境片斷化[7]等外部因素。內(nèi)部因素可直接作用于基因組, 引起等位基因數(shù)目與頻率的變化, 外部因素不會(huì)直接改變基因 (等位基因) 的數(shù)目與頻率, 一般通過(guò)間接方式使植物居群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[8-9]。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的蓬勃發(fā)展，探討不同環(huán)境因子對(duì)植物遺傳多樣性的影響成為領(lǐng)域熱點(diǎn)。環(huán)境因子一般分為生物因子和非生物因子[10]，非生物因子中溫度、降水、緯度、海拔等地理因素成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)[11]。值得關(guān)注的是不同植物類(lèi)群中，同一地理因素與遺傳多樣性可能呈現(xiàn)出截然相反的關(guān)聯(lián)性。徐振朋等[12]利用15對(duì)ISSR分子標(biāo)記對(duì)石竹科裸果木屬12個(gè)天然居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)海拔和緯度與遺傳多樣性呈顯著的正相關(guān)。蘇前[13]基于100個(gè)RAPD分子標(biāo)記對(duì)夾竹桃科羅布麻屬6個(gè)天然居群的研究發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與緯度呈顯著正相關(guān)，而與海拔呈顯著的負(fù)相關(guān)。因此，為了更好地理解和闡釋“地理因素如何影響植物居群的遺傳多樣性”這一重要問(wèn)題，需來(lái)自更多植物類(lèi)群的研究實(shí)例。

箭竹屬隸屬于禾本科竹亞科 (Poaceae,Bambusoideae) 北美箭竹族 (tribe arundinariinae) 或木本竹類(lèi)溫帶分支, 是竹亞科中的大屬之一, 包括80～100種。該屬?gòu)V泛分布于中國(guó)西南至喜馬拉雅東部的山地, 是大熊貓等珍稀動(dòng)物的主要食物, 在當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[14]。箭竹屬的分類(lèi)地位和屬的范圍一直存在爭(zhēng)議, 易同培[15-16]曾經(jīng)依據(jù)營(yíng)養(yǎng)器官性狀將箭竹屬分為2組6系。然而，與繁育器官相比, 營(yíng)養(yǎng)器官容易受環(huán)境影響而發(fā)生變化, 同時(shí)營(yíng)養(yǎng)器官普遍存在趨同演化或平行演化現(xiàn)象?；谝延醒芯堪l(fā)現(xiàn)，箭竹屬內(nèi)有15個(gè)近緣種——箭竹(FargesiaspathaceaFranch.)、矮箭竹(FargesiademissaYi)、毛龍頭竹(FargesiadecurvataJ. L. Lu)、拐棍竹(FargesiarobustaYi)、青川箭竹(FargesiarufaYi)、糙花箭竹(FargesiascabridaYi)、缺苞箭竹(FargesiadenudataYi)、華西箭竹[Fargesianitida(Mitford) Keng f. ex Yi)、秦嶺箭竹(FargesiaqinlingensisYi et J.X. Shao)、團(tuán)竹(FargesiaobliquaYi)、伏牛山箭竹(F.funiushanensisYi)、神農(nóng)箭竹[Fargesiamurielae(Gamble) Yi]、窩竹(Faregsiabrevissima)、細(xì)枝箭竹(Fargesiastenoclada)和甜箭竹(Fargesiaostrina)[17]，以上物種之間的形態(tài)學(xué)差異不顯著，部分性狀存在連續(xù)變異，且在已有的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上位于同一分支[18-19]，而箭竹是其中最早命名的物種[20]，因此本研究將其稱(chēng)為箭竹復(fù)合體(Fargesiaspathaceacomplex)。本研究的前期工作篩選了箭竹復(fù)合體的39個(gè)天然居群共750個(gè)個(gè)體，利用14個(gè)SSR(微衛(wèi)星 Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記，詳細(xì)探討了該復(fù)合體內(nèi)的遺傳變異式樣，并認(rèn)為其中3個(gè)種是成立的，而有4個(gè)種顯然不成立。同時(shí)結(jié)合3種居群遺傳結(jié)構(gòu)分析方法，將箭竹物種復(fù)合體的39個(gè)居群分為2個(gè)支系(A支系、B支系)，其中A支系內(nèi)部可再劃分出華西箭竹亞支系和團(tuán)竹亞支系，B支系內(nèi)部可再劃分出拐棍竹亞支系、窩竹亞支系、箭竹亞支系和糙花箭竹亞支系，即全部樣本分為6個(gè)亞支系。另一方面，還發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體內(nèi)的整體遺傳多樣性水平并不低，改變了“竹子以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主，遺傳多樣性水平較低”的傳統(tǒng)觀(guān)念[21]。但是需要指出的是，該研究集中在梳理箭竹復(fù)合體內(nèi)部的遺傳結(jié)構(gòu)和居群變異式樣，并未詳細(xì)探討環(huán)境因素，尤其是海拔和緯度對(duì)整個(gè)復(fù)合體內(nèi)不同支系、亞支系的遺傳多樣性水平的影響?；诩駨?fù)合體現(xiàn)有的750個(gè)個(gè)體大量的遺傳變異信息，以及該類(lèi)群對(duì)大熊貓保護(hù)領(lǐng)域的重要意義，本研究認(rèn)為該復(fù)合體是深入探討“地理因素如何影響植物居群的遺傳多樣性”這一問(wèn)題的理想材料。

