丁光雪，劉天天，辛納慧，李鈺媛，張乃群，楊 迪

(1 南陽幼兒師范學(xué)校，河南南陽，474150； 2 南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南南陽，473000； 3 南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南南陽，473061)

美味獼猴桃(Actinidiachinensisvar.deliciosa)又稱硬毛獼猴桃，屬大型落葉藤本[1]，在秦嶺一帶廣為分布，休眠枝條冬季抗凍閾值在-18～-10 ℃[2]，果實大，被有刺狀長硬毛，維生素C含量40～350 mg/100 g，還含有豐富的糖類、有機酸、氨基酸等，不僅食用價值高，且具備清熱、消炎、抗癌等藥用價值。隨著人們對美味獼猴桃的認(rèn)識及現(xiàn)代育種技術(shù)的不斷發(fā)展，選育出了大量的優(yōu)質(zhì)獼猴桃品種，如“徐香”[3]、“華美二號”[4]、“秦美”[5]、“貴長”[6]等。但對于苗木繁殖，生產(chǎn)上主要采用扦插、嫁接等方式[7]，美味獼猴桃類扦插成活率普遍較低[8]，春季嫁接又是獼猴桃潰瘍病多發(fā)季節(jié)[9]，影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。組織培養(yǎng)具有不受生長季節(jié)限制、繁殖快、遺傳性狀穩(wěn)定等特點[10]，已成為獼猴桃苗木繁育的重要手段。

“翠香”獼猴桃也是選自美味獼猴桃，果肉呈翠綠色，味香且質(zhì)地細(xì)膩[11]，抗逆性強，是目前綜合性狀最好的中早熟品種，經(jīng)濟效益顯著，廣受消費者歡迎[12]。當(dāng)前國內(nèi)外對“翠香”獼猴桃組織培養(yǎng)的研究尚未見報道，因此，本研究利用帶腋芽莖段為外植體，研究了“翠香”獼猴桃腋芽誘導(dǎo)、多代增殖、生根培養(yǎng)、馴化移栽的情況，建立了離體快繁體系，以期為“翠香”獼猴桃種質(zhì)資源的保存及優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自西峽縣獼猴桃種植基地，取健壯的幼嫩枝條用于組培試驗。

1.2 方法

1.2.1 取材時間、培養(yǎng)條件與消毒處理

取材時間為4—6月。培養(yǎng)條件為光照時間12 h/d，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度為1 500～2 000 Lx，下述所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0。將剪取的幼嫩枝條沖洗2 h，切為長約2～3 cm，帶1～2個腋芽的莖段，置于超凈工作臺，先用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2次，再用0.1%升汞消毒7 min，無菌水沖洗5次，放于無菌濾紙上吸干表面水分，接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 莖段腋芽的誘導(dǎo)

帶腋芽莖段經(jīng)消毒處理后接種，莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS，添加6-BA(2.0、3.0、4.0 mg/L)，NAA(0.1、0.2 、0.3 mg/L)，設(shè)9個處理，每個處理30瓶，每瓶1個莖段，重復(fù)3次，記錄帶腋芽莖段狀態(tài)變化，于30 d后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

選擇誘導(dǎo)出的健壯腋芽，切下接種至增殖培養(yǎng)基MS，添加6-BA(3.0、4.0、5.0 mg/L)，NAA(0.4、0.5 、0.6 mg/L)，設(shè)9個處理，每個處理30個芽，3次重復(fù)，50 d時記錄增殖系數(shù)。再選擇最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基，進行第二代、第三代增殖培養(yǎng)，30個芽，3次重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)，比較三代增殖系數(shù)的差異性。

1.2.4 生根培養(yǎng)

待芽長至2～4 cm時，切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為1/2MS，分別含有不同濃度(0.7、0.9、1.1 mg/L)NAA、IBA，設(shè)6個處理，每個處理接種30個芽，重復(fù)3次，密切觀察生根情況，40 d后記錄生根率、根數(shù)和根長。

1.2.5 馴化移栽

生根培養(yǎng)得到的長勢優(yōu)良的幼苗放到自然環(huán)境條件下放置3～5 d，再開蓋馴化2 d，定時進行葉片噴水保濕。然后，從瓶中取出組培苗，用清水洗凈培養(yǎng)基，移栽到細(xì)砂土中，定時淋水，移栽20株，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出芽的莖段(葉片、葉柄)數(shù)/接種的莖段(葉片、葉柄)總數(shù)×100%

增殖系數(shù)=誘導(dǎo)后不定芽總數(shù)/原接種芽數(shù)

生根率(%)=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%

移栽成活率(%)=存活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100%

運用Excel 2019整理數(shù)據(jù)，運用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽誘導(dǎo)

