肖亞男，馬建飛，游鑫，隋森芳?

①南方科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518055；②清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)之一，光合作用的第一步便是光能的吸收與傳遞[1-2]。為了有效地吸收光能，生活在不同環(huán)境中的生物進(jìn)化出各種捕光系統(tǒng)[3]，其中捕光復(fù)合體(light-harvesting complexes, LHCs)主要存在于綠藻和高等植物中，而藻膽體(phycobilisome, PBS)是位于藍(lán)藻和紅藻類(lèi)囊體膜基質(zhì)側(cè)表面的大型水溶性捕光復(fù)合體，分子量為3～18 MDa[4-8]。

藻膽體能吸收較寬范圍波長(zhǎng)(490～650 nm)的光能，將能量傳遞給光合作用的反應(yīng)中心，繼而驅(qū)動(dòng)光合電子傳遞[9-11]。藻膽體的吸收光譜恰好與葉綠素a (最大吸收為440 nm和670 nm)互補(bǔ)，使得藻類(lèi)在幾乎整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)都有光吸收[9-10]。由于水中的光照條件不同，例如深水區(qū)充滿了藍(lán)綠色的光，藻膽體的捕光能力對(duì)于水生生物十分重要[12]。

最初，科研人員在紅藻Porphyridium cruentum的類(lèi)囊體膜基質(zhì)側(cè)發(fā)現(xiàn)一些小顆粒，并且在層狀膜上具有高度有序的空間排列，經(jīng)過(guò)生化分析、電子顯微鏡觀察及分離純化等研究，證明這些小顆粒主要由3種藻膽蛋白組成，因此后來(lái)將其命名為藻膽體[13-15]。

目前研究者發(fā)現(xiàn)主要存在以下幾種形狀的藻膽體：半圓盤(pán)形(存在于許多藍(lán)藻中)[6,16]、半橢圓形(存在于許多紅藻中)[6,17]、塊型[8,18]和束型[19]。另外，還在含有葉綠素d的藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)一種不常見(jiàn)的桿狀藻膽體[20-21]。

自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)藻膽體以來(lái)，藻膽體的結(jié)構(gòu)研究歷程主要分為以下三個(gè)階段[22]：20世紀(jì)90年代之前主要通過(guò)負(fù)染透射電鏡進(jìn)行藻膽體的低分辨形態(tài)學(xué)研究；90年代中期至21世紀(jì)初，主要通過(guò)X射線晶體學(xué)進(jìn)行藻膽體的組分——藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、連接蛋白等的晶體結(jié)構(gòu)研究，代表性成果為我國(guó)科學(xué)家梁棟材課題組等解析的紅藻Polysiphonia urceolata的R-PC的2.4 ?[23]和R-PE的1.9 ?晶體結(jié)構(gòu)[24]，以及張玉忠、吳嘉煒課題組合作解析的藍(lán)藻Synechocystis sp. PCC 6803 LR的N末端的1.9 ?晶體結(jié)構(gòu)等[25]；21世紀(jì)初，隨著單顆粒冷凍電鏡等生物物理技術(shù)的發(fā)展，利用三維重構(gòu)解析藻膽體高分辨結(jié)構(gòu)成為可能。我們課題組與中國(guó)科學(xué)院植物研究所匡廷云院士課題組較早開(kāi)展這方面工作，合作解析了第一個(gè)藍(lán)藻Nostoc flagelliforme藻膽體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)[26]。之后，我們課題組與北京大學(xué)趙進(jìn)東院士課題組合作完成了另一株藍(lán)藻Anabaena sp. strain PCC 7120的負(fù)染電鏡三維重構(gòu)[27]。然而，由于當(dāng)時(shí)冷凍電鏡條件和單顆粒三維重構(gòu)方法等的限制，以上兩個(gè)藍(lán)藻結(jié)構(gòu)只解析到中等分辨率。在長(zhǎng)期探索的基礎(chǔ)之上，隨著2013年以來(lái)冷凍電鏡技術(shù)的突破，我們課題組選擇兩種紅藻——Griffithsia pacifica(太平洋凋毛藻)和Porphyridium purpureum(紫球藻)為研究對(duì)象解析了兩種藻膽體的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率分別為3.5 ?和2.8 ?[8,28]。兩種紅藻的藻膽體結(jié)構(gòu)相似，而P. purpureum的藻膽體分辨率更高，因而我們將主要以此來(lái)介紹藻膽體的結(jié)構(gòu)及特征。

1 藻膽體的亞基組成及性質(zhì)

藻膽體是一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的超級(jí)復(fù)合體，由藻膽蛋白(phycobilinproteins, PBPs)和連接蛋白(linker protein)兩種組分組成。