另一方面，遺傳多樣性可為人們估算植物居群的遺傳分化提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。遺傳多樣性的計(jì)算是基于遺傳變異信息，這些遺傳變異在居群之間的不均衡分布表現(xiàn)為遺傳分化，而遺傳分化同樣受到地理因素的重要影響[8-9]。因此，本研究在深入分析前期研究工作的箭竹復(fù)合體SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)時(shí)，同時(shí)關(guān)注地理距離與箭竹復(fù)合體內(nèi)的遺傳分化水平是否表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。根據(jù)前期野外觀(guān)察，箭竹復(fù)合體內(nèi)同一支系內(nèi)的不同類(lèi)群存在海拔差異，這些類(lèi)群可能發(fā)生了對(duì)高海拔區(qū)域的適應(yīng)性分化，目前并不清楚地理距離是否影響了復(fù)合體內(nèi)的適應(yīng)性分化。綜上所述，本研究探討箭竹復(fù)合體的遺傳多樣性及其與地理因素的關(guān)系，旨在揭示箭竹復(fù)合體遺傳多樣性對(duì)地理變化的響應(yīng)，為后續(xù)深入研究竹類(lèi)植物對(duì)高山環(huán)境的適應(yīng)性分化奠定基礎(chǔ)，并為箭竹復(fù)合體內(nèi)遺傳多樣性保護(hù)和大熊貓主食竹相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。

1 材料和方法

1.1 微衛(wèi)星(SSR)引物篩選

本研究的測(cè)序樣品選擇箭竹物種復(fù)合體的4個(gè)竹種：缺苞箭竹(甘肅省文縣)、毛龍頭竹(陜西省太白縣)、細(xì)枝箭竹(四川省彭州縣)和伏牛山箭竹(河南省欒川縣)，用其新鮮葉片，干冰保存送至上海天昊遺傳分析中心，利用 Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行配對(duì)末端(paire-end)測(cè)序。根據(jù)返回的高通量測(cè)序信息，在設(shè)定文庫(kù)片段大小時(shí)，在主峰基礎(chǔ)上±50 bp設(shè)定其最大與最小片段范圍，其中毛龍頭竹(310～410 bp)、缺苞箭竹(280～380 bp)、細(xì)枝箭竹(280～380 bp)和伏牛山箭竹(280～380 bp)，以雙末端方式導(dǎo)入CLC Genomics Workbench 7.5(QIAGEN, Germantown, MD, Germany) 軟件中，先去除質(zhì)量較低的序列，再用從頭組裝的策略對(duì)上一步得到的結(jié)果進(jìn)行組裝，所得結(jié)果以*.fasta文件格式輸出。本研究所篩選14對(duì)SSR引物的詳細(xì)信息，參照黃蕾等文章中相應(yīng)表格[18]。

