郭文,劉凌云,李軒,孟丁丁,孟麗,穆麗英,張彥杰,楊敏生

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2衡水市中心苗圃場(chǎng), 河北 衡水 053000)

白蠟(FraxinuschinensisRoxb.)為木犀科白蠟屬植物，因樹(shù)上放養(yǎng)白蠟蟲(chóng)，故取名白蠟[1]。木犀科白蠟在全世界約有65 種，目前我國(guó)已見(jiàn)約30種，其中國(guó)外引進(jìn)約有10余種，北自我國(guó)東北中南部，經(jīng)黃河流域、長(zhǎng)江流域，南達(dá)廣東、廣西，東南至福建，西至甘肅均有分布，遍及各省區(qū)[2-3]。中國(guó)有白蠟屬植物27種，1 種變種，1 種栽培種，約占世界總數(shù)的30%，其他引種未記錄，屬于試驗(yàn)性栽培種。白蠟樹(shù)枝葉繁茂、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、干形通直、樹(shù)形美觀、對(duì)于不良環(huán)境表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)力，是我國(guó)北方地區(qū)防風(fēng)固沙、城鎮(zhèn)綠化美化、生態(tài)建設(shè)的優(yōu)良樹(shù)種，具備較高的生態(tài)經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。

低溫對(duì)植物生命活動(dòng)具有一定的限制作用，阻礙植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，不同植物甚至同種植物的抗寒性不同，植物抗寒性研究是植物抗逆性研究的重要組成部分，如何準(zhǔn)確判定植物的抗寒性是如今抗寒工作研究的主要內(nèi)容，對(duì)植物抗寒性進(jìn)行正確判斷，對(duì)植物栽培與推廣、跨地區(qū)引種等具有重要意義。目前，對(duì)白蠟研究主要集中在耐鹽堿、培育及造林技術(shù)、遺傳育種等方面，低溫對(duì)于白蠟?zāi)芊裾ＩL(zhǎng)乃至能否成活具有重大影響，研究白蠟的抗寒性對(duì)白蠟的良種選育及栽培具有重要意義[5-7]。

白蠟應(yīng)對(duì)低溫做出的反應(yīng)機(jī)理十分復(fù)雜，且影響白蠟抗寒性的因素眾多，僅使用一個(gè)指標(biāo)對(duì)白蠟的抗寒性作評(píng)價(jià)不夠全面[8-9]。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，此次試驗(yàn)中，采用電導(dǎo)法、電阻抗圖譜法2 種方法相結(jié)合，對(duì)8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行抗寒性分析，配合Logistic 方程求算出半致死溫度，綜合2 種方法的結(jié)果評(píng)定白蠟優(yōu)良無(wú)性系的抗寒性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)為河北省衡水市中心苗圃場(chǎng)。衡水屬大陸季風(fēng)氣候區(qū)，為溫暖半干旱型。氣候特點(diǎn)是四季分明，冷暖干濕差異較大。夏季受太平洋副高邊緣的偏南氣流影響，潮濕悶熱，降水集中，冬季受西北季風(fēng)影響，氣候干冷，雨雪稀少，春季干旱少雨多風(fēng)增溫快，秋季多秋高氣爽天氣，有時(shí)有連陰雨天氣發(fā)生。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自衡水市中心苗圃場(chǎng)白蠟優(yōu)良無(wú)性系2 a生測(cè)定林，從該測(cè)定林中分別采集8個(gè)不同無(wú)性系位置相同，長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲(chóng)害的1 a生枝條，每個(gè)無(wú)性系采集15根枝條備用。用無(wú)毒塑料袋包裹，并于24 h內(nèi)運(yùn)送至測(cè)試實(shí)驗(yàn)室。

1.3 材料處理

將采集帶回的枝條浸入去離子水中，進(jìn)行多次清洗，表面水分晾干后，選粗細(xì)均勻的枝條避開(kāi)節(jié)間芽眼剪成2 cm左右的枝段，每4個(gè)枝段為1組，共挑選出11組，供電導(dǎo)法重復(fù)3次，電阻抗法重復(fù)8次使用。以組為單位將他們放入自封袋，置于變溫冰箱冷凍層中，設(shè)置9個(gè)溫度梯度(0 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-15 ℃、-20 ℃、-25 ℃、-30 ℃、-35 ℃、-40 ℃)，其中0 ℃為對(duì)照，每小時(shí)的降溫幅度為4 ℃。到達(dá)相應(yīng)溫度保持24 h后，再將所有枝條放置0 ℃進(jìn)行解凍，待解凍24 h后，對(duì)枝條進(jìn)行抗寒性測(cè)定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 電導(dǎo)法 將隨機(jī)選出的供試枝條避開(kāi)芽眼剪成長(zhǎng)約1～1.5 cm的枝段，將小段置于盛有10 mL去離子水的試管中(若枝段較粗無(wú)法放入試管則可將枝條縱切為幾個(gè)較細(xì)枝段)，用封口膜封緊瓶口，室溫下于搖床上震蕩24 h，測(cè)定初電導(dǎo)率，測(cè)好后，再次封口，將試管置于100 ℃水浴鍋中30 min，再于室溫下的搖床上震蕩24 h，測(cè)定其終電導(dǎo)率，然后記錄并計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率。

