閆靜川，王洪濤，賈艷慧，白曉智，劉 洋，陳俏華

已有研究[1]顯示，脂肪間干細胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能夠促進創(chuàng)面愈合與組織再生。ADSCs具有多項分化潛能，可轉(zhuǎn)分化為多種修復細胞直接參與創(chuàng)面修復；另一方面，ADSCs可能通過旁分泌各種生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子，調(diào)控創(chuàng)面炎癥反應，促進角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而加速創(chuàng)面的愈合[2]，但具體機制尚不清楚。血管的發(fā)生是一個包含多種修復細胞、細胞因子、生長因子以及機械力學、氧濃度等微環(huán)境因素參與的復雜過程，低氧環(huán)境誘導、機械牽張、血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular endothelial Growth Factor,VEGF）、血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ,AngⅠ）、炎性因子等均參與這一復雜過程[3]。血管內(nèi)皮細胞作為主要效應細胞，增殖、遷移等生物學特性在血管發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。我們體外培養(yǎng)人ADSCs并收集培養(yǎng)上清液，作為條件培養(yǎng)基，觀察其對體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）生物學特性的影響，初步探討ADSCs通過旁分泌促進血管發(fā)生的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 游離脂肪組織由空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院燒傷外科提供，為全厚皮膚移植手術(shù)中修剪下廢棄的脂肪，經(jīng)患者同意后自愿捐贈。HUVECs購自美國模式培養(yǎng)物庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA購自美國GIBCO公司；Ⅰ型膠原酶、鼠抗人VEGF，AngⅠ抗體購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗鼠熒光標記二抗、兔抗鼠酶聯(lián)標記二抗，β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標儀（Thermo公司，美國）。

1.2 ADSCs培養(yǎng)上清的收集 按照YAN LI[5]方法進行ADSCs的培養(yǎng)。簡單步驟為，在無菌條件下將大塊的脂肪用含1%雙抗的PBS反復沖洗三遍，后放入10 cm平皿中，剪成糜狀，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，充分混勻后置于37℃恒溫箱，100 rpm消化40 min-60 min。100目鋼絲濾網(wǎng)過濾去除沒有消化的雜質(zhì)，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，用含10%胎牛血清的人ADSCs專用培養(yǎng)基5 mL重懸細胞沉淀，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于孵箱常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實驗選取3-5代細胞，待細胞長至75%-85%融合度時，PBS沖洗，無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，收集上清備用，將上清與DMEM培養(yǎng)基按照1：1混合，并加入10%胎牛血清，作為實驗組條件培養(yǎng)基，含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為對照組。

1.3 HUVECs的復蘇和傳代 HUVECs來從液氮中取出細胞凍存管，立即置于37℃細胞復蘇水浴鍋中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，反復吹打混勻后1000 rpm離心3 min；棄去上清液后重懸，移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；待內(nèi)皮細胞生長接近融合時用0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。

1.4 MTT增殖實驗 使用MTT測定法檢測細胞增殖，將HUVECs按每孔1×104接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，分別向每個孔中加入20μL濃度為5 g/L的MTT并孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜并震蕩混勻15 min，490 nm波長酶聯(lián)免疫儀測取吸光度值。

1.5 劃痕實驗 將HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，待細胞80%鋪滿，PBS清洗2次，10μg/mL絲裂霉素37℃孵育1 h，用200μL吸頭在細胞培養(yǎng)孔中央垂直劃一直線，PBS清洗2次，分別加入實驗組和對照組培養(yǎng)基，于劃痕后即刻、24 h、48 h顯微鏡拍照，每次拍照固定相同位置，測量各時間點劃痕寬度，計算愈合速度，比較細胞遷移快慢。

1.6 Transwell遷移實驗 將Transwell小室插入24孔板中，向小室中加入100μL HUVECs 1×104/孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。實驗組下室更換為條件培養(yǎng)基，對照組下室更換為普通培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用棉簽刮去上室未遷移細胞，并將小室用多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察遷移細胞并計數(shù)，重復6次取平均值。

1.7 免疫熒光染色 將載玻片放入6孔培養(yǎng)板中，分別接種HUVECs 1×105個細胞/孔。待細胞70%融合后，PBS清洗2次，實驗組和對照組分別加入條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%Triton/PBS室溫中處理15 min，甲醇新配置0.3%雙氧水室溫孵育15 min，5%BSA/PBS于37℃下封閉2 h，分別滴加1:100的鼠抗人一抗，4℃下孵育過夜，PBS洗滌×3次。1:50的Cy3標記兔抗小鼠二抗，37℃下孵育1h，PBS洗滌×3次，DAPI室溫孵育30 min，PBS洗滌×3次，防熒光淬滅封片劑封片后，顯微鏡拍照。