1.2 箭竹復(fù)合體樣本采集

參考《中國(guó)植物志》[14]和《中國(guó)竹類(lèi)圖志》[22]，整理箭竹物種復(fù)合體中15個(gè)竹種的詳細(xì)地點(diǎn)，并歷時(shí)3年對(duì)其進(jìn)行樣品采集。采集地點(diǎn)包括四川、陜西、貴州、湖北、河南、甘肅、寧夏等省份。樣品采集按照每個(gè)居群20～30份DNA材料(由于箭竹物種復(fù)合體竹種地下莖屬于合軸叢生，地上同一叢不同稈株來(lái)自同一個(gè)體，因此在樣品采集時(shí)，選擇個(gè)體間間隔15 m以上)，總共采集39個(gè)居群，包括箭竹(2個(gè)居群)、矮箭竹(3個(gè)居群)、毛龍頭竹(7個(gè)居群)、拐棍竹(4個(gè)居群)、青川箭竹(2個(gè)居群)、糙花箭竹(2個(gè)居群)、缺苞箭竹(3個(gè)居群)、華西箭竹(3個(gè)居群)、秦嶺箭竹(4個(gè)居群)、團(tuán)竹(1個(gè)居群)、伏牛山箭竹(1個(gè)居群)、神農(nóng)箭竹(4個(gè)居群)、窩竹(1個(gè)居群)、細(xì)枝箭竹(1個(gè)居群)和甜箭竹(1個(gè)居群)。每個(gè)居群挑選15～20個(gè)個(gè)體，共計(jì)750個(gè)個(gè)體進(jìn)行SSR片段的擴(kuò)增和測(cè)序，詳細(xì)信息請(qǐng)見(jiàn)黃蕾等文章中相應(yīng)表格[21]。

1.3 總DNA提取與PCR擴(kuò)增

利用改良的CTAB[23-24]法提取竹類(lèi)植物的總DNA, 步驟為: 1)取1.5 g的干燥葉片手工研磨至粉末狀，再將粉末狀顆粒轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入800 μL DNA緩沖液Ⅰ，0 ℃保存30 min； 2)離心管放入4 ℃恒溫離心機(jī)，4 000 r/min恒溫離心10 min，棄上清； 3)將離心管取出，加入800 μL已預(yù)熱的DNA緩沖液Ⅱ(65 ℃)，并在65 ℃水浴鍋中水浴1 h，間隔15 min輕微搖晃使顆粒與液體充分接觸； 4)取出離心管放置于4 ℃恒溫離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min； 吸取上清液至2 mL離心管中，加800 μL的氯仿/異戊醇(體積比24∶1)與80 μL DNA緩沖液Ⅱ，顛倒混合10 min； 5) 4 ℃恒溫離心機(jī)中常溫10 000 r/min離心10 min，取上清液至2 mL離心管中，加入700 μL的氯仿/異戊醇(24∶1)與70 μL DNA緩沖液Ⅱ，顛倒混合10 min； 6)常溫10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積無(wú)水乙醇在-20 ℃冰箱放置1 h；10 000 r/min離心12 min，加入400 μL ddH2O，完全溶解； 7)加入500 μL冰乙醇在-20 ℃放置1 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，干燥過(guò)夜； 8)加入200 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增首輪反應(yīng)——10 μL的反應(yīng)體系，包括酶 2×Es Taq MasterMix 5 μL，ddH2O 4 μL，正反向引物各 0.25 μL，DNA模板0.5 μL。反應(yīng)程序采用梯度 PCR(TD-PCR)程序：94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s，62～0.5 ℃, 20 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán); 94 ℃ 30 s, 57 ℃ 20 s，23～24 循環(huán), 72 ℃ 30 s; 72 ℃ 10 min; 25 ℃。第二輪反應(yīng)——10 μL反應(yīng)體系，包括酶 2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 8 μL，熒光引物正反向各0.5 μL，DNA模板(首輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍)1 μL。反應(yīng)程序： 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 62～0.5 ℃30 s, 72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán); 94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 23～24 循環(huán); 72 ℃ 10 min, 25 ℃。兩輪反應(yīng)中，不同的引物采用不同的熒光進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至江蘇金唯智生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，使用ABI3730XL測(cè)序儀完成熒光檢測(cè)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物的峰型圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

