劉聲傳，魏 杰，林開勤，陳智雄，徐 霖，鄢東海*

(1 貴陽學院 生物與環(huán)境工程學院，貴陽 550005；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，貴陽 550006)

葉色突變的黃化茶樹(Camelliasinensis)具有新梢色澤特異、高氨基酸等特征，且制成的綠茶品質(zhì)好[1]。高等植物(除了石竹目植物)葉片中的色素主要分為葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3大類[2]。葉綠素、類胡蘿卜素屬于光合色素，存在于葉綠體中，花青素屬于多酚類物質(zhì)，均勻分布于液泡中。葉片細胞內(nèi)3大類色素的含量、比例、分布決定葉片顏色，調(diào)控葉片光合作用[3-4]。天線色素類胡蘿卜素能將吸收的光能傳遞給葉綠素a，具有光保護和清除自由基的作用[5]。不少研究表明，花青素能過濾可見光和紫外線，減輕葉片中光氧化損傷[6-7]。高含量花青素是紫化茶樹的典型特征和茶葉苦澀的主要物質(zhì)。目前，一些學者研究了紫化茶樹‘紫娟’的色素累積特性，發(fā)現(xiàn)其葉色變化與花青素含量/葉綠素含量比值顯著正相關，與類胡蘿卜素含量變化關系不大，花青素積累量隨葉片發(fā)育先增加后減少[8-9]。王峰等[10]研究發(fā)現(xiàn)18個茶樹品種(系)干物質(zhì)含量與光合色素含量顯著正相關，葉綠素含量和類胡蘿卜素含量顯著正相關。7月光照最強時，‘黃金芽’葉色最黃，葉綠素含量最低[11]。而氨基酸、花青素和葉綠素含量是導致綠茶品質(zhì)季節(jié)間差異的主要生化因子[12]。黃化茶樹不同時期，葉色變化差異大，茶葉品質(zhì)、產(chǎn)量不穩(wěn)定，限制了其優(yōu)勢發(fā)揮[13-14]。目前，有關黃化茶樹色素積累規(guī)律與主要品質(zhì)成分的相關性研究報道不多。為此，本試驗以黃化茶樹品種‘中黃3號’(‘ZH3’) 為試驗材料、常綠品系‘苔茶15’(‘TC15’)為對照，研究不同月份‘ZH3’新梢(一芽二葉)葉綠素、類胡蘿卜素、花青素和主要生化成分的含量變化，探討這些指標間的相互關系，為揭示黃化茶樹葉片色澤形成的生理生化機制及其更好開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗于貴州省茶葉研究所湄潭資源圃(107°29′22″E，27°45′48″N，海拔778 m)進行。供試材料為黃化茶樹品種‘中黃3號’(‘ZH3’)和常綠品系‘苔茶15’(‘TC15’)，樹齡4年，無性系，雙行雙株種植，大行距1.5 m，小行距40 cm，穴距33 cm?！甖H3’和 ‘TC15’各種有1行，長10 m，緊鄰。茶園管理合理，茶樹生境一致，生長環(huán)境良好，長勢優(yōu)。分別于2019年4月12日、5月31日、7月14日、8月17日采摘一芽二葉，一部分立即液氮保存，帶回實驗室于-70 ℃保存?zhèn)溆?；另一部分，及時殺青、烘干，制作烘青綠茶品質(zhì)成分檢測樣品。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生化成分含量由中國茶葉研究所茶葉質(zhì)量標準與檢測技術研究中心分別采用國家標準GB/T 8305-2013、GB/T 8312-2013、GB/T 8313-2018和GB/T 8314-2013檢測水浸出物、咖啡堿、茶多酚和游離氨基酸含量，3次重復。

1.2.2 葉綠素和類胡蘿卜素含量葉綠素和類胡蘿卜素含量測定參照《植物生理生化實驗原理和技術方法測定》[15]方法，略作修改，3次重復。取儲存于-70 ℃新梢，液氮中迅速研磨至粉末，加95%乙醇10 mL，混勻，靜置5 min后過濾，用95%乙醇定容至25 mL，以95%乙醇為空白對照，在波長665 nm、649 nm和470 nm下測定吸光度A665、A665和A665，據(jù)此計算光合色素濃度和含量。

