張玉婷，黃昭賢，張景榮，卓 明，周良強(qiáng)

(1 內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川內(nèi)江，641100；2 四川省自然資源科學(xué)研究院，成都，610015；3 四川省植物工程研究院，成都，611730)

昆蟲體內(nèi)定殖著大量的細(xì)菌。在協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，這些細(xì)菌與昆蟲構(gòu)建了多種多樣的共生關(guān)系，并在昆蟲的營(yíng)養(yǎng)、生殖以及免疫等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。如布赫納氏菌(Buchnera)能為宿主蚜蟲提供必需的氨基酸、維生素B等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，立克次氏體菌(Rickettsia) 調(diào)控宿主昆蟲的生殖[3]，Regiellainsecticolan能顯著增強(qiáng)豌豆蚜對(duì)蟲疫霉菌的抗感染能力[4]，點(diǎn)蜂緣蝽體內(nèi)的伯克氏菌(Burkholderia)具有解毒功能，能幫助宿主降解化學(xué)農(nóng)藥“殺螟松”等[5]。同時(shí)，宿主昆蟲的食性和其寄主植物的不同反過(guò)來(lái)也影響著共生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

昆蟲體內(nèi)的生境會(huì)隨著昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育而變化，進(jìn)而引起體內(nèi)細(xì)菌種類和數(shù)量的變化。由于昆蟲體內(nèi)很多細(xì)菌對(duì)生境要求苛刻，不可體外培養(yǎng)，因此，依賴于對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)，對(duì)其形態(tài)和生理生化等特征進(jìn)行檢測(cè)鑒定的傳統(tǒng)方法，在細(xì)菌的種類和數(shù)量上均存在明顯的局限和不足。隨著高通量測(cè)序平臺(tái)的不斷發(fā)展，基于16S rDNA的選擇性擴(kuò)增和第2代測(cè)序，已成為微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究的主要方法。

小蠹蟲是鞘翅目(Coleoptera) 象甲科(Curculionidae) 小蠹亞科(Scolytinae) 昆蟲的總稱[6]，是嚴(yán)重為害林木的一類鉆蛀性害蟲，防治困難。近年來(lái)，在獼猴桃上也發(fā)現(xiàn)了小蠹蟲為害，引起植株枝葉萎蔫甚至全株枯死[7-8]。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)小蠹蟲的生物學(xué)特性和防治研究較多，而對(duì)其體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)及不同蟲態(tài)體內(nèi)菌群之間的差異鮮有報(bào)道[9]，共生菌群在獼猴桃小蠹蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化情況尚不清楚。為此，本試驗(yàn)以為害獼猴桃的壯材小蠹TerminalinusHopkins為研究對(duì)象，對(duì)不同蟲態(tài)體內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，分析其群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為深入研究小蠹蟲內(nèi)共生菌與宿主的共生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試蟲采集于四川省彭州市通濟(jì)鎮(zhèn)黃村(N 31°10′18.06″，E 103°48′16.4″)的“紅陽(yáng)”獼猴桃枝條，從帶有小蠹蟲新蛀蟲孔的獼猴桃枝條中取出小蠹蟲71頭。其中，30頭成蟲浸泡于75%酒精，用于形態(tài)種屬鑒定，其余的41頭不同蟲態(tài)的小蠹蟲，即幼蟲、蛹、新成蟲各9頭，老成蟲14頭，用于體內(nèi)共生細(xì)菌研究。先后采用75%酒精和2%NaClO對(duì)試蟲體面進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水漂洗去除樣品體面細(xì)菌。

1.2 DNA的提取與測(cè)序

使用細(xì)菌DNA提取試劑盒(Solarbio)提取各樣本DNA。用高保真酶和帶Barcode的特異性引物(515F和806R)對(duì)16S V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，再進(jìn)行等量混樣和純化。采用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒(Thermo fisher公司)構(gòu)建文庫(kù)，委托諾禾致源公司使用Thermo fisher的Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.3 測(cè)序結(jié)果分析

1.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt[10]去除reads的低質(zhì)量部分，截去Barcode和引物序列，拼接得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads)，再經(jīng)質(zhì)檢、去除其嵌合體、過(guò)濾等處理得到有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)[11]。

1.3.2 OTU聚類和物種注釋

利用Uparse 軟件[12]以97%的一致性為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs) 聚類。用Mothur法和SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[13]注釋OTUs序列，進(jìn)而分析樣本在不同分類階元的群落組成。

1.3.3 樣品復(fù)雜度分析

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Shannon，ACE，Goods-coverage 指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接與組裝

對(duì)獼猴桃小蠹蟲體內(nèi)細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，得到原始系列273 917條，經(jīng)優(yōu)化、拼接處理后得到可用于后續(xù)分析的260 414條有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。在97%相似度下，對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類，得到808個(gè)OTUs。數(shù)據(jù)處理過(guò)程中各步驟得到的序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 1。