1.4.2 電阻抗圖譜法 參照張鋼等的方法，待試材料的處理與電導(dǎo)法相同，選取長(zhǎng)勢(shì)粗細(xì)均勻的枝條，避開(kāi)芽眼剪取靠近枝條中間的1.5 cm 的枝段，在其中隨機(jī)選出8段作為樣品，供電阻抗法8次重復(fù)[10]。用測(cè)厚儀測(cè)量每段的直徑，在電阻抗分析儀上設(shè)定頻率為80～1 MHz，輸入電壓為20 mV，然后將枝條置于2個(gè)玻璃電極管之間，通過(guò)電極線(xiàn)接入凝膠，之后對(duì)其進(jìn)行開(kāi)路和短路矯正，測(cè)定每一個(gè)枝段的電阻抗參數(shù)值，與Logistic 方程擬合半致死溫度，記錄并繪圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5 對(duì)8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率、電阻抗參數(shù)值，配合Logistic 方程[y(x)=a/(1+eb(c-x))+d]擬合半致死溫度并計(jì)算半致死溫度，對(duì)求出的半致死溫度進(jìn)行方差分析和顯著性分析，利用Excel 統(tǒng)計(jì)萌芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率變化

不同低溫處理下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率變化情況見(jiàn)表1。

表1 8個(gè)白蠟無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率變化Table 1 The relative conductivity changes of 8 Fraxinus clones

由表1可知，同一無(wú)性系，不同溫度時(shí)，隨著溫度的降低，8個(gè)白蠟無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)，其中衡蠟2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)和9號(hào)呈緩慢上升趨勢(shì)，衡蠟1號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和11號(hào)在0～-30 ℃區(qū)間內(nèi)上升較為緩慢，當(dāng)溫度下降到-35～-40 ℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度較大。8個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系在0～-40 ℃區(qū)間內(nèi)，相對(duì)電導(dǎo)率均有顯著差異；在同一溫度，不同無(wú)性系時(shí)，8個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系在-10 ℃、-20 ℃時(shí)，無(wú)明顯差異，在0 ℃、-5 ℃、-15 ℃、-25 ℃、-30℃、-35℃、-40℃差異顯著。

由電導(dǎo)率擬合的8 個(gè)白蠟無(wú)性系的半致死溫度見(jiàn)表2。

由表2 可知，根據(jù)相對(duì)電導(dǎo)率擬合出8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的半致死溫度由低到高的順序依次為衡蠟2 號(hào)、衡蠟9 號(hào)、衡蠟7 號(hào) 、衡蠟11 號(hào)、衡蠟3 號(hào)、衡蠟6 號(hào)、衡蠟4 號(hào)、衡蠟1 號(hào)。衡蠟2 號(hào)的半致死溫度最低，為-21.64 ℃，衡蠟1 號(hào)的半致死溫度最高，為-38.21 ℃。

表2 電導(dǎo)率法擬合的8 個(gè)白蠟無(wú)性系的半致死溫度Table 2 Half-lethal temperature of 8 Fraxinus clones fitted by electrical conductivity method

2.2 不同低溫處理下各無(wú)性系電阻抗參數(shù)變化

2.2.1 胞內(nèi)電阻率 不同低溫處理下各無(wú)性系胞內(nèi)電阻率變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理溫度下8 個(gè)白蠟無(wú)性系的胞內(nèi)電阻率變化Figure 1 Changes of intracellular resistivity of eight Fraxinus clones under different treatment temperatures

由圖1可知，隨著溫度的降低，8個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的胞內(nèi)電阻率呈顯著上升趨勢(shì)，衡蠟4 號(hào)、1 號(hào)及6 號(hào)，上升幅度較其他白蠟無(wú)性系明顯，衡蠟4 號(hào)上升幅度最大，衡蠟2 號(hào)的胞內(nèi)電阻率變化幅度最小，8 個(gè)白蠟無(wú)性系的胞內(nèi)電阻率在在-5～-40 ℃區(qū)間內(nèi)，胞內(nèi)電阻率與對(duì)照(0 ℃)產(chǎn)生顯著差異，-25～-30 ℃區(qū)間內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度下降到-35～-40 ℃時(shí)，胞內(nèi)電阻率趨于平穩(wěn)。說(shuō)明在-5～-20 ℃時(shí)，植物體各部分受低溫危害情況較為一致，當(dāng)溫度下降到-25 ℃及以下時(shí)，植物體受損較為嚴(yán)重。