1.1 藻膽蛋白

藻膽體中藻膽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%左右，結(jié)合色素，主要用于捕獲光能。藻膽蛋白有兩個(gè)同源亞基α和β，每個(gè)亞基的分子量為15～20 kDa (160～165個(gè)氨基酸)。α和β亞基形成一個(gè)異源二聚體(αβ)，通常稱(chēng)為(αβ)單體，隨后主要通過(guò)疏水作用力組裝成穩(wěn)定的(αβ)3三聚體，作為藻膽體逐級(jí)組裝的基本單位[6,29]。通常每個(gè)亞基結(jié)合1～3個(gè)開(kāi)鏈四吡咯環(huán)的藻膽色素，色素A環(huán)或D環(huán)通過(guò)硫醚鍵與序列保守的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合[26,30]。水溶性藻膽蛋白占細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的一半以上，同時(shí)也可作為氮源儲(chǔ)存[31-32]。

存在于紅藻G. pacifica和P. purpureum藻膽體中的色素有藻紅膽素(PEB)、藻尿膽素(PUB)和藻藍(lán)膽素(PCB)三種，其中PUB是PEB的雙鍵異構(gòu)體[9]。色素的雙鍵共軛變化導(dǎo)致色素能級(jí)的改變，使它們吸收不同波長(zhǎng)的光并按能量從高到低傳遞。

根據(jù)色素能級(jí)不同，可以將藻膽蛋白分為以下幾種：藻紅蛋白(PE)，位于桿的遠(yuǎn)核端，結(jié)合PEB，同時(shí)也可以結(jié)合PUB，吸收490～550 nm的藍(lán)光、綠光和黃光；藻藍(lán)蛋白(PC)，位于桿的近核端，結(jié)合PEB和PCB，吸收620～630 nm的紅光；別藻藍(lán)蛋白(APC)，是核的主要成分，結(jié)合PCB，吸收650 nm的紅光[4,33-34]。α和β亞基在PC、PE和APC之間也是同源的[16]，因此，雖然不同藻膽蛋白具有不同的吸收光譜，但它們具有相似的晶體結(jié)構(gòu)[27,35-36]。

核APC有幾種特殊的亞基，氨基酸序列發(fā)生變化，如αLCM(LCM的類(lèi)αAPC結(jié)構(gòu)域，由apcE基因編碼，LCM包括結(jié)合色素的αLCM結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)linker結(jié)構(gòu)域)，類(lèi)αAPC/ApcD (αAP-B，由apcD編碼)，類(lèi)βAPC/ApcF變體(β18.5，由apcF編碼)[6,27,37]。ApcD、αLCM和ApcF亞基中都各結(jié)合一個(gè)藻藍(lán)膽素。普通的APC亞基最大發(fā)射峰為660 nm，而ApcD和αLCM的最大發(fā)射峰為680 nm，因此被稱(chēng)為能量末端發(fā)射受體(terminal emitters)[38-40]。ApcD、ApcF和αLCM的結(jié)構(gòu)與APC的α和β亞基相似，但不完全相同，蛋白的帶電性也不同[41]。

1.2 連接蛋白

藻膽體中的連接蛋白大多為無(wú)色，也有的連接蛋白結(jié)合色素，但是不屬于藻膽蛋白的α和β亞基，通常稱(chēng)為γ亞基。γ亞基并不普遍存在，僅存在于少數(shù)海洋藍(lán)藻和紅藻中[9,40]。連接蛋白占藻膽體質(zhì)量的15%左右，參與藻膽蛋白的空間排列和功能調(diào)節(jié)，進(jìn)而組裝成藻膽體高效的捕光系統(tǒng)[9]。

根據(jù)功能和位置，連接蛋白分為以下幾種：桿連接蛋白LR，參與桿的組裝；核桿連接蛋白LRC，參與桿與核之間的連接；核連接蛋白LC，參與核的組裝；核膜連接蛋白LCM，參與核的組裝[6,40]。在LCM的類(lèi)αAPC結(jié)構(gòu)域αLCM插入有一段loop (稱(chēng)作PB-loop)[38]，目前認(rèn)為與類(lèi)囊體膜內(nèi)的光系統(tǒng)相互作用。

連接蛋白中有兩種保守結(jié)構(gòu)域Pfam00427和Pfam01383，參與桿和核的組裝，并廣泛存在于多種連接蛋白中[9]。根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)域，紅藻中的連接蛋白LR和LRC可以進(jìn)一步分為幾類(lèi)(圖1)。

圖1 紅藻G. pacifica和P. purpureum藻膽體中的連接蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)比圖及示意圖。(a)紅藻G. pacifica和P. purpureum藻膽體中連接蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)比圖。圖中玫紅色的連接蛋白來(lái)自P. purpureum，淺藍(lán)色連接蛋白來(lái)自G. pacifica。(b) G. pacifica和P. purpureum中連接蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中數(shù)字標(biāo)記了結(jié)構(gòu)域的位置，除LR6來(lái)自P. purpureum外，其他均標(biāo)記了G.pacifica連接蛋白的結(jié)構(gòu)域位置(圖片修改自[8, 28])