“翠香”獼猴桃?guī)б秆壳o段培養(yǎng)7 d左右，基部切口會略肥大，14 d左右莖段基部切口處出現(xiàn)愈傷組織，呈淺綠色。由表1可知，“翠香”獼猴桃的腋芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加，在NAA濃度為0.1 mg/L時，呈現(xiàn)為“低—高—低”，在NAA濃度為0.2、0.3 mg/L時，逐漸降低；當(dāng)6-BA濃度一定時，隨NAA濃度的升高，6-BA的濃度為2.0 mg/L時，誘導(dǎo)率呈現(xiàn)為逐步升高，6-BA的濃度為3.0、4.0 mg/L時，逐漸降低；在6-BA的濃度為2.0 mg/L、NAA的濃度為0.3 mg/L時，腋芽誘導(dǎo)率達到最高88.89%，其次是6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L時，達到87.78%，接著是6-BA 3.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L時，達83.33%，三者間在0.05水平上無顯著差異，但與其余處理相比存在顯著差異；誘導(dǎo)率最低的是6-BA 4.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L，僅3.33%，莖段多褐化。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對“翠香”獼猴桃莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

從表2方差分析可以看出，在“翠香”獼猴桃莖段腋芽誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞分裂素6-BA對誘導(dǎo)率影響最大，其F值270.279，在0.01水平達到顯著，6-BA、NAA、6-BA與NAA組合均在0.01水平顯著影響誘導(dǎo)率。結(jié)合表1，篩選出“翠香”獼猴桃莖段腋芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L，誘導(dǎo)效果良好(見圖1)。

表2 “翠香”獼猴桃莖段腋芽誘導(dǎo)的方差分析

圖1 “翠香”獼猴桃莖段腋芽萌發(fā)

2.2 增殖培養(yǎng)

在增殖培養(yǎng)過程中，觀察到有些生長狀態(tài)良好的芽在接種1周左右就會長出少量的愈傷組織，在接種后的第14 d會發(fā)現(xiàn)愈傷組織上長出了芽點。接種后3周左右會發(fā)現(xiàn)所有不定芽的基部都會形成愈傷組織塊且有大量的芽點產(chǎn)生。30～40 d，之前觀察到的不定芽點會長成健壯的不定芽，葉和莖也都有適當(dāng)?shù)姆只?見圖2：左)。在40～50 d時叢生芽基本上不會繼續(xù)增殖，只有葉和莖會繼續(xù)生長。50 d以后，部分芽會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。表3呈現(xiàn)的是50 d時記錄的接種芽增殖情況，由表3可以看出，7號植物生長調(diào)節(jié)劑組合的試驗結(jié)果最好，增殖系數(shù)為6.20，其培養(yǎng)瓶內(nèi)的叢生芽莖葉分化適中，長勢好，與其他增殖系數(shù)在0.05水平上差異顯著；3號植物生長調(diào)節(jié)劑組合的增殖系數(shù)最低，為2.11，培養(yǎng)瓶中的芽黃、畸形且只有個別芽增殖。試驗結(jié)果表明，當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增大；當(dāng)NAA濃度為0.5、0.6 mg/L時，增殖系數(shù)也隨6-BA濃度的增加而增大，但其增殖系數(shù)的最大值均小于NAA為0.4 mg/L時的最大值，故增殖系數(shù)在6-BA為5 mg/L時取得最大值。當(dāng)6-BA的濃度一定時，增殖系數(shù)隨NAA濃度的增加而減小，可見，NAA濃度為0.4 mg/L時適合“翠香”獼猴桃不定芽的增殖。因此，“翠香”獼猴桃不定芽增殖的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.4 mg/L。

圖2 “翠香”獼猴桃增殖培養(yǎng)

表3 不同濃度組合的6-BA、NAA對“翠香”獼猴桃不定芽增殖的影響

選擇MS+ 6-BA 5 mg/L+NAA 0.4 mg/L培養(yǎng)出來的芽，繼續(xù)進行第2代、第3代增殖。試驗中發(fā)現(xiàn)，第2代增殖的芽長勢正常，大部分芽可清晰觀察，增殖效果較好(見圖2：中)，第3代增殖芽大多數(shù)都長勢好，葉片平展(見圖2：右)，只有個別葉片卷曲，稍有畸形。由圖3可知，培養(yǎng)3代的增殖系數(shù)在0.05水平上無顯著差異，第2代繼代培養(yǎng)的增殖系數(shù)略高于第1代的，到第3代時略有下降，但總體上增殖系數(shù)比較穩(wěn)定。

圖3 “翠香”猴猴桃3次繼代增殖的差異比較

2.3 生根培養(yǎng)