表1 獼猴桃小蠹蟲內(nèi)共生細(xì)菌測(cè)序信息

2.2 多樣性指數(shù)分析

分別采用Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)衡量群落豐富度和多樣性。Ace指數(shù)值越大則表示群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)值越高，則表明群落的多樣性越高[14]。用Good’s coverage指數(shù)反映測(cè)序深度，其值越接近1，則表明測(cè)序深度基本覆蓋檢測(cè)樣品的所有物種。在本研究中，各樣品的測(cè)序深度均在0.999以上，表明該測(cè)序結(jié)果能準(zhǔn)確反映出各樣品所含共生菌的物質(zhì)信息。

一般而言，在97%以上的相似性下聚類而成的OTU，通常被認(rèn)為是源自于同一個(gè)種(Species Boundary)的序列。本研究以97%的相似性為閾值，對(duì)各試蟲的Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行了分析(見表2)。由結(jié)果可知，蛹期細(xì)菌的Shannon 和Ace 指數(shù)值均大于其他蟲態(tài)的指數(shù)，表明在獼猴桃小蠹蟲的4種蟲態(tài)中，蛹內(nèi)共生菌的多樣性和豐富度均最高，其次為老成蟲，新成蟲內(nèi)生菌的多樣性和豐富度最低。

表2 不同蟲態(tài)獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌多樣性分析

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)KRONA[15]的注釋結(jié)果，在不同分類水平上，選取豐度最高的10個(gè)物種進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析。

在門分類水平上，注釋到變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(chloroflexi)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes) 等14個(gè)門，其中，變形菌門為4種蟲態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌門，其豐度高達(dá)62.97%～98.21%。蛹和老成蟲體內(nèi)菌群多樣性較高，相比其他蟲態(tài)，二者的變形菌門的細(xì)菌豐度有所下降，而厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度大幅上升，這3類菌群分別占蛹和老成蟲菌群數(shù)量的36.24%與27.23%，而幼蟲與新成蟲的相應(yīng)體內(nèi)菌僅占總量的1.60%與1.85%(見表3)。

表3 在門分類水平的獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌菌群相對(duì)豐度 /%

在綱水平上，共注釋到γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、ε-變形細(xì)菌綱(Epsilonproteobacteria)等26個(gè)綱。4種蟲態(tài)小蠹蟲體內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群差別較大，幼蟲和蛹的優(yōu)勢(shì)菌群為γ-變形菌，次優(yōu)勢(shì)菌群為α-變形菌；在成蟲時(shí)期，α-變形菌為優(yōu)勢(shì)菌綱，γ-變形菌為次優(yōu)勢(shì)菌綱(見表4)。

表4 在綱分類水平的獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌菌群相對(duì)豐度 /%

在目水平上，共注釋到腸桿菌目(Enterobacterales)、棒狀桿菌目(Corynebacteriales)、立克次氏體目(Rickettsiales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、乳桿菌目(Lactobacillales)等48個(gè)目。由表5可知，在小蠹蟲的幼蟲和蛹期的優(yōu)勢(shì)菌目為腸桿菌目(Enterobacterales，28.71%～71.08%)，在成蟲期優(yōu)勢(shì)菌目為立克次氏體目(Rickettsiales，55.84%～66.08%)。

表5 在目分類水平的獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌菌群相對(duì)豐度 /%

在科水平上，共注釋到腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、立克次體科(Rickettsiaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)等76個(gè)科。由表6可知，幼蟲的優(yōu)勢(shì)菌科為腸桿菌科(Enterobacteriaceae，71.08%)，立克次體科(Rickettsiaceae，17.83%)為次優(yōu)勢(shì)菌科。蛹的優(yōu)勢(shì)菌科為腸桿菌科(Enterobacteriaceae，28.71%)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae，10.23%)和無(wú)形體科(Anaplasmataceae，10.17%)，未注釋的微生物豐度為14.29%。新成蟲的優(yōu)勢(shì)菌科為立克次體科(Rickettsiaceae，41.38%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae，27.76%)和無(wú)形體科(Anaplasmataceae，24.70%)。老成蟲期的優(yōu)勢(shì)菌群為立克次體科(Rickettsiaceae)，其豐度高達(dá)48.71%。