桿連接蛋白LR可分為三類(lèi)。第一類(lèi)包括LR1～LR3，以及紅藻P. purpureum的LR6，這類(lèi)連接蛋白含有Pfam00427結(jié)構(gòu)域。第二類(lèi)是藻紅蛋白的γ亞基，被稱(chēng)為L(zhǎng)Rγ，包括LRγ4、LRγ5、LRγ7和LRγ8及G. pacifica的LRγ6。這類(lèi)連接蛋白含有一個(gè)之前未被發(fā)現(xiàn)的、保守的色素結(jié)合域(chromophore binding domain, CBD)，結(jié)合PEB和/或PUB，占據(jù)PE六聚體的中心腔，從六聚體中伸出的小螺旋或loop與相鄰的連接蛋白的剛性結(jié)構(gòu)域(如Pfam00427結(jié)構(gòu)域)相互作用。第三類(lèi)只有LR9，含有與細(xì)胞黏附相關(guān)的FAS1同源結(jié)構(gòu)域。

核桿連接蛋白LRC也可以分為三類(lèi)。第一類(lèi)LRC1，包含一個(gè)埋藏在其藻藍(lán)蛋白六聚體中的N端Pfam00427結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端loop。第二類(lèi)為L(zhǎng)RC2和LRC3，它們的N端都有Pfam00427結(jié)構(gòu)域，C末端有一個(gè)卷曲螺旋基序(motif)，螺旋結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)螺旋是反向平行的。第三類(lèi)為L(zhǎng)RC4、LRC5和LRC6，以前是未知的，與其他連接蛋白的結(jié)構(gòu)有很大不同。LRC4、LRC5和LRC6都是“中間結(jié)構(gòu)域-兩側(cè)loop”組成形式，區(qū)別在于LRC4和LRC5中間包含一個(gè)長(zhǎng)α螺旋，在LRC6中間包含一個(gè)FAS1結(jié)構(gòu)域。

2 藻膽體的結(jié)構(gòu)

2.1 總體組成

在G. pacifica藻膽體的核中有46個(gè)APC亞基(不包含LCM)，桿中有672個(gè)PE亞基、72個(gè)PC亞基，共有72個(gè)連接蛋白及2 048個(gè)色素分子，總分子量18.0 MDa。在P. purpureum藻膽體的核中有46個(gè)APC亞基，桿中有528個(gè)PE亞基、72個(gè)PC亞基，共有60個(gè)連接蛋白及1 598個(gè)色素分子，總分子量14.7 MDa。

紅藻G. pacifica和P. purpureum的藻膽體結(jié)構(gòu)相似(圖2)，核由三個(gè)圓柱(A、A′、B)組成，圓柱B垛疊于底部圓柱A和A′形成的肩凹上方。核周?chē)?4個(gè)桿交錯(cuò)排列，另外還有一些單獨(dú)的六聚體、α亞基和β亞基填充在核和桿的外部空間，這可能有助于穩(wěn)定藻膽體的結(jié)構(gòu)(圖2(a)和(c))。P. purpureum的藻膽體較小，5個(gè)桿Ra、Rb、Rc、Rd和Re外側(cè)各少一個(gè)PE六聚體及一個(gè)連接蛋白，并且缺少He六聚體及其連接蛋白(圖2(a)～(d))。

圖2 紅藻G. pacifica (PDB: 5y6p)和P. purpureum (PDB: 6kgx)的完整藻膽體結(jié)構(gòu)比較。(a)～(b)藻膽體的整體結(jié)構(gòu)比較，分別為正面視圖(a)和側(cè)面視圖(b)。其中P. purpureum藻膽體的結(jié)構(gòu)以彩色顯示，G. pacifica藻膽體結(jié)構(gòu)以灰色表示。P.purpureum藻膽體的桿Ra、Rb、Rc、Rd′、Re外側(cè)各少一個(gè)PE六聚體，并且缺少單獨(dú)的六聚體He。(c) G. pacifica和P.purpureum藻膽體中桿與核的分布示意圖。所用顏色同圖(a)～(b)，標(biāo)記了P. purpureum藻膽體中單獨(dú)的PEβ亞基(S1～S10)和(αβ)單體(M1)。(d) G. pacifica和P. purpureum藻膽體中的連接蛋白骨架比較。G. pacifica藻膽體輪廓以灰色透明背底表示，P. purpureum藻膽體的連接蛋白以彩色顯示，G. pacifica的連接蛋白以灰色表示。P. purpureum比G. pacifica缺少5個(gè)桿Ra、Rb、Rc、Rd′、Re和單獨(dú)的六聚體He中的連接蛋白。(e) P. purpureum藻膽體的結(jié)構(gòu)模式圖。右側(cè)展示了各個(gè)圖形所代表的藻膽體組分(圖片修改自[28])

2.2 桿的結(jié)構(gòu)