2.2.2 胞外電阻率 不同低溫處理下各無(wú)性系胞外電阻率變化情況見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理溫度下8 個(gè)白蠟無(wú)性系的胞外電阻率變化Figure 2 Changes of extracellular resistivity of eight Fraxinus clones under different treatment temperatures

由圖2可知，隨著溫度的降低，8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的胞外電阻率均呈顯著下降趨勢(shì)，衡蠟9 號(hào)的胞外電阻率變化幅度最大，衡蠟1 號(hào)變化幅度最小，-5～-40 ℃間8 個(gè)溫度與對(duì)照均存在顯著差異，在0～-15 ℃時(shí)，下降趨勢(shì)相對(duì)較為平穩(wěn)，當(dāng)溫度下降到-20～-30 ℃時(shí)，下降幅度明顯，在-35～-40 ℃時(shí)，胞外電阻率下降幅度趨于平穩(wěn)，說(shuō)明自-20 ℃開(kāi)始，植物體受低溫影響逐漸加大，隨著溫度的不斷降低，植物體受危害程度逐漸加大。

2.2.3 弛豫時(shí)間分布系數(shù) 不同低溫處理下各無(wú)性系弛豫時(shí)間分布系數(shù)變化情況見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理溫度下8 個(gè)白蠟無(wú)性系的弛豫時(shí)間分布系數(shù)變化Figure 3 Variation of relaxation time distribution coefficient of eight Fraxinus clones under different treatment temperatures

由圖3可知，隨著溫度的降低，8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的弛豫時(shí)間分布系數(shù)呈整體下降趨勢(shì)，在-5～-20 ℃區(qū)間內(nèi)8 個(gè)白蠟無(wú)性系無(wú)顯著變化，但與對(duì)照存在顯著差異，當(dāng)溫度下降到-25～-30 ℃時(shí)，下降趨勢(shì)較為明顯，衡蠟7 號(hào)下降幅度最大，衡蠟3 號(hào)下降幅度較小，說(shuō)明在-5～-20 ℃時(shí)，白蠟各無(wú)性系受低溫脅迫程度在可接受范圍以?xún)?nèi)，但當(dāng)溫度下降到-25～-30 ℃時(shí)，白蠟受低溫危害較為嚴(yán)重，超過(guò)-30 ℃時(shí)，植物體處于死亡狀態(tài)。

8 個(gè)白蠟無(wú)性系通過(guò)不同電阻抗指標(biāo)擬合的半致死溫度見(jiàn)表3。

由表3可知，8個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系根據(jù)胞外電阻率擬合出的半致死溫度由低到高為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)；根據(jù)胞內(nèi)電阻率擬合出的半致死溫度由低到高為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)；根據(jù)弛豫時(shí)間分布系數(shù)擬合出的半致死溫度為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)。運(yùn)用電阻抗圖譜法得到的8個(gè)白蠟無(wú)性系的胞外電阻率、胞內(nèi)電阻率及弛豫時(shí)間分布系數(shù)這3個(gè)參數(shù)擬合出的半致死溫度由低到高的排列順序相同。

表3 8個(gè)白蠟無(wú)性系通過(guò)不同電阻抗指標(biāo)擬合的半致死溫度Table 3 Half-lethal temperature of eight Fraxinus clones fitted by different electrical impedance indexes

利用8 個(gè)白蠟優(yōu)良無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率、胞外電阻率、胞內(nèi)電阻率及弛豫時(shí)間分布系數(shù)擬合出的半致死溫度相關(guān)性見(jiàn)表4。

表4 8個(gè)白蠟無(wú)性系各抗寒指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of cold resistance indexes of eight Fraxinus clones

由表4可知，相對(duì)電導(dǎo)率與胞外電阻率呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.873，胞內(nèi)電阻率與相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.944，胞內(nèi)電阻率與胞外電阻率呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.897，弛豫時(shí)間分布系數(shù)與相對(duì)電導(dǎo)率、胞外電阻率及胞內(nèi)電阻率均呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.931、0.930、0.970。

3 結(jié)論與討論

選用電導(dǎo)法配合Logistic方程擬合出半致死溫度是評(píng)價(jià)植物抗寒性的常用方法[11]。試驗(yàn)中隨著溫度的逐步降低，8個(gè)白蠟無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)，由相對(duì)電導(dǎo)率擬合出的8個(gè)白蠟無(wú)性系的半致死溫度由高到低依次為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)。