由表4可知， NAA或IBA單獨作用時，“翠香”獼猴桃芽的生根率均較高，最高的是IBA 1.1 mg/L處理，達95.56%；其次是IBA 0.9 mg/L，達94.44%；最低的是NAA 0.7 mg/L，為86.67%，所有處理的生根率無顯著差異。根數(shù)最多的為IBA 0.9 mg/L處理，達11.40條，與其余5個處理有顯著差異，其余5個處理根數(shù)間無顯著差異，根數(shù)最少的為NAA 1.1 mg/L，根數(shù)的變化隨IBA或NAA濃度的升高先增后減。根長最長的處理為IBA 0.9 mg/L，平均長度為2.94 cm，除IBA 0.7 mg/L處理的根長外，顯著長于其他處理，而IBA 0.7 mg/L根長的平均長度為2.69 cm，兩者有一定差距，根長最短處理為NAA 0.7 mg/L，平均長度為2.30 cm，根長的變化也是隨IBA或NAA濃度的升高先增后減。綜上所述，篩選出“翠香”獼猴桃生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.9 mg/L，生根效果良好(見圖4)。

圖4 “翠香”獼猴桃的生根培養(yǎng)

表4 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對“翠香”獼猴桃生根的影響

2.4 馴化移栽

移栽30 d后統(tǒng)計，“翠香”獼猴桃組培苗的移栽成活率為(88.33±7.63)%，長勢健壯(見圖5，圖6)。

圖5 “翠香”獼猴桃移栽30 d后的根系

圖6 “翠香”獼猴桃移栽30 d后的苗

3 討論

在已報道的獼猴桃組織培養(yǎng)中，除了莖段，葉片[13]、葉柄[14]、花藥[15]等培養(yǎng)也有報道，而帶腋芽莖段培養(yǎng)是離體快繁最有效、遺傳最穩(wěn)定的途徑。本研究采用“翠香”獼猴桃的帶腋芽莖段為外植體，腋芽誘導(dǎo)率為88.89%，與源自美味獼猴桃的其他品種相比[16-17]，誘導(dǎo)率略低，說明“翠香”獼猴桃莖段腋芽誘導(dǎo)有待進一步優(yōu)化。經(jīng)過方差分析，發(fā)現(xiàn)6-BA對腋芽誘導(dǎo)影響最大，NAA也有顯著影響，兩者共同作用于腋芽誘導(dǎo)，但當(dāng)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過高時，誘導(dǎo)效果很差。這與隆前進等[18]在“紅陽”獼猴桃中、楊迪等[19]在“楊氏金紅50號”中的研究結(jié)果一致，因此，植物生長調(diào)節(jié)劑配比決定著初代培養(yǎng)是否成功。

增殖培養(yǎng)基中，6-BA、NAA組合能有效促進叢生芽形成，最高增殖系數(shù)為6.20，與其他研究有一定差異。隆前進等[18]培養(yǎng)“紅陽”的最高增殖系數(shù)為4.5，吳秀華等[20]培養(yǎng)“海沃德”的最高增殖系數(shù)為6.38，張艷玲等[21]培養(yǎng)“秦美”獼猴桃的最高增殖系數(shù)為6.43?？梢姡煌贩N獼猴桃進行組織培養(yǎng)的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合是不同的，這與基因型的不同關(guān)系很大。本研究在做了3代增殖后發(fā)現(xiàn)，增殖系數(shù)第3代有降低，個別葉片出現(xiàn)畸形。趙芮[22]以軟棗獼猴桃組培苗為材料進行繼代增殖，發(fā)現(xiàn)其最佳的增殖周期為40 d，當(dāng)繼代的時間大于40 d時，增殖系數(shù)降低，葉片開始失綠、畸形甚至脫落。最佳的繼代次數(shù)為6次，在第3～5次時，增殖系數(shù)逐漸增大，在第6次時增殖系數(shù)達到最大值，在第7～9次時，增殖系數(shù)逐漸降低，叢生芽生長變慢，葉片卷曲且畸形較多；張玉杰[23]以狗棗獼猴桃為材料做了7代繼代培養(yǎng)，在1～5代時增殖系數(shù)會逐漸增加，不定芽長勢健壯，葉片平展，6～7代時葉片開始出現(xiàn)卷曲、畸形，增殖系數(shù)降低。本次試驗的增殖周期為40 d，與趙芮[22]、張玉杰[23]所得的結(jié)論一樣，多代增殖效果的差異再次說明基因型的不同影響著獼猴桃的組織培養(yǎng)效果。

生根培養(yǎng)在組織培養(yǎng)中直接影響組培苗的移栽成活率?！?/2MS+IBA”對獼猴桃生根效果顯著。黃勝男等[24]所做的“金魁”獼猴桃的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+ IBA 0.7 mg/L”；呂海燕等[25]所做的“東紅”獼猴桃的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+ IBA 0.5 μg/mL”；本研究得出的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+ IBA 0.9 mg/L”，生根率、根數(shù)、根長均表現(xiàn)良好，移栽30 d后的苗根系明顯更加健壯發(fā)達。因此，本研究可為“翠香”獼猴桃種苗快繁提供技術(shù)支持。