紅藻藻膽體共有14個(gè)桿，由PE和PC或僅由PE組成。含有PE和PC的桿為type I，PC位于近核端，包括Ra/Ra′、Rb/Rb′和Rc/Rc′；僅含有PE的桿為type II，包括Rd/Rd′、Re/Re′、Rf/Rf′和Rg/Rg′，其中10個(gè)桿較長(zhǎng)(≥3個(gè)PE或PC-PE六聚體)，而Rf/Rf′和Rg/Rg′這4個(gè)桿較短，只由2節(jié)PE六聚體組成，而且不直接與核接觸(圖2(e))。連接蛋白在桿的組裝中起到非常重要的作用，其模型有兩種：互鎖模型(interlocking)和分子骨架模型(skeleton)[9,25,42-43]。在互鎖模型中，兩個(gè)藻膽蛋白六聚體分別與一個(gè)連接蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用。這一模型沒(méi)有突出連接蛋白之間的相互作用；分子骨架模型則更加關(guān)注連接蛋白之間特異性相互作用，認(rèn)為連接蛋白形成桿組裝的骨架。

紅藻藻膽體中桿的組裝同時(shí)包含這兩種模型。例如，P. purpureum藻膽體的桿Ra-c (type II)，由1個(gè)PC六聚體、2個(gè)PE六聚體和3個(gè)連接蛋白LRC1、LR1和LRγ4組成。PC六聚體和相鄰的PE六聚體由LR1連接，LR1含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的Pfam00427結(jié)構(gòu)域和C端的Pfam01383結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合相鄰的兩個(gè)藻膽蛋白六聚體，即LR1按照互鎖模型連接相鄰的藻膽蛋白六聚體。同時(shí)，LR1兩端分別與LRC1和LRγ4連接，形成桿Ra-c的骨架，這與分子骨架模型一致(圖3(a)和(b))。

總之，具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的LR1按照互鎖模型組裝部分桿，10個(gè)較長(zhǎng)的桿中所有連接蛋白從近核端到遠(yuǎn)核端按照LRC—(LR1)—LRγ的順序相互作用，4個(gè)較短的桿按照LR2/3—LRγ的順序相互作用，從而形成桿的骨架(圖2(e))。結(jié)合色素的LRγ位于桿的遠(yuǎn)核端，可能是由于藻膽體外周的色素密度提高有助于其增大捕光面積。第三類(lèi)桿連接蛋白LR9具有FAS1結(jié)構(gòu)域，并在C端有很長(zhǎng)的loop，位于桿之間，穩(wěn)定與其接觸的桿(圖4(a))。從整體來(lái)看，藻膽體中所有的連接蛋白按照一定的順序相互連接，形成藻膽體組裝的骨架(圖2(d))。

2.3 核的結(jié)構(gòu)

紅藻藻膽體的核由三個(gè)圓柱(A、A′、B)組成：圓柱B位于上方，兩個(gè)APC三聚體B1和B2背對(duì)背排列；圓柱A和A′各由三個(gè)APC(A1、A2、A3/A1′、A2′、A3′)組成三聚體，其中A2/A2′和A3/A3′面對(duì)面結(jié)合，而A1/A1′與A2/A2′背對(duì)背連接，圓柱A和A′反向平行排列(圖3(c)～(d))。αLCM和ApcF位于A2/A2′中，ApcD位于A3/A3′中(圖3(d)～(f))。

核三聚體亞基之間的相互作用是對(duì)稱(chēng)的：三聚體B1、A2與A′1相互作用，三聚體B2、A′2與A1相互作用(圖3(e))。另外，連接蛋白LC和LCM位于APC三聚體中心的空洞中，起到連接作用：LCM連接B1、A1和A2，LC連接A2和A3(圖3(f))。三聚體之間的相互作用及與連接蛋白的相互作用，可以使核保持穩(wěn)定。

圖3 藻膽體桿((a)～(b))與核((c)～(f))的組裝。(a)～(b) P. purpureum藻膽體桿Rc的結(jié)構(gòu)圖(a)和模型圖(b)：LR1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(Pfam00427結(jié)構(gòu)域和Pfam01383結(jié)構(gòu)域)按照互鎖模型(interlocking)連接相鄰PC和PE的六聚體；同時(shí)，LRC1、LR1和LRγ4彼此相連，形成桿Ra-c的骨架(skeleton)。(c)～(d)紅藻藻膽體核三聚體的排列及與連接蛋白的位置關(guān)系(其中紅色為連接蛋白LCM，藍(lán)色為連接蛋白LC)，分別為正面(c)和側(cè)面(d)視圖。(e) 核三聚體之間的相互作用，紅色虛線圖形標(biāo)注了三聚體B1、A2和A'1之間的相互作用位點(diǎn)。(f) 連接蛋白在核中的位置，LCM連接B1、A1和A2，LC連接A2和A3(PDB: 6kgx)