SSR原始數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總整理后，輸入CONVERT 1.3[25]軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，用于后續(xù)軟件分析。使用POPGENE 1.32軟件[26]進(jìn)行遺傳多樣性——平均等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)比率(PPL)、期望雜合度(He)、觀(guān)測(cè)雜合度(Ho)的計(jì)算。本研究所用的線(xiàn)性回歸分析采用R軟件包進(jìn)行計(jì)算并繪圖[27]。在遺傳分化指標(biāo)上，利用GenAlEx 6.502軟件進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)[28]，通過(guò)1 000次迭代運(yùn)行計(jì)算地理距離與遺傳距離的相關(guān)性。本研究采用的地理距離是基于居群經(jīng)緯度所得的歐式距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 海拔和緯度對(duì)箭竹復(fù)合體遺傳多樣性的影響

基于750個(gè)個(gè)體和14對(duì)SSR引物的遺傳結(jié)構(gòu)分析，39個(gè)居群可分為A, B兩個(gè)支系，A支系可進(jìn)一步分為2個(gè)亞支系，B支系可分為4個(gè)亞支系[21]。首先對(duì)A, B兩個(gè)支系的遺傳多樣性參數(shù)——平均等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)比率(PPL)、期望雜合度(He)、觀(guān)測(cè)雜合度(Ho)進(jìn)行計(jì)算，A支系遺傳多樣性參數(shù)的結(jié)果為Na=2.93,Ne=1.85,I=0.64,Ho= 0.47,He=0.37,PPL=0.81，B支系為Na=3.05,Ne=1.91,I=0.66,Ho=0.45,He=0.37,PPL=0.86。由圖1可見(jiàn)，B支系的遺傳多樣性略高于A支系。

對(duì)6個(gè)亞支系的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算(圖2)，華西箭竹亞支系內(nèi)13個(gè)居群Na=6.21,Ne=2.05,I=0.84,Ho=0.50,He=0.44,PPL=0.819；團(tuán)竹亞支系內(nèi)4個(gè)居群Na=4.14,Ne=1.69，I=0.61,Ho=0.37,He=0.33,PPL=0.732；拐棍竹亞支系內(nèi)4個(gè)居群Na=4.57,Ne=1.84,I=0.73,Ho=0.40,He=0.38,PPL=0.857；窩竹亞支系內(nèi)9個(gè)居群Na=5.43,Ne=2.09,I=0.80,Ho=0.43,He=0.41,PPL=0.821；箭竹亞支系內(nèi)4個(gè)居群Na=4.50,Ne=2.08,I=0.76,Ho=0.47,He=0.39,PPL=0.875；糙花箭竹亞支系內(nèi)5個(gè)居群Na=5.50,Ne=2.38,I=1.00,Ho=0.51,He=0.50,PPL=0.929。6個(gè)亞支系遺傳多樣性由高到低的順序?yàn)椋翰诨駚喼?華西箭竹亞支系>窩竹亞支系>箭竹亞支系>拐棍竹亞支系>團(tuán)竹亞支系。在遺傳多樣性指標(biāo)上，擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)比率PPL在不同亞支系之間變化最??；平均等位基因數(shù)Na的變化最大。

圖1 箭竹復(fù)合體A、B兩支系內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)對(duì)比Fig.1 The genetic diversity of A and B clades in Fargesia spathacea complex

圖2 箭竹復(fù)合體6個(gè)亞支系組內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)對(duì)比圖Fig.2 The genetic diversity of six sub-clades in F. spathacea complex

為檢測(cè)箭竹物種復(fù)合體A支系和B支系的遺傳多樣性與海拔、緯度是否具有顯著相關(guān)性，將兩組各自的遺傳多樣性指標(biāo)He與海拔和緯度分別進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果如圖3所示。A支系的遺傳多樣性與緯度、海拔均具有顯著相關(guān)(圖3, A支系:R2=0. 5635,r=0.751,P<0.01;R2=0.0151,r=0.123,P<0.01)，B支系也可得出同樣結(jié)論(圖3, B支系:R2=0.0700,r=0.264,P<0.01;R2=0.1302,r=0.360,P<0.01)。這表明隨著緯度和海拔的增加A支系和B支系的遺傳多樣性也隨之增大。