相對(duì)電導(dǎo)率的變化與滲出細(xì)胞液的濃度相關(guān)，細(xì)胞膜遭受的破壞越嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲越多，其相對(duì)電導(dǎo)率就越高。有研究顯示，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲含量高低可作為評(píng)定植物抗寒性的指標(biāo)[11]。相對(duì)電導(dǎo)率越高，植物的抗寒性越差[13]。王明逸等用電導(dǎo)法鑒定了法國(guó)梧桐的抗寒性，得出溫度越低法國(guó)梧桐枝條的相對(duì)電導(dǎo)率越高,與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符[14]。說(shuō)明在溫度持續(xù)下降的過(guò)程中，細(xì)胞不斷調(diào)節(jié)自身狀態(tài)適應(yīng)低溫環(huán)境，一旦溫度超過(guò)了細(xì)胞的承受限度，細(xì)胞受到的損傷便無(wú)法恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物溢出，相對(duì)電導(dǎo)率迅速上升。

電阻抗法是一種無(wú)須破壞植物細(xì)胞、操作簡(jiǎn)易的檢測(cè)植物抗寒性的有效方法，其運(yùn)用機(jī)理也是通過(guò)展現(xiàn)植物細(xì)胞在低溫環(huán)境細(xì)胞膜的透性變化，來(lái)反映植物的抗寒性[15]。植物在受到低溫危害時(shí)，細(xì)胞膜因受到凍害而破裂，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，使胞外電阻率呈逐漸下降趨勢(shì)，胞內(nèi)電阻率呈升高趨勢(shì)，如植物受低溫危害較為嚴(yán)重時(shí)，植物體經(jīng)過(guò)再長(zhǎng)時(shí)間也無(wú)法恢復(fù)到正常的生命活動(dòng)，導(dǎo)致弛豫時(shí)間分布系數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì)，但因低溫對(duì)3個(gè)電阻抗參數(shù)影響方式不一致，故而導(dǎo)致由3個(gè)電阻抗參數(shù)擬合出的半致死溫度存在不一致的情況。

由3個(gè)電阻抗參數(shù)擬合出的8個(gè)白蠟無(wú)性系的半致死溫度由高到低依次為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)，與電導(dǎo)法得到的順序相同。電阻抗圖譜法具有多個(gè)參數(shù)，針對(duì)不同植物的抗寒性檢測(cè)，最適宜參數(shù)也都不同。董軍生等在用電阻抗法測(cè)定楊樹(shù)無(wú)性系抗寒性時(shí)認(rèn)為，胞外電阻率是測(cè)定白楊抗寒性的適用參數(shù)[16]。錢(qián)稷等通過(guò)研究桃樹(shù)的抗寒性發(fā)現(xiàn)胞外電阻率、胞內(nèi)電阻率、弛豫時(shí)間、弛豫時(shí)間分布系數(shù)，都能夠很好地反映桃樹(shù)的抗寒性，但胞內(nèi)電阻率是最適宜的參數(shù)[17]。張振東等認(rèn)為，胞外電阻率和弛豫時(shí)間是檢測(cè)棗樹(shù)抗寒性的較合適參數(shù)[7]。研究中發(fā)現(xiàn)，弛豫時(shí)間分布系數(shù)與相對(duì)電導(dǎo)率、胞外電阻率及胞內(nèi)電阻率均成極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.931、0.930、0.970,弛豫時(shí)間分布系數(shù)可作為測(cè)定白蠟抗寒性的最佳參數(shù)。

使用電導(dǎo)法測(cè)得的8個(gè)白蠟無(wú)性系的抗寒性由高到低依次為衡蠟2號(hào)、衡蠟9號(hào)、衡蠟7號(hào)、衡蠟11號(hào)、衡蠟3號(hào)、衡蠟6號(hào)、衡蠟4號(hào)、衡蠟1號(hào)，與電阻抗法運(yùn)用不同參數(shù)測(cè)得的結(jié)果均相符，但電導(dǎo)法測(cè)得的半致死溫度比電阻抗法測(cè)得的要低，抗寒性要高，這與張軍等的研究結(jié)果相符。但2種方法的測(cè)定結(jié)果差異還需進(jìn)一步研究分析[18]。

試驗(yàn)過(guò)程只能模擬白蠟在特定實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下所受的低溫脅迫，擬合得出的半致死溫度隨著時(shí)間及處理的不同也會(huì)相應(yīng)不同，因此不能完全模擬白蠟在自然環(huán)境中的狀態(tài)，試驗(yàn)所得出的半致死溫度不能代表白蠟的實(shí)際忍受溫度，僅可用于不同無(wú)性系間抗寒性的相對(duì)比較。