葉綠素a濃度(Ca)=13.95A665-6.88A649

葉綠素b濃度(Cb)=24.96A649-7.32A665

總?cè)~綠素濃度(CT)=Ca+Cb

類胡蘿卜素濃度(Cx,C)=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

葉綠體色素含量(mg/g)=(C·V·N)/m·1 000，式中，C為色素含量(mg/L)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 花青素含量花青素含量測定參照王靜等[16]方法，略作修改，3次重復。取經(jīng)液氮研磨的粉末樣2.0 g，加沸水10 mL，于沸水浴中提取30 min，過濾后加冷沸水定容至50 mL。吸取2 mL供試液置于刻度試管中，加酸性乙醇溶液至5 mL，混勻，靜置30 min，以酸性乙醇為空白對照，在波長535 nm下測定吸光度。

花青素質(zhì)量濃度 (mg/mL)=試液與對照液吸光度差×101.83/吸取溶液量(mL) ×10[17]

花青素含量(mg/g)=花青素質(zhì)量濃度×V/m，式中，V為提取液體積(mL)，m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、Pearson相關性分析，組間多重比較采用最小顯著差異法(Least-significant difference, LSD)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種茶樹葉綠素含量在不同月份的變化特征

2.1.1 葉綠素a含量圖1，A顯示，從4至8月份，‘ZH3’和‘TC15’葉綠素a含量均呈先下降后上升趨勢，均在5月份達到最低值，在8月份達到最高值；但‘ZH3’的含量始終低于同期的‘TC15’，且變幅明顯大于‘TC15’?！甖H3’葉綠素a含量在4、5月份無顯著變化，隨后逐月大幅顯著上升；‘TC15’葉綠素a含量在4、5、7月份均無顯著變化，僅在8月份才顯著增加?！甖H3’和‘TC15’葉綠素a含量在5月份分別為0.513和0.990 mg/g，在8月份分別為1.067和1.159 mg/g。

2.1.2 葉綠素b含量由圖1，B可看出，‘ZH3’和‘TC15’葉綠素b含量基本上呈現(xiàn)先降后升的趨勢，它們分別在5和7月份達到最低值，均在8月份達到最大值；‘ZH3’和‘TC15’葉綠素b含量均在4、5月份無顯著變化，但‘ZH3’分別比‘TC15’低41.9%、54.9%；在7、8月份，‘ZH3’葉綠素b含量持續(xù)顯著增加，而‘TC15’先顯著降低再顯著升高，‘ZH3’分別比同期‘TC15’高47.5%、22.1%?！甖H3’和‘TC15’葉綠素b含量最低值分別為0.185 mg/g(5月)和0.265 mg/g(7月)，最高值(8月)分別為0.635 和0.520 mg/g。

2.1.3 總?cè)~綠素含量由圖1，C可知，兩種茶樹總?cè)~綠素含量表現(xiàn)出與葉綠素a相似的先降低后上升的變化趨勢，只是‘TC15’的最低值延遲至7月份，‘ZH3’的變化幅度更大。‘ZH3’總?cè)~綠素含量在4、5、7月份分別比‘TC15’低42.7%、50.1%、13.5%，而在8月份略高于‘TC15’；‘ZH3’和‘TC15’總?cè)~綠素含量最高值(8月)分別為1.701 和1.679 mg/g，最低值分別為0.698 mg/g(5月)和1.335 mg/g(7月)。

2.1.4 葉綠素a/b值‘ZH3’ 葉綠素a/b值呈先增加后遞減趨勢，并在5月達到最大值，‘TC15’ 葉綠素a/b值則呈先降低后上升再降低趨勢，并在7月份達到最大值，兩者均在8月達到最小值，且‘TC15’ 的變幅更大?！甖H3’葉綠素a/b值在4月份與‘TC15’接近，在5月份(2.773)略高于‘TC15’(2.415)，在7、8月份分別比‘TC15’低51.6%、24.7%(圖1，D)。