為檢測(cè)箭竹物種復(fù)合體6個(gè)亞支系的遺傳多樣性與海拔、緯度是否具有顯著相關(guān)性，將每個(gè)亞支系的遺傳多樣性指標(biāo)He與海拔和緯度分別進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。拐棍竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.3772,r=0.615,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=0.1948,r=-0.442,P<0.01。窩竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.0002,r=0.014,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=0.6353,r=0.797,P<0.01。箭竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.7542,r=-0.868,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=0.3406,r=0.584,P<0.01。糙花箭竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.2314,r=0.481,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=9E-06,r=0.003,P<0.01。華西箭竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.0935,r=0.306,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=0.1945,r=-0.441,P<0.01。團(tuán)竹亞支系He與緯度的相關(guān)性R2=0.6121,r=0.782,P<0.01;He與海拔的相關(guān)性R2=0.0442,r=0.210,P=0.02。由此可見(jiàn)，盡管6個(gè)亞支系的遺傳多樣性和緯度、海拔呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，但表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，部分支系表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。

2.2 地理距離對(duì)箭竹復(fù)合體遺傳分化式樣的影響

利用GenAlEx 6.41在箭竹物種復(fù)合體水平和A、B支系水平分別進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)(圖4)。在箭竹復(fù)合體水平上，全部39個(gè)居群的遺傳距離和地理距離未表現(xiàn)出顯著的線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.0032,r=0.057,P=0.11)A支系的檢測(cè)結(jié)果表明遺傳距離和地理距離存在顯著相關(guān)性(R2=0.0613,r=0.25,P=0.01)，B支系的檢測(cè)結(jié)果表明遺傳距離和地理距離不存在顯著相關(guān)性(R2=0.0036,r=0.06,P=0.21)。

圖3 箭竹復(fù)合體A、B兩支系遺傳多樣性水平與緯度、海拔的回歸分析圖Fig.3 The regression analysis of genetic diversity and latitude, altitude within A and B clade in F. spathacea complex

Ⅰ. 箭竹復(fù)合體； Ⅱ. A支系； Ⅲ. B支系圖4 不同劃分組下遺傳距離和地理距離 之間的Mantel 檢驗(yàn)Ⅰ. Fargesia spathacea complex; Ⅱ. A clade; Ⅲ. B cladeFig.4 The Mantel test of genetic distance and geographic distance under different groups

在6個(gè)亞支系水平上， Mantel 檢驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示。 拐棍竹亞支系(a)檢測(cè)結(jié)果不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.3944,r=0.63,P=0.15；糙花箭竹亞支系(b)檢測(cè)結(jié)果不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.1153,r=0.34,P=0.15；窩竹亞支系(c)檢測(cè)結(jié)果不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.0558,r=0.24,P=0.10；箭竹亞支系(d)檢測(cè)結(jié)果不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.0223,r=0.15,P=0.58；華西箭竹亞支系(e)檢測(cè)結(jié)果不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.011,r=0.11,P=0.40；團(tuán)竹亞支系(f)檢測(cè)結(jié)果顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.3571,r=0.60,P=0.02。由此可見(jiàn)，B支系內(nèi)4個(gè)亞支系均未表現(xiàn)出遺傳距離和地理距離之間的顯著相關(guān)性，這一結(jié)果與前述結(jié)果一致；A支系內(nèi)2個(gè)亞支系僅團(tuán)竹亞支系的遺傳距離和地理距離存在較弱的顯著相關(guān)性。

3 討 論

影響植物居群遺傳多樣性的因素包括物種的生殖方式、遺傳漂變、自然選擇、突變率、基因流，以及種群隔離和生境片斷化。另一方面，樣本大小和分子標(biāo)記數(shù)量也能對(duì)遺傳多樣性的估算產(chǎn)生一定影響[29-30]。在本研究中，華西箭竹亞支系的居群數(shù)目最多，但其遺傳多樣性并非最高。由此可見(jiàn)，在亞支系水平，樣本大小對(duì)估算箭竹復(fù)合體遺傳多樣性的影響較小。這表明，箭竹復(fù)合體的不同類(lèi)群在適應(yīng)不同生境時(shí)，遺傳多樣性水平可能會(huì)受到其他生態(tài)因子或進(jìn)化因素的影響。其次，在地理因素與遺傳多樣性的相關(guān)性上，不同物種的研究結(jié)果并不一致[9-10]。在本研究中，地理因素與遺傳多樣性的相關(guān)性在不同進(jìn)化尺度上并不相同。在A、B支系水平上檢測(cè)出顯著相關(guān)性，可能是掩蓋亞支系之間的遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果，并不能反映真實(shí)情形。因此建議，開(kāi)展類(lèi)似研究工作時(shí)應(yīng)充分考慮遺傳結(jié)構(gòu)的影響，先厘清樣本內(nèi)部的遺傳分化，再開(kāi)展多因素與遺傳多樣性的相關(guān)性檢測(cè)。

