吳曉昊 陶楚 姚青 伏學(xué)坤 梁超 曹惠玲肖國芝

Kindlin 家族蛋白是能夠激活整合素胞內(nèi)區(qū)并參與粘著斑（focal adhesion）形成的一類蛋白[1-3]。在哺乳動物細(xì)胞中，共有三種Kindlin 蛋白，即分別由Fermt1、Fermt2 和Fermt3 基因編碼的Kindlin-1，2 和3[4-5]。雖然Kindlin 家族蛋白具有高度相似的結(jié)構(gòu)特征，但研究表明三種Kindlin 蛋白具有不同的組織表達(dá)特異性[6]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示Kindlin家族蛋白可在多種器官組織中發(fā)揮重要功能[7-11]。目前已知Kindlin-1 主要表達(dá)于皮膚及小腸等上皮組織中[6，12]，然而Kindlin-1 在骨關(guān)節(jié)相關(guān)組織中的表達(dá)情況仍不清楚。本研究收集了健康及疾病狀態(tài)下的骨關(guān)節(jié)組織樣品，針對性研究了Kindlin-1 在健康及疾病狀態(tài)下在骨關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)情況及相關(guān)潛在功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要儀器及試劑

健康的SPF 級C57BL/6 和DB1/J 雄性小鼠用于實(shí)驗(yàn)，所有動物實(shí)驗(yàn)均通過南方科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理審核（SUSTC-JY2020120，SUSTech-JY2020202）。主要儀器：YB-6LF 石蠟包埋機(jī)、TST1200 包埋專用冷臺、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；RM2255 石蠟切片機(jī)（Leica 公司，德國）；SP8 共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher 公司，美國）；超凈工作臺（Thermo Fisher 公司，美國）。主要試劑：Kindlin-1 抗體（Sigma 公司，美國，SAB4200465）；CD31 抗體（Abcam 公司，美國，ab28364）；Endomucin 抗體（Abcam 公司，ab106100）；DMEM 培養(yǎng)基（Thermo Fisher 公司，美國，11965092）；胎牛血清（Thermo Fisher 公司，美國，16140071）；Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher 公司，美國，Cat#13778075）。

1.2 內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)定術(shù)誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

選取6 只2 月齡的健康C57BL/6 雄性小鼠，常規(guī)麻醉，于右下肢髕骨內(nèi)側(cè)行約1 cm 縱行切口，曲屈關(guān)節(jié)并使髕骨向外側(cè)脫位，從而暴露關(guān)節(jié)腔。用顯微鑷移除脂肪墊，并用顯微剪刀切斷內(nèi)側(cè)半月板，縫合切口。于左下肢行假手術(shù)作為對照，即只暴露關(guān)節(jié)腔，不切斷內(nèi)側(cè)半月板。造模后2 個月處死小鼠，分離兩側(cè)膝關(guān)節(jié)組織。

1.3 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎

選取12 只2 月齡的健康DBA1/J 雄性小鼠，簡單隨機(jī)分為模型組6 只和對照組6 只，常規(guī)麻醉，模型組小鼠于尾根部注射用不完全弗氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原0.1 mL，正常對照組同法、同部位注射0.1 mL 生理鹽水，造模后48 d處死小鼠，分離兩側(cè)踝關(guān)節(jié)組織。

1.4 組織學(xué)及免疫熒光分析

骨關(guān)節(jié)組織于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫鈣并石蠟包埋切片。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行Safranin O &Fast Green染色（Solarbio，Cat#G1371）。免疫熒光染色中，待分析切片樣品于0.2% Triton X-100 中穿透5 min，2%BSA 溶液中室溫封閉1 h，并于相應(yīng)一抗（1∶200）中4°C 過夜孵育，二抗（1∶200）室溫孵育1 h。隨后，在共聚焦顯微鏡（Leica SP8 Confocal Microsystems）下檢測熒光信號。

1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）于DMEM 培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中培養(yǎng)，細(xì)胞密度至80%時(shí)轉(zhuǎn)染Kindlin-1 siRNA，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine RNAiMAX，轉(zhuǎn)染條件參考試劑說明書。轉(zhuǎn)染后24 h 換液，細(xì)胞密度至100%進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，動態(tài)觀察劃痕后0、9、18、21 h 細(xì)胞向劃痕區(qū)域的遷移程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kindlin-1 表達(dá)于正常骨組織內(nèi)并與H 型血管共定位