以上結(jié)果說明兩種茶樹不同月份間葉綠素a、總?cè)~綠素含量的變化趨勢大體相似，但葉綠素b含量、葉綠素a/b變化趨勢不一致，‘ZH3’的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量變幅更大。兩種茶樹的高光合活性時期不同，總體上‘ZH3’的光合效率低于‘TC15’。

2.2 兩種茶樹類胡蘿卜素和花青素含量在不同月份的變化特征

由圖2，A可知，‘ZH3’類胡蘿卜素含量隨著生育期呈逐漸遞減趨勢，而‘TC15’ 類胡蘿卜素含量則呈先降后升再降變化趨勢；‘TC15’ 類胡蘿卜素含量各月份均高于同期‘ZH3’，并在5月份接近，在4、7、8月份差異明顯；4至8月份‘ZH3’類胡蘿卜素含量的變幅明顯大于‘TC15’?！甖H3’和‘TC15’ 類胡蘿卜素含量最高值(4月)分別為0.194 和0.233 mg/g，最低值分別為0.075 mg/g(8月)和0.185 mg/g(5月)。

兩種茶樹花青素含量隨著生育期均呈先上升后下降的變化趨勢，且均在7月份達到最大值；除7月份外，‘ZH3’花青素含量均略高于同期‘TC15’ (圖2，B)?！甖H3’和‘TC15’ 花青素含量在4、5月份均無顯著變化；在7月份顯著升高至最高值(分別為1.31 和1.78 mg/g)，此時期‘ZH3’花青素含量比‘TC15’低26.4%；隨后，兩者均顯著降低至最低值，分別為0.54 和0.45 mg/g。以上結(jié)果初步表明‘ZH3’ 類胡蘿卜素含量變幅更大，各時期‘TC15’的類胡蘿卜素含量高于‘ZH3’，試驗地8月份高溫、強光抑制了茶樹花青素合成。

線上同一品種(系)內(nèi)不同小寫字母表示月份間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；下同圖1 ‘ZH3’和‘TC15’新梢葉綠素a(A)、葉綠素b(B)、總?cè)~綠素(C)含量及葉綠素a/b值(D)在不同月份的變化Different normal letters on the same line (cultivar) indicate significant difference among different months at 0.05 level (P<0.05). The same as belowFig.1 Changes of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C) contents and chlorophyll a/b ratio (D) in young shoots of ‘ZH3’ and ‘TC15’ in different months

圖2 不同月份‘ZH3’和‘TC15’類胡蘿卜素和花青素含量變化Fig.2 Changes of carotenoids and anthocyanin contents in young shoots of ‘ZH3’ and ‘TC15’ in different months

2.3 兩種茶樹不同月份3種色素所占比例及其動態(tài)變化

圖3顯示，各月份兩種茶樹3種色素所占比例均表現(xiàn)為葉綠素>花青素>類胡蘿卜素，表明兩種茶樹類胡蘿卜素占比均較小?！甖H3’和‘TC15’葉綠素比例均呈先降低后升高的變化趨勢，并均在7月份最低(分別為43.85 %和39.99%)，在8月份達到最高值(分別為73.45%和72.22%)；‘ZH3’葉綠素比例在4、5、7月份差異不大，‘TC15’葉綠素比例在4、5月份差異不大?！甖H3’ 類胡蘿卜素比例呈遞減趨勢，‘TC15’ 類胡蘿卜素比例先遞減后小幅上升。兩種茶樹類胡蘿卜素比例均在4月份最高且相近，分別達到12.06%和11.02%；‘ZH3’在8月份達到最低值3.24%，遠低于同期的‘TC15’(8.43%)；‘TC15’在7月份達到最低值6.68%，但仍稍高于同期的‘ZH3’(6.42%)?！甖H3’和‘TC15’的花青素比例均隨著生育期均呈先升高后大幅下降的趨勢，‘ZH3’在4至5月份大幅升高，而‘TC15’ 在5至7月份大幅升高，并均在7月份達到最大值(分別為49.73%、53.33%)，在8月份達到最低值(分別為23.32%、19.35%)；‘ZH3’的花青素占比在4、5月份明顯高于‘TC15’，在7、8月比較接近。