在地理距離與遺傳距離的相關(guān)性上，A支系內(nèi)包含華西箭竹亞支系和團(tuán)竹亞支系，本研究結(jié)果表明地理隔離在一定程度上影響了其現(xiàn)有分布格局；而B(niǎo)支系內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，其分布格局可能受其他因素比如自然選擇、基因流、遺傳漂變等影響。據(jù)此推測(cè)，地理距離并非是影響箭竹復(fù)合體內(nèi)遺傳分化的主導(dǎo)因素。依據(jù)本研究前期的發(fā)現(xiàn)，B支系下的糙花箭竹和窩竹亞支系內(nèi)的部分個(gè)體檢測(cè)到明顯的雜交跡象，這也為B支系Mantel檢驗(yàn)結(jié)果不顯著提供了合理解釋[21]。后續(xù)需加強(qiáng)基因流和雜交事件的檢測(cè)，以明確不同亞支系之間的基因流是否參與了現(xiàn)有遺傳分化格局的建立。

本研究通過(guò)對(duì)箭竹復(fù)合體內(nèi)39個(gè)居群的14對(duì)SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)糙花箭竹亞支系具有最高的遺傳多樣性，而團(tuán)竹亞支系的遺傳多樣性最低。盡管在A、B兩個(gè)支系水平，遺傳多樣性和緯度、海拔呈現(xiàn)了顯著正相關(guān)，但在更精細(xì)的亞支系水平，遺傳多樣性的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出更為復(fù)雜的局面，部分支系表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)，箭竹復(fù)合體的不同類(lèi)群在適應(yīng)不同生境時(shí)，遺傳多樣性可能會(huì)受到其他生態(tài)因子或進(jìn)化因素的影響。另一方面，通過(guò)Mantel檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)地理距離并非是影響箭竹復(fù)合體內(nèi)遺傳分化的主導(dǎo)因素。B支系內(nèi)的4個(gè)亞支系，均未表現(xiàn)出遺傳距離和地理距離之間的顯著相關(guān)性；A支系中僅團(tuán)竹亞支系的遺傳距離和地理距離存在較弱的顯著相關(guān)性，這表明自然選擇、基因流、遺傳漂變等因素可能影響了該復(fù)合體內(nèi)的遺傳分化。已有結(jié)果表明該復(fù)合體內(nèi)部分居群之間可能存在基因流，后續(xù)需結(jié)合基因流檢測(cè)推斷雜交事件對(duì)其遺傳分化的影響。鑒于箭竹復(fù)合體內(nèi)不同類(lèi)群之間存在海拔分化，本研究的結(jié)果可為后續(xù)深入研究竹類(lèi)植物的適應(yīng)性分化奠定基礎(chǔ)，亦可為大熊貓主食竹的相關(guān)研究提供重要的參考信息。

Ⅰ. 拐棍竹亞支系; Ⅱ.糙花箭竹亞支系; Ⅲ.窩竹亞支系; Ⅳ.箭竹亞支系; Ⅴ.華西箭竹亞支系; Ⅵ.團(tuán)竹亞支系圖5 6個(gè)亞支系下遺傳距離和地理距離之間的Mantel 檢驗(yàn)Ⅰ. F. robusta sub-clade; Ⅱ. F. scabrida sub-clade; Ⅲ. F. brevissima sub-clade; Ⅳ. F. spathacea sub-clade; Ⅴ. F. nitida sub-clade; Ⅵ. F. obliqua sub-cladeFig.5 The Mantel test of genetic distance and geographic distance within six sub-clades

作者貢獻(xiàn)：邢曉成和張雨曲采集了全部樣本；邢曉成完成了SSR數(shù)據(jù)的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析；任毅教授設(shè)計(jì)了研究方案；邢曉成和黃蕾完成文章撰寫(xiě)。