首先分離2 月齡健康C57BL/6 小鼠的骨關(guān)節(jié)組織，石蠟切片并用Kindlin-1 抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果顯示在健康小鼠內(nèi)，骨關(guān)節(jié)表面軟骨組織中無Kindlin-1 表達(dá)（見圖1A 左）。Kindlin-1 陽性細(xì)胞主要分布于生長板礦化軟骨區(qū)域及臨近的骨髓腔內(nèi)（見圖1A 中），且陽性標(biāo)記信號多呈圓形血管樣分布（見圖1A 右）?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明生長板礦化軟骨及相鄰的骨髓腔內(nèi)主要分布有H 型血管[8]，所以筆者應(yīng)用CD31 和Endomucin 對H 型血管進(jìn)行標(biāo)記，并研究Kindlin-1 與H 型血管是否存在共定位。結(jié)果顯示，Kindlin-1與H 型血管存在顯著的共定位（見圖1B）。

2.2 DMM 模型中Kindlin-1 顯著升高并可特異性標(biāo)記異常新生血管

內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)定術(shù)（destabilization of the medial meniscus，DMM）可用于在動物模型中模擬骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程。筆者對2 月齡C57BL/6 小鼠進(jìn)行了DMM 手術(shù)，術(shù)后2 個月處死小鼠，分離膝關(guān)節(jié)組織，石蠟切片，并用Kindlin-1和CD31（血管標(biāo)志物）抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。結(jié)果顯示，在行假手術(shù)的對照骨關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)CD31 少量表達(dá)，且無Kindlin-1 表達(dá)（見圖2A）。在行DMM 手術(shù)后的骨關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)CD31 和Kindlin-1 的表達(dá)量顯著升高，且Kindlin-1與CD31 存在顯著的共定位（見圖2A-C）。在骨關(guān)節(jié)半月板組織中筆者也檢測到了相似的現(xiàn)象。在行假手術(shù)的對照半月板組織中，CD31 及Kindlin-1 均少量表達(dá)（見圖2D）；在行DMM 手術(shù)后的半月板組織中，CD31 與Kindlin-1 表達(dá)量均顯著升高且存在共定位（見圖2D-F）。以上結(jié)果提示了在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)Kindlin-1 表達(dá)顯著升高并可特異性標(biāo)記異常新生的血管。

2.3 CIA 模型中Kindlin-1 顯著升高并可特異性標(biāo)記異常新生血管

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）可用于在動物模型中模擬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程。筆者對2月齡DBA1/J 小鼠進(jìn)行膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，誘導(dǎo)48 d 后處死小鼠，分離踝關(guān)節(jié)組織，石蠟切片，并用Kindlin-1 和Endomucin（血管標(biāo)志物）抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。結(jié)果顯示，在對照骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)Endomucin少量表達(dá)，且無Kindlin-1表達(dá)（見圖3A）。在CIA 誘導(dǎo)后的骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)Endomucin和Kindlin-1 的表達(dá)量顯著升高，且Kindlin-1 與Endomucin存在顯著的共定位（見圖3A-C）。對Kindlin-1 和Endomucin陽性區(qū)域進(jìn)行組織學(xué)Safranin O&Fast Green 染色分析，結(jié)果顯示，在炎癥造成的軟骨肥大及異位骨化區(qū)域，Kindlin-1和Endomucin陽性信號主要分布于肥大軟骨細(xì)胞（Hypertrophic chondrocytes，HC）和新生的骨組織（Bone，B）的交界處（見圖3D）。以上結(jié)果提示了在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)Kindlin-1 表達(dá)顯著升高并可特異性標(biāo)記異常新生血管。

圖1 A.免疫熒光分析顯示健康C57BL/6 小鼠骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)Kindlin-1 的表達(dá)情況，左圖為關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域，中圖為生長板及臨近骨髓腔區(qū)域，右圖為高倍鏡下的骨髓腔區(qū)域；B.免疫熒光分析顯示骨髓腔內(nèi)Kindlin-1 與CD31 和Endomucin 共同標(biāo)記的H 型血管的表達(dá)情況