2.4 藻膽體的組裝

紅藻藻膽體中有14個(gè)桿，其中10個(gè)桿通過(guò)連接蛋白LRC1-3與核結(jié)合。LRC1-3的C末端有一個(gè)序列保守的α螺旋，通過(guò)廣泛的疏水相互作用和靜電相互作用與核APC的α亞基表面的一個(gè)凹槽(groove)結(jié)合(圖4(c)～(f))，而另一端的Pfam00427結(jié)構(gòu)域與桿結(jié)合。序列比對(duì)研究表明，參與相互作用的LRC蛋白C末端的α螺旋上的氨基酸殘基和核APC的α亞基中結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基是保守的，并且在紅藻和藍(lán)細(xì)菌中均包含疏水性或帶電荷和/或極性氨基酸(圖4(b))，這說(shuō)明藻膽體組裝過(guò)程中，桿-核連接蛋白可能使用一種通用機(jī)制[8,28]。在核中有8個(gè)三聚體(A1-A3、A′1-A′3、B1和B2)，含有20個(gè)APC的α亞基(不包括兩個(gè)αLCM亞基和兩個(gè)ApcD亞基)。由于一些結(jié)合位點(diǎn)在核圓柱體的3個(gè)三聚體相互作用交界處以及三聚體和類(lèi)囊體膜之間，最終有12個(gè)位點(diǎn)可以與LRC結(jié)合(圖4(d)、(f))：A1、A′1、A2、A′2三聚體，以及A3、A′3、B1和B2三聚體各自提供的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。正常情況下，一個(gè)LRC錨定到一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但是A1(A′1)和A2(A′2)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被一個(gè)LRC占據(jù)(圖4(d))。因此，12個(gè)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)10個(gè)LRC，進(jìn)而對(duì)應(yīng)10個(gè)桿：A1和A2—LRC1a—Ra；A′1和A′2—LRC1a′—Ra′；B1—LRC1c—Rc；B1—LRC1b′—Rb′；B2—LRC1b—Rb；B2—LRC1c′—Rc′；A3—LRC2—Rd；A3—LRC3′—Re′；A3′—LRC2′—Rd′；A3′—LRC3—Re(圖4(d))。這10個(gè)桿的連接蛋白形成的骨架，通過(guò)近核端的一點(diǎn)結(jié)合著核表面的這12個(gè)保守位點(diǎn)(圖4(a))。藻膽蛋白在骨架上組裝成桿，最終使得藻膽體如同天線(antenna)或一把始終張開(kāi)著的傘，每個(gè)傘骨(連接蛋白骨架)通過(guò)一點(diǎn)固著與傘柄結(jié)合，支撐著巨大傘面(藻膽蛋白)來(lái)收集光子，并將太陽(yáng)能高效傳遞至傘柄(核)。

圖4 藻膽體的核桿組裝。(a) G. pacifica的桿與核的連接。核顯示為灰色的表面，灰色圓柱表示桿連接蛋白形成的骨架，帶顏色突出顯示LR9和LRC4-6對(duì)桿之間、核與桿之間的穩(wěn)定作用。(b)紅藻和藍(lán)藻中LRC1及αAPC序列比對(duì)圖(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)。相互作用的保守氨基酸位點(diǎn)標(biāo)記為* (圖修改自[8])。(c)核B2的αAPC形成的凹槽與LRC1b的C末端α螺旋之間的相互作用。發(fā)生相互作用的保守氨基酸位點(diǎn)已標(biāo)識(shí)(圖修改自[28])。(d)藻膽體核表面αAPC形成的12個(gè)凹槽與10個(gè)LRC結(jié)合；左右圖分別為正面觀和頂面觀，αAPC與LRC結(jié)合的凹槽顯示為紅色表面；除了LRC1a與兩個(gè)αAPC凹槽結(jié)合之外，其他LRC各結(jié)合一個(gè)αAPC凹槽(圖修改自[28] )。(e)LRC1b、LRC2、LRC3與αAPC的結(jié)合界面，以αAPC進(jìn)行整體的結(jié)構(gòu)匹配； 3個(gè)LRC雖然分別處于不同走向，但結(jié)合界面處LRC的結(jié)構(gòu)和序列基本保守。(f)分層顯示(d)右圖中藻膽體核表面與LRC結(jié)合情況。每個(gè)藍(lán)色圓盤(pán)為一個(gè)APC三聚體；αAPC顯示為黃色多邊形，αAPC上的保守凹槽用紅圈表示，其中具備結(jié)合LRC能力的顯示為實(shí)心紅圈，不具備結(jié)合LRC能力的顯示為空心紅圈

另外還有4個(gè)桿(Rg、Rf、Rg′、Rf′)不直接與核結(jié)合，而是通過(guò)桿連接蛋白LR2/ LR3結(jié)合到其他桿上，例如桿Rg通過(guò)LR2與Rb結(jié)合，桿Rf通過(guò)LR3與Rc結(jié)合(圖2(e))。在紅藻藻膽體中還有單獨(dú)的PE六聚體，例如Ha-He、Ha′-He′通過(guò)桿連接蛋白與其他桿連接(圖2(e))。這些組分的存在可能有利于增大捕光面積并維持藻膽體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