1.8 Westernblot 不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下HU?VECs達到80%鋪滿時，RIPA強細胞裂解液作用30 min，后取上清液進行蛋白定量。取50μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，用5%牛血清白蛋白封閉1 h。加入1:1000一抗工作液（VEGF、AngⅠ），4℃孵育過夜；加入1：2000辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗，室溫下作用2 h。化學發(fā)光法顯影，曝光。以相應蛋白條帶的積分光密度值，除以GAPDH的值表示目的蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基在接種24 h、48 h和72 h，HUVECs增殖明顯增快，統(tǒng)計學差異顯著。見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對HUVECs增殖的影響

2.2 細胞劃痕實驗 實驗結(jié)果顯示在第24 h和48 h，條件培養(yǎng)基細胞劃痕寬度明顯小于對照組，提示條件培養(yǎng)基可以促進HUVECs遷移。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測不同培養(yǎng)基對HUVECs遷移的影響

2.3 Transwell實驗 UVECs接種于Transwell小室培養(yǎng)12h發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)基組遷移至小室背面細胞數(shù)與對照組相比明顯增加。見表2。

表2 Transwell檢測不同培養(yǎng)基對HUVECs遷移的影響

2.4 免疫熒光染色 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的HUVECs表達VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達

2.5 Westernblot結(jié)果 Westernblot結(jié)果顯示，與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的HUVECs表達VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖3。

圖3 Westernblot檢測不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達情況

3 討 論

近年來，間充質(zhì)干細胞在組織修復與再生中的作用日益受到重視。與其他干細胞相比，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞具有來源豐富、容易獲取等優(yōu)點，具有更廣闊的臨床應用前景。研究[6]表明，ADSCs具有多項分化潛能，可以分化為內(nèi)皮細胞，直接參與血管的再生，并有望用于缺血性疾病的治療。最近研究[2,4]顯示，干細胞真正在體內(nèi)的轉(zhuǎn)分化作用是微乎其微的，無論自體或者異體局部注射干細胞大多數(shù)都以排斥清除的方式結(jié)束，干細胞的修復作用更多的是通過旁分泌及促進靶細胞的自分泌實現(xiàn)的。ADSCs可以通過旁分泌TNF-α，IFN-γ，TGF-β，VEGF等，促進新生血管的形成[7]。Lee EY等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導條件下，ADSCs能夠分泌低氧誘導因子1α（HIF-1α），與常氧條件下培養(yǎng)的ADSCs相比，誘導血管發(fā)生能力更強。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs中分泌單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、VEGF、血管緊張素等，均促進新生血管的發(fā)生。除此之外，ADSCs還能分泌一些免疫抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞外基質(zhì)蛋白、酶以及小分子核糖核酸mi?croRNA（miRNA）等[10]，這些成分不但可以促進細胞的增殖、分化和生存，還可以減少炎癥反應，提高修復速度和愈合質(zhì)量[11]。近年研究[12,13]發(fā)現(xiàn)，ADSCs能夠分泌生物活性成分中含有一種50 nm-150 nm的顆粒，稱為外泌體（Exo），ADSCs-Exo外泌體中包含蛋白、脂質(zhì)體、mRNA，miRNA等，而miRNA可能發(fā)揮了軸心作用，可以通過對靶細胞的調(diào)控發(fā)揮作用。外泌體化學性質(zhì)穩(wěn)定、生物安全性高、移植后無免疫排斥，是干細胞研究領(lǐng)域的新興熱點[14]。

血管的形成需要內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，以及內(nèi)皮細胞、血管生成因子等與周圍蛋白之間的相互作用。在趨化作用下，內(nèi)皮細胞穿透血管基底膜，侵入細胞外基質(zhì)并形成管狀結(jié)構(gòu)，繼續(xù)延伸，分支并形成網(wǎng)絡(luò)。VEGF/VEGF-R通路在這一過程中發(fā)揮重要作用，可以誘導相關(guān)基金表達，調(diào)控血管滲透性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，抑制細胞凋亡[15]。我們通過提取ADSCs培養(yǎng)上清與HUVECs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能夠促進體外培養(yǎng)的HUVECs增殖和遷移，并表達VEGF，AngⅠ等，初步闡明ADSCs可以通過旁分泌促進新生血管的發(fā)生。而由于ADSCs培養(yǎng)上清不含細胞成分，免疫原性低，無潛在致瘤性風險，克服了細胞治療臨床應用的局限性，且易于攜帶、轉(zhuǎn)運和保存，有望替代干細胞移植，形成臨床標準化治療方案。