2.4 siRNA 敲除Kindlin-1 加強(qiáng)HUVECs 的體外遷移能力

為探索血管內(nèi)皮細(xì)胞是否表達(dá)Kindlin-1 蛋白，筆者應(yīng)用人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），檢測Kindlin-1 的表達(dá)量，結(jié)果顯示HUVECs 可以表達(dá)高水平的Kindlin-1（見圖4A）。為探索Kindlin-1 蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的潛在生物學(xué)功能，筆者構(gòu)建并篩選了針對Kindlin-1 的siRNA 序列（#1073、#1798 和#2987）并確認(rèn)了體外敲除效率，結(jié)果顯示siRNA 序列#1073 和#1798 均可有效降低Kindlin-1 在HUVECs 中的表達(dá)水平（見圖4A）。應(yīng)用篩選到的siRNA序列，筆者研究了敲除Kindlin-1 對HUVECs 的體外遷移能力的潛在影響。結(jié)果顯示，siRNA 敲除Kindlin-1 顯著地加強(qiáng)了HUVECs 的體外遷移能力（見圖4B-C）。

圖4 A.HUVECs 篩選針對Kindlin-1 的siRNA 序列；B.HUVECs 敲除Kindlin-1 后，體外進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力；C.劃痕遷移實(shí)驗(yàn)的量化數(shù)據(jù)

3 討論

目前已知Kindlin家族蛋白具有不同的組織表達(dá)特異性，Kindlin-1 主要表達(dá)于皮膚及小腸等上皮組織中。本研究首次發(fā)現(xiàn)Kindlin-1 表達(dá)于正常骨組織的骨髓腔內(nèi)，且與CD31和Endomucin 共同標(biāo)記的H 型血管具有顯著的共定位，提示了Kindlin-1 可能表達(dá)于骨髓腔的血管內(nèi)皮細(xì)胞中。

在骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病中，異常的血管新生（angiogenesis）均扮演重要角色。例如，在骨性關(guān)節(jié)炎中，異常應(yīng)力導(dǎo)致的軟骨下骨重塑會誘發(fā)異常的血管新生侵入軟骨下骨及軟骨組織，異常新生的血管帶來炎癥因子，破骨前體細(xì)胞等進(jìn)一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷及骨贅形成[13]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)滑膜組織過度增生，炎癥刺激異常的血管新生在關(guān)節(jié)區(qū)域形成血管翳。血管翳帶來的炎癥因子等可進(jìn)一步導(dǎo)致骨破壞[14]。為驗(yàn)證Kindlin-1與血管組織具有相關(guān)性的假設(shè)，筆者對兩種不同類型的關(guān)節(jié)炎動物模型骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)Kindlin-1 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在骨性關(guān)節(jié)炎模型和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，Kindlin-1 的表達(dá)水平均顯著升高，且均可特異性標(biāo)記模型中的異常形成的新生血管，提示了Kindlin-1 作為骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病中異常新生血管標(biāo)志物的潛在可能。

人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）是目前最為常用的研究血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的體外細(xì)胞模型。為取得Kindlin-1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的直接證據(jù)，筆者對人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）進(jìn)行了蛋白檢測，結(jié)果表明HUVECs 可表達(dá)高水平的Kindlin-1。為探索Kindlin-1 蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中的潛在角色，筆者篩選了體外敲除Kindlin-1 的siRNA 序列，并定量觀察敲除Kindlin-1對HUVECs 體外遷移能力的影響。結(jié)果表明敲除Kindlin-1顯著地加強(qiáng)了HUVECs 的體外遷移能力，提示了Kindlin-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能具有調(diào)控作用。值得注意的是，筆者首先發(fā)現(xiàn)了骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)Kindlin-1 表達(dá)與血管組織有高度相關(guān)性，且在血管新生增強(qiáng)的關(guān)節(jié)病變組織中顯著升高，這使我們假設(shè)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Kindlin-1 會影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)功能。出人意料的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Kindlin-1 顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移能力，提示了Kindlin-1 在血管新生中可能扮演著抑制因子的角色，其升高可能是血管新生過程中的伴隨結(jié)果而非起因。同時(shí)，雖然人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞是目前最為常用的研究血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)功能的體外細(xì)胞模型，其是否能在體外環(huán)境模擬骨關(guān)節(jié)病變組織內(nèi)異常的血管新生過程仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步設(shè)計(jì)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Kindlin-1 在生理病理?xiàng)l件中的相關(guān)功能。

本實(shí)驗(yàn)初步探索了Kindlin-1 在骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)的表達(dá)情況及功能，提示了Kindlin-1 作為血管組織標(biāo)志物及潛在靶點(diǎn)的可能性。然而，目前仍缺乏活體動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證Kindlin-1在血管新生過程中的作用和相關(guān)機(jī)制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物以研究Kindlin-1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的功能及其在活體環(huán)境下與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步探索研究。