在紅藻藻膽體中發(fā)現(xiàn)一組新的核桿連接蛋白(LRC4、LRC5和LRC6)，蛋白中間部分為一個(gè)α螺旋或FAS1結(jié)構(gòu)域，兩側(cè)有很長(zhǎng)的loop(圖1(b)和4(a))。中間結(jié)構(gòu)域與核結(jié)合，而兩側(cè)loop類(lèi)似束帶，與核和周?chē)臈U具有廣泛的相互作用，因此可以穩(wěn)定藻膽體的完整組裝。

3 色素的蛋白質(zhì)環(huán)境分析

能量從高能級(jí)藻膽蛋白傳遞至相對(duì)低能級(jí)的藻膽蛋白，再傳遞到反應(yīng)中心的葉綠素，這一過(guò)程是通過(guò)色素-色素、色素-蛋白之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]，其能量傳遞效率高于95%[6,11,44]。

如果天線蛋白中只結(jié)合一個(gè)色素，那么該色素的能量狀態(tài)由于吸收光子而被激發(fā)，處于激發(fā)態(tài)的色素基團(tuán)最終以非輻射方式或通過(guò)輻射方式(熒光發(fā)射)返回到基態(tài)。如果天線蛋白結(jié)合兩種具有不同吸收特性的色素，當(dāng)兩個(gè)色素基團(tuán)之間的距離很近時(shí)，如小于5 nm，根據(jù)F?rster理論，激發(fā)態(tài)的能量以共振能量轉(zhuǎn)移的方式從高向低傳遞，例如從PEB(供體)向PCB(受體)傳遞。如果天線蛋白結(jié)合兩個(gè)同種色素，而蛋白質(zhì)環(huán)境導(dǎo)致兩個(gè)色素的吸收特性發(fā)生變化，則一個(gè)是供體，另一個(gè)是受體[7,45-47]。氨基酸與色素之間的相互作用包括靜電、疏水相互作用和π-π相互作用等[48-49]。在藻膽蛋白同一個(gè)三聚體中，相對(duì)位置一樣的色素處于相同的蛋白質(zhì)環(huán)境中，而在完整的藻膽體中，連接蛋白的存在會(huì)對(duì)同一個(gè)三聚體中的不同色素產(chǎn)生不同的影響。其中，連接蛋白芳香族殘基的π電子與色素π電子之間的相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)色素基團(tuán)的能量狀態(tài)非常重要[28]。

3.1 桿中色素的蛋白質(zhì)環(huán)境分析

如前所述，在紅藻中藻膽體type I的桿中有兩種藻膽蛋白三聚體(PE、PC)和三種連接蛋白(LRγ、LR及LRC)?？紤]到藻膽蛋白亞基的同源性，接下來(lái)我們以type I型的桿Rc為例，討論藻膽體桿內(nèi)的能量傳遞途徑。

連接蛋白對(duì)藻膽蛋白色素能級(jí)的影響可以分為兩種方式。首先，連接蛋白中的氨基酸調(diào)節(jié)藻膽蛋白色素能級(jí)。例如，在Rc(圖5(a))的PC-I三聚體內(nèi)，連接蛋白LRC1c的H58與β282具有π-π相互作用，最小距離為2.8 ?，屬于強(qiáng)的相互作用；LRC1c-Y104與β182具有π-π相互作用，但距離為4.3 ?，因此相互作用較前者弱一些；但是沒(méi)有芳族氨基酸殘基與β382相互作用。因此，由于連接蛋白LRC的影響，β282在這三個(gè)色素中可能處于最低的能量狀態(tài)(圖5(b))。由于PC-I三聚體直接與核銜接，在整個(gè)PC-I三聚體中，可能是光收集和能量從桿傳遞至核的關(guān)鍵位點(diǎn)，我們稱(chēng)之為中轉(zhuǎn)站色素。同理，在Rc的PE-I三聚體內(nèi)，LRγ4的三個(gè)芳香族殘基(F139、F80和F124)分別與PE-I三聚體的β182、β282和β382具有較強(qiáng)的π-π相互作用，這說(shuō)明LRγ4有助于穩(wěn)定β82，從而使三個(gè)β82的能級(jí)降低(圖5(c))，這與LRC對(duì)PC三聚體的影響相似。其次，連接蛋白中的色素也會(huì)對(duì)藻膽蛋白的色素能級(jí)產(chǎn)生影響。例如，連接蛋白LRγ4結(jié)合的PEB(γLRγ4152)靠近β282，最近距離為2.9 ?，形成激子耦合效應(yīng)，使π電子在兩個(gè)色素之間離域[23,50]。因此，與其他β82相比，β282處于相對(duì)較低的能級(jí)。綜上所述，在整個(gè)PE三聚體I中，β282可能是光收集和能量傳遞的關(guān)鍵位點(diǎn)(圖5(c))。