2.4 兩種茶樹品質(zhì)成分含量在不同月份的變化

如表1所示，兩種茶樹制作的烘青綠茶水浸出物含量接近，均約為50%，且各時期之間無顯著差異；‘ZH3’和‘TC15’的游離氨基酸含量隨著月份均呈先降低后上升趨勢，并均在4月達到最高值(分別為7.3%、3.8%)，均在7月達到最低值(分別為2.6%、2.4%)，且各時期均表現(xiàn)為‘ZH3’高于‘TC15’，尤其是‘ZH3’游離氨基酸含量在4月份比‘TC15’高92.1%；‘ZH3’的咖啡堿含量在月份間均無顯著變化，‘TC15’ 咖啡堿含量在5月份顯著低于其他3個月，其他月份間無顯著差異；兩種茶樹的茶多酚含量變化趨勢相似，均呈先上升后降低的趨勢，并均在4月達到最低值，7月達到最高值，且在4、5、7月份間均差異顯著?？梢姡?至5月份，‘ZH3’的游離氨基酸含量降幅顯著，而‘ZH3’ 和‘TC15’的茶多酚含量均增幅顯著。

圖3 不同月份‘ZH3’(A)和‘TC15’(B)新梢色素 比例的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of pigment proportion in young shoots of ‘ZH3’ (A) and ‘TC15’ (B) in different months

表1 不同月份‘ZH3’和‘TC15’新梢生化成分含量

表2 ‘ZH3’和‘TC15’新梢色素含量與其主要品質(zhì)成分含量的相關系數(shù)

2.5 兩種茶樹色素含量與其品質(zhì)成分含量的相關性分析

表2顯示，兩種茶樹的水浸出物含量與葉綠素b、總?cè)~綠素含量負相關，與類胡蘿卜素含量和花青素含量均正相關，但僅與‘TC15’的花青素含量顯著正相關(r=0.515*)?！甖H3’的游離氨基酸含量與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、花青素含量均呈負相關，與類胡蘿卜素含量呈正相關，但均未達到顯著水平；‘TC15’ 游離氨基酸含量與葉綠素a、花青素含量負相關，與葉綠素b、類胡蘿卜素含量正相關，但僅與總?cè)~綠素含量呈顯著正相關(r=0.443*)。‘ZH3’ 咖啡堿含量與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、花青素含量正相關，與類胡蘿卜素含量負相關，但均未達到顯著水平；‘TC15’ 咖啡堿含量與葉綠素a(r=0.677*)、總?cè)~綠素(r=0.462*)、類胡蘿卜素(r=0.523*)含量均顯著正相關，與葉綠素b、花青素含量均呈不顯著正相關。‘ZH3’ 茶多酚含量與葉綠素a(r=0.631*)、葉綠素b(r=0.644*)、總?cè)~綠素(r=0.637*)含量呈顯著正相關，與類胡蘿卜素含量顯著負相關(r=-0.656*)，與花青素含量呈不顯著正相關；‘TC15’ 茶多酚含量與葉綠素a呈不顯著正相關，與花青素含量呈顯著正相關(r=0.788**)，與葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量呈不顯著負相關。