表6 在科分類水平的獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌菌群相對(duì)豐度 /%

在屬水平上，注釋了133個(gè)屬，主要有立克次體屬(Rickettsia)、沃爾巴克氏菌(Wolbachia)、Sodalis、紅球菌(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等。幼蟲體內(nèi)未鑒定到屬水平的細(xì)菌數(shù)量占總數(shù)的68.04%，在已鑒定的體內(nèi)菌群中，優(yōu)勢(shì)屬為立克次體屬(Rickettsia，17.83%)，其次為沃爾巴克氏菌Wolbachia(8.70%)和Sodalis(4.67%)，而這3個(gè)屬的菌群在新成蟲體內(nèi)豐度較高，分別為41.38%、24.70%和23.00%。蛹期有46.29%的菌未鑒定到屬水平，其菌群優(yōu)勢(shì)屬為立克次體屬(Rickettsia)、沃爾巴克氏菌(Wolbachia)和紅球菌(Rhodococcus)，其豐度分別為8.49%、10.17%和10.23%。而在老成蟲體內(nèi)菌群中，立克次體屬(Rickettsia)相對(duì)豐度最高，為48.71%，其次是利斯特菌(Listeria)和紅球菌(Rhodococcus)，其豐度分別為9.46%和8.82%(見表7)。

表7 在屬分類水平的獼猴桃小蠹蟲共生細(xì)菌菌群相對(duì)豐度 /%

2.4 不同蟲態(tài)內(nèi)生菌群落之間的差異性

對(duì)OTUs進(jìn)行聚類分析，繪制獼猴桃4種蟲態(tài)小蠹蟲共生菌的韋恩圖，得到各蟲態(tài)共有和特有的OTUs。聚類分析結(jié)果看出，4種蟲態(tài)共有的OUTs為91個(gè)，占各樣本OUTs總數(shù)的38.24%～59.87%。幼蟲、蛹、新成蟲和老成蟲特有的OUTs分別為8個(gè)、23個(gè)、9個(gè)和13個(gè)，分別占各樣本OUTs總數(shù)的5.26%～9.66%，表明獼猴桃小蠹蟲在不同發(fā)育階段其體內(nèi)共生菌的組成存在較大差異(見圖1)。

圖1 獼猴桃小蠹蟲不同蟲態(tài)內(nèi)生菌群韋恩

3 結(jié)論與討論

本研究采用16S rDNA高通量測(cè)序法，首次對(duì)不同發(fā)育階段獼猴桃小蠹蟲體內(nèi)共生細(xì)菌的組成和變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)獼猴桃小蠹蟲從幼蟲到老成蟲的發(fā)育過(guò)程中，其體內(nèi)共生細(xì)菌的豐富度和多樣性發(fā)生了較大的變化，幼蟲和新成蟲體內(nèi)菌的豐度和多樣性較低，而蛹和老成蟲的則較高，物種數(shù)達(dá)到幼蟲及新成蟲的1.5倍以上。

在小蠹蟲4種蟲態(tài)中，變形菌門始終占據(jù)了單一菌門的最高比例，該門所占比例高達(dá)62.97%～98.10%，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。隸屬于立克次體科(Rickettsiaceae)的立克次體屬(Rickettsia)和沃爾巴克氏菌(Wolbachia)為成蟲的優(yōu)勢(shì)菌群，推測(cè)立克次體屬(Rickettsia)和沃爾巴克氏菌(Wolbachia)與成熟期的獼猴桃小蠹蟲形成了較穩(wěn)定的共生關(guān)系。胡霞在研究華山松大小蠹腸道微生物群落多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)腸桿菌科的檸檬酸桿菌(Citrobacter)在不同發(fā)育時(shí)期的華山松大小蠹中較為一致[16]。本研究中獼猴桃小蠹蟲與華山松大小蠹的腸道優(yōu)勢(shì)菌群存在較大差異，這可能與昆蟲種類及食性等有關(guān)。

Rickettsia是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。以往的研究發(fā)現(xiàn)Rickettsia有多種功能，有的為宿主昆蟲的營(yíng)養(yǎng)共生菌[17]，有的能提高宿主昆蟲耐高溫[18]以及抵御天敵的能力[19]。此外，Hendry 等觀察到甘薯粉虱在取食感染了丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的植物后，該菌在其體內(nèi)繁殖而導(dǎo)致粉虱死亡率顯著增加；而當(dāng)粉虱攜帶Rickettsia菌后，由丁香假單胞菌導(dǎo)致的死亡率則顯著降低，表明Rickettsia菌能顯著增強(qiáng)粉虱對(duì)丁香假單胞菌的抵御能力[20]。目前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為獼猴桃潰瘍病是由丁香假單孢細(xì)菌變種(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa)引起[21]。由于在獼猴桃潰瘍病枝條中普遍發(fā)現(xiàn)小蠹蟲[7-8]，黃昭賢提出該病害與小蠹蟲有關(guān)，由蟲-傷-菌共同作用導(dǎo)致了獼猴桃潰瘍病規(guī)模持續(xù)發(fā)生[8]。Rickettsia是獼猴桃小蠹蟲體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，它是否因攜帶了該菌后增強(qiáng)了對(duì)Psa的抵御能力，還需進(jìn)一步研究。