通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，與色素相互作用的芳香族氨基酸在紅藻和藍(lán)藻中是相對(duì)保守的(圖5(d)、(e))，說(shuō)明其功能的重要性[28]?？傊?，連接蛋白能夠通過(guò)不同數(shù)量的芳香族氨基酸、不同強(qiáng)度的相互作用及色素的位置調(diào)節(jié)藻膽蛋白內(nèi)色素的能級(jí)。

圖5 P. purpureum藻膽體桿中的連接蛋白及其對(duì)桿中色素能級(jí)的影響。(a)桿Rc的整體結(jié)構(gòu)，圖中標(biāo)記了PC三聚體I (PC-I)和PE三聚體I(PE-I)的位置；(b)連接蛋白LRC對(duì)PC-I的影響；(c)連接蛋白LRγ4對(duì)PE-I的影響；(d) P. purpureum藻膽體中LRγ4-5與其他紅藻γ亞基序列對(duì)比圖；(e) P. purpureum 藻膽體中LRC1與其他物種中的LRC1的序列對(duì)比圖。圖(d)和(e)中與色素相互作用的芳香族氨基酸標(biāo)記為星號(hào)。圖引自[28]，圖中氨基酸及色素顏色：藍(lán)綠色，LRC；綠色，LRγ4(PDB: 6kgx)

3.2 核中色素的蛋白質(zhì)環(huán)境分析

在APC中，αβ亞基各結(jié)合一個(gè)PCB，分別為α81和β81。核B連接桿Rc/Rc′和Rb′/Rb，因此這部分桿吸收的能量可能首先傳遞給B。在B1中，LCM的F850位于B1β381附近，距離為4.8 ?，因此，能量可能會(huì)經(jīng)過(guò)B1β381傳遞給更靠近核A的色素(圖6(a))。

核A1中，A1α181位置最接近核B，然后依次是A1β281、A1β181和A1β381。LCM-F454與A1β181相互作用，LCM的Y443、Y583和F610與A1β381具有π-π相互作用，因此，在LCM的影響下，A1β381的能級(jí)最低，其次是A1β181和A1β281(圖6(b))。

ApcF是核A2中特殊的β亞基，對(duì)于將能量從藻膽體轉(zhuǎn)移至PSII至關(guān)重要[51-53]。在ApcF中，ApcF-F60、ApcF-R89、ApcF-Y93和ApcF-Y97與形成較強(qiáng)的π-π相互作用，從而降低其能級(jí)。同時(shí)，αLCM中的氨基酸(V12、P14、L16、L247、L249、F397、P401、C404和W407)在周?chē)纬梢粋€(gè)疏水口袋，從而使A2β87ApcF更加穩(wěn)定(圖6(c)、(e))。

核A3中也有一個(gè)特殊的α亞基ApcD，在藻膽體向PSI傳遞能量過(guò)程中具有重要作用[51-54]。ApcD-W87、ApcD-F59、ApcD-Y65、ApcD-R83和核A3-β-Y73與A3αApcD81相互作用，這些氨基酸的存在會(huì)降低A3αApcD81的能級(jí)(圖6(d))。

αLCM連接核與類(lèi)囊體膜，其色素是藻膽體的末端能量受體。在αLCM中，αLCM-Y140和αLCM-R144直接與A2α186相互作用，尤其是αLCM-Y140占據(jù)LCMA環(huán)的位置，形成空間位阻，導(dǎo)致的A環(huán)構(gòu)象發(fā)生變化，使其ABCD環(huán)幾乎處于同一平面上(圖6(f)～(h))。色素分子的二面角與其能級(jí)有關(guān)，二面角越小，色素分子的四個(gè)吡咯環(huán)越接近同一平面，則能級(jí)越低[24]，因此在所有色素中處于能量最低的狀態(tài)。

圖6 紅藻藻膽體核內(nèi)色素的蛋白環(huán)境。(a)～(d)分別為核B1、A1、A2和A3中色素的蛋白環(huán)境。圖中展示了各個(gè)APC三聚體從A1向A3方向的視圖，三聚體的下方均為類(lèi)囊體膜的方向，圖中顯示了位置特殊的α181和所有β81色素分子及與其相互作用的氨基酸殘基。(e)與A2βApcF87相互作用的氨基酸及其周?chē)氖杷懊弊印薄?f)PCB色素分子二面角示意圖，其中Φ1、Ψ1等分別代表NA-C(4)–C(5)–C(6)、C(4)–C(5)–C(6)–NB等平面之間的夾角。(g)A2αLCM186與核PCB的二面角比較。(h)A2αLCM186(紅色)與核PCB(灰色)之間的構(gòu)象比較，從圖中可以看出A2αLCM186 A環(huán)的位置發(fā)生明顯的變化(修改自[28])。氨基酸顏色：深藍(lán)色，核B1；紅色，LCM；粉紅色，ApcF；淺棕色，ApcD；藍(lán)色，LC；淺藍(lán)色，核A3(PDB: 6kgx)