3 討 論

3.1 兩種茶樹新梢色素和主要生化成分的累積特征

茶樹新梢中色素主要分為葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3大類。黃化品種‘ZH3’和常綠品系‘TC15’葉綠素a、總?cè)~綠素含量在4至8月份均呈先下降再上升趨勢，并在8月份達到最高，這與‘名山213 ’、‘名山131 ’和‘名山311’的葉綠素a含量表現(xiàn)為秋季>春季>夏季[19]的研究結(jié)果類似。兩種茶樹的葉綠素b含量變化趨勢不同，但峰值都出現(xiàn)在8月份；‘ZH3’葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量在4、5月份遠低于‘TC15’，而其葉綠素b含量在7、8月份略高于‘TC15’，致使其葉綠素含量與‘TC15’差異減小。其原因可能是本試驗點位于西南地區(qū)，夏季取樣時間處于梅雨季節(jié)、持續(xù)天陰有雨，而秋季氣溫高、光照強。試驗地氣溫在4、5月份不高，植物葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，減少了葉綠素酸酯a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化，致使葉綠素b減少了光能的酸酯吸收和傳遞，避免引起光系統(tǒng)Ⅱ反應中心受破壞而降低光合功能[20]；在7月下旬后，隨著氣溫的升高，植物葉綠體結(jié)構(gòu)恢復正常，葉綠素a、葉綠素b含量增加。例如，白化茶樹品種‘小雪芽’ 在20 ℃和25 ℃條件下葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，在20 ℃條件下葉綠體膜有損傷，在15 ℃條件下葉肉細胞內(nèi)無成熟葉綠體[21]；白榆白化芽葉綠素b合成在弱光下加快[22]。另外，葉綠素a/b值可一定程度上反映光合能力強弱，葉綠素a/b值高，光合活性和光合速率也高[22]?！甖H3’葉綠素a/b值峰值出現(xiàn)在5月，而‘TC15’ 葉綠素a/b值峰值出現(xiàn)在7月，表明兩種茶樹的高光合活性時期不同。

類胡蘿卜素是對葉綠素捕獲光能的補充，具有保護葉綠素不被光氧化的作用[23]。黃化品種‘ZH3’類胡蘿卜素含量呈遞減趨勢，與葉綠素b含量變化趨勢總體上相反。表明4、5月‘ZH3’類胡蘿卜素含量較高，對于光合產(chǎn)物的積累貢獻較大，彌補葉綠素b含量不足。同時，常綠品系‘TC15’類胡蘿卜素含量在各時期均高于‘ZH3’，而其葉綠素含量在4、5、7月均遠高于‘ZH3’，僅在8月與‘ZH3’非常接近，一定程度說明各時期‘TC15’的光合效率高于‘ZH3’。

花青素具有過濾可見光和紫外線，減輕葉片受到傷害的潛力[24]。Burger等[25]研究發(fā)現(xiàn)在受到紫外線脅迫時，高花青素的紅葉受到的傷害顯著低于綠葉。本研究中茶樹黃化品種‘ZH3’花青素含量在4、5、8月份略高于常綠品系‘TC15’，而在7月份比‘TC15’低26.4%，表明葉綠體突變的黃化茶樹新梢更需花青素保護。兩種茶樹花青素含量峰值均出現(xiàn)在7月份，這可能與該時期環(huán)境中光照較強、溫度較高有關。較強的光照和高溫能誘導花青素含量增加，致使茶樹芽葉變?yōu)樽霞t色[23]。而在8月份，‘ZH3’和‘TC15’ 花青素含量均最低，這可能是該時期溫度過高所致。研究表明低溫可誘導茶樹中花青素生物合成相關基因表達，促使花青素含量增加，過高溫則抑制基因表達，降低花青素積累[26]。