綜上所述，在核中，連接蛋白也發(fā)揮了調(diào)節(jié)色素能級(jí)的作用，特別αLCM-Y140和，不僅通過(guò)π-π相互作用影響色素的π電子狀態(tài)，同時(shí)還通過(guò)空間位阻效應(yīng)影響A2αLCM186色素的平面構(gòu)象，致使A2αLCM186色素成為整個(gè)藻膽體的能級(jí)最低的末端能量受體。蛋白環(huán)境對(duì)色素的影響與藻膽體的能量傳遞的方向一致，即桿吸收的能量匯聚到核，然后傳遞給藻膽體末端能量受體，最后傳遞給光反應(yīng)中心[51, 55]。

4 結(jié)論和展望

紅藻高分辨率的藻膽體結(jié)構(gòu)，對(duì)于了解其結(jié)構(gòu)組裝及能量傳遞的機(jī)制具有非常重要的意義。藻膽蛋白(αβ)3三聚體是藻膽體的基本結(jié)構(gòu)單位，通過(guò)連接蛋白組裝成桿和核，并進(jìn)一步組裝成完整的藻膽體，組裝過(guò)程涉及藻膽蛋白與連接蛋白、藻膽蛋白與藻膽蛋白，以及連接蛋白與連接蛋白之間的相互作用。在完整的藻膽體結(jié)構(gòu)中，所有的連接蛋白均參與骨架的構(gòu)建(G.pacifica中72個(gè)，P. purpureum中60個(gè))，如圖2(d)所示。另外，連接蛋白在藻膽體的能量傳遞中可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在桿中，連接蛋白通過(guò)提供不同數(shù)量的芳香族氨基酸側(cè)鏈π電子，或通過(guò)自身結(jié)合的色素(LRγ)與藻膽蛋白內(nèi)的色素相互作用，調(diào)節(jié)β亞基中色素的能級(jí)，有利于能量在桿中高效傳遞。在核中，連接蛋白也具有微調(diào)APC中色素能量的作用。核中特殊的亞基ApcF、αLCM和ApcD，其色素能級(jí)均受到連接蛋白的調(diào)節(jié)，尤其是αLCM亞基中色素的特殊構(gòu)象，在藻膽體向光系統(tǒng)傳遞能量過(guò)程中起到非常重要的作用。

藻膽體中存在大量的色素，這些色素基團(tuán)是能量接收和傳遞的載體。分析色素的構(gòu)象是了解藻膽體能量傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但受分辨率限制，仍有許多色素的精確構(gòu)象是未知的，因此，需要繼續(xù)提高藻膽體的結(jié)構(gòu)分辨率。另外，在結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可能需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸或色素的功能及其在生理狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)變化。例如，采用分子生物學(xué)技術(shù)，在結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下對(duì)關(guān)鍵基團(tuán)進(jìn)行突變，結(jié)合光譜學(xué)功能分析揭示能量傳遞的途徑。藻膽體作為藍(lán)藻和紅藻中的主要捕光天線，其主要功能是向反應(yīng)中心傳遞能量，雖然之前報(bào)道了藻膽體與PSII和/或PSI結(jié)合的復(fù)合體[27,56-57]，但是目前還難以用于分析藻膽體如何向光系統(tǒng)傳遞能量?？紤]到水溶性藻膽體和膜蛋白的性質(zhì)差異大，難以分離純化，需要考慮采用其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)原位研究超級(jí)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，例如冷凍電子斷層掃描技術(shù)等。

隨著化石燃料逐漸匱乏及其燃燒造成的溫室效應(yīng)等環(huán)境問(wèn)題的出現(xiàn)，如何直接利用太陽(yáng)能這一可持續(xù)能源引發(fā)更多關(guān)注[58]。其中一個(gè)方向是，模擬自然界已存在數(shù)億年的光合作用相關(guān)蛋白，設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)潔高效的光能器件用以捕獲和利用太陽(yáng)能，稱(chēng)作人工模擬光合作用(artificial photosynthesis)[59]。染料敏化太陽(yáng)能電池(dyesensitized solar cell, DSSC)利用染料作敏化劑，增加鈦、鈣、鋅的氧化物等半導(dǎo)體對(duì)可見(jiàn)光區(qū)的吸收，其制作工藝簡(jiǎn)單，成本低，效率提高的潛力大[60]。藻膽體作為水溶性的色素-蛋白復(fù)合體，能量傳遞效率高，尤其是紅藻藻膽體對(duì)深水區(qū)藍(lán)綠光具有較強(qiáng)吸收能力，因此藻膽體可以作為光學(xué)敏化材料，同時(shí)其精細(xì)結(jié)構(gòu)可以指導(dǎo)我們?cè)O(shè)計(jì)更高效、長(zhǎng)壽命、低成本的光電轉(zhuǎn)換器件。若將該器件鋪設(shè)到海底，可以開(kāi)發(fā)利用廣闊海域的更多太陽(yáng)能。