葉片呈色是各種色素綜合作用的結(jié)果，正常綠色葉片中葉綠素含量高于其他色素含量，葉片呈綠色[27]。葉綠素含量降低，類胡蘿卜素和花青素相對含量升高，葉片呈現(xiàn)黃色或者紅色[28]。‘ZH3’新梢4月為黃色，5、7月變?yōu)闇\粉紅色，8月變?yōu)闇\綠色?！甌C15’新梢4、5月為淺綠色，7月變?yōu)榫G紫色，8月變?yōu)闇\綠色。大部分黃色變異的茶樹屬于光照敏感型，新梢的黃化程度主要受光照影響，其黃化程度隨光照強度的增強而增加[23,29-30]。溫度敏感性的多為白化變異茶樹，新梢葉色受溫度主導，新梢葉色除葉脈外呈白色、奶白色或玉白，低于或超過溫度范圍則出現(xiàn)返綠現(xiàn)象，返綠后葉色不可逆轉(zhuǎn)[23,29-30]。本研究采樣時間為4、5、7、8月，環(huán)境光照強度逐漸增強，溫度逐漸升高，且8月份光照最強、溫度最高，而‘ZH3’的黃化程度隨著月份逐漸減弱，于8月份返綠。2019年10月17日，觀測采樣地的‘ZH3’，其新梢變?yōu)辄S色。表明‘ZH3’ 既不屬于光敏感型黃化茶樹品種，也不屬于溫度敏感性白化茶樹品種。低溫、低光照有利于‘ZH3’新梢黃化，表明‘ZH3’可能屬于生態(tài)復合型黃化茶樹品種，這有待進一步研究。

本研究中兩種茶樹新梢水浸出物在月份間無顯著變化，品種(系)間也比較接近?！甖H3’咖啡堿含量在月份間無顯著變化，而在‘TC15’中存在顯著變化?！甖H3’ 和‘TC15’游離氨基酸含量變化分別為2.6%～7.3%、2.4%～3.8%，茶多酚含量變化分別為9.2%～23.2%、14.7%～25.4%?！甖H3’的游離氨基酸含量在各時期均高于‘TC15’，其茶多酚含量在4、5、7月份低于‘TC15’。這再次表明，相較于常綠茶樹，黃化茶樹具有高氨基酸、品質(zhì)成分含量變幅大的特性[13-14]。

3.2 兩種茶樹新梢色素含量與主要生化成分的關系

茶樹新梢的色素含量、比例不僅反映光合效率的強弱，而且與成茶品質(zhì)密切相關[23]。本研究表明‘ZH3’水浸出物和咖啡堿含量受色素含量影響小，而‘TC15’受影響大?！甖H3’、‘TC15’游離氨基酸和茶多酚含量與新梢色素含量之間存在不同的、復雜的正負相關性。這些結(jié)果表明受色素影響，兩種茶樹新梢生化成分變化規(guī)律呈現(xiàn)多樣性。本研究中，黃化品種‘ZH3’ 游離氨基酸含量、茶多酚含量分別與新梢類胡蘿卜素含量正、負相關，表明黃化茶樹新梢類胡蘿卜素含量升高有助于氮代謝、抑制碳代謝。類胡蘿卜素組分的差異是形成黃葉肉桂芽葉黃色表型的重要因素[31]。在一定環(huán)境條件下，黃化茶樹新梢葉色黃化明顯，其氨基酸含量明顯升高。然而，馮琳[32]推測黃化茶樹新梢類胡蘿卜素合成受到抑制在代謝水平動態(tài)地促進了氨基酸合成，與本研究結(jié)果不一致。常綠品系‘TC15’游離氨基酸含量主要受葉綠素含量影響，茶多酚含量受花青素含量顯著影響。氮素供應充足時，常綠茶樹‘龍井43’ 葉綠素、氨基酸含量呈正相關[33]。茶樹中花青素可在花青素還原酶作用下催化形成茶多酚的主要成分兒茶素[34]。一定程度解釋了這一現(xiàn)象。其復雜的代謝網(wǎng)絡關系有待從代謝組等組學水平進一步揭示。

綜上所述，通過對不同時期黃化和常綠茶樹新梢色素、主要生化成分含量測定分析，研究不同月份兩種茶樹新梢色素和生化成分的含量變化、積累規(guī)律及其相互關系，初步認為黃化品種‘中黃3號’新梢顏色越黃，類胡蘿卜素、游離氨基酸含量越高，葉綠素、茶多酚含量越低，葉綠素a/b值較高，花青素含量適中，茶樹新梢色素含量與其主要生化成分關系密切。