孫靖宣，李艷萍，潘爽，何麗娜，孫翔宇，張爽，牛玉梅

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱（150001）

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）由Gronthos等［1］于2000年首次報(bào)道，因其具有獲取相對(duì)簡(jiǎn)單、高度增殖、多向分化及免疫原性較低等優(yōu)點(diǎn)，近年來已逐漸被應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，被視為是組織工程學(xué)重要的種子細(xì)胞［2］。細(xì)胞支架對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為有重要的影響，尋求理想的支架材料是近年來組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。

石墨烯（graphene）是一類單原子層二維原子晶體，于2004年首次從石墨中分離獲得，因其具有良好的電學(xué)、力學(xué)以及熱學(xué)性能而被逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［3?4］。本文針對(duì)石墨烯的理化特性，探究其對(duì)DPSCs生物學(xué)行為的影響，從而評(píng)估其在組織工程學(xué)中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（SH30022.01，Hyclone，美國）；胎牛血清（10099?141，Gibco，美國）；MTT溶液（M6180，Biotopped，中國）；TritonX?100（1139ML100，BioFroxx，中國）；10 000 U/mL青霉素?鏈霉素混合溶液（SV30010，Hyclone，美國）；石墨粉（青島美瑞特，中國）；STRO?1抗體（MAB4315，Sigma，美國）；FITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG（H+L）（WLA032，萬類，中國）；二甲基亞砜（1084ML100，BioFroxx，中國）；BSA（143183，BioFroxx，中國）；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（CA1610，索萊寶，中國）；DAPI（AR1176，Boster，中國）；激光拉曼光譜儀（Jobin Yvon HR800，Ra?man spectra，法國）；原子力顯微鏡（Dimension Icon，Bruker，德國）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Multiskan FC，Thermo Fisher Scientific，美國）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus CKX41，Olympus，日本）；培養(yǎng)箱（seriesⅡwater jacket，Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

本實(shí)驗(yàn)已獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科門診收集18～25歲患者因正畸或阻生而拔除的健康前磨牙及第三恒磨牙，研究均獲得患者及家屬知情同意。原代細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定步驟如下:采用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，進(jìn)行消化、傳代，并鑒定。用礦化誘導(dǎo)液（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，8～10 mol/L維生素K，10 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉，1.5 g/L L?維生素C，2 mmol/L L?谷氨酰胺）培養(yǎng)第1代細(xì)胞14 d后，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色；將第1代細(xì)胞固定，用STRO?1抗體一抗稀釋液（1∶200）4℃孵育過夜，洗去一抗，二抗稀釋液（1∶500）孵育30 min，封片后熒光顯微鏡觀察STRO?1染色效果。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 石墨烯的制備與表征

1.3.1 石墨烯的制備 采用Hummers法將石墨氧化獲得氧化石墨烯（graphene oxide，GO），將獲得的GO配成0.5 mg/mL的溶液，用水合肼進(jìn)行還原。洗滌干燥，獲得石墨烯粉體。將粉體與聚乙烯吡咯烷酮按照質(zhì)量比1∶0.6混入蒸餾水中配制成0.5 mg/mL溶液，超聲震蕩后離心獲取上清液。

1.3.2 石墨烯的表征 使用激光拉曼光譜儀在458 nm波長下對(duì)石墨烯以及GO進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。用原子力顯微鏡觀察兩者表面形態(tài)。

1.4 MTT檢測(cè)石墨烯對(duì)DPSCs增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長期的DPSCs，以3×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后，依次將培養(yǎng)液更換為石墨烯濃度為0、1、5、10、20、50、100μg/mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在第12、24、48、72 h分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。為排除石墨烯對(duì)吸光值可能的影響，將每孔的溶液更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入MTT溶液（5 mg/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）溶液震蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長下檢測(cè)各孔吸光值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的DPSCs，以3×105細(xì)胞/孔接種于6孔板。細(xì)胞生長達(dá)到90%融合時(shí)，將培養(yǎng)液更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用10μL槍頭垂直于皿底于中央劃痕，PBS洗凈。實(shí)驗(yàn)組分別加入石墨烯濃度為10、20、50μg/mL的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；對(duì)照組加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)的第0、6、12、24 h，鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件測(cè)量細(xì)胞的遷移面積并計(jì)算細(xì)胞遷移率。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移率（%）＝（1-不同時(shí)間點(diǎn)劃痕面積/0 h劃痕面積）×100%。

1.6 不同濃度石墨烯分散液對(duì)DPSCs形態(tài)的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)可見石墨烯濃度為10μg/mL與20 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基對(duì)DPSCs的作用明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在不抑制DPSCs的增殖的前提下，選擇較高濃度即20μg/mL的石墨烯分散液討論其對(duì)DPSCs細(xì)胞形態(tài)的影響。取對(duì)數(shù)生長期的DPSCs，以1×104細(xì)胞/孔接種于24孔板。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，更換為石墨烯濃度0、20μg/mL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，拍照。

1.7 免疫熒光染色

取對(duì)數(shù)生長期的DPSCs，以1×104細(xì)胞/孔接種于24孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換為石墨烯濃度為0、20μg/mL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)3 d后，棄去原培養(yǎng)液。4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，隨后每孔加入適量0.5%Triton X?100溶液，靜置30 min；5%BSA封閉60 min后，每孔加入200μL羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液（1∶200），37℃避光孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入200 μL DAPI工作液，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。PBS清洗后，利用熒光顯微鏡分別觀察各組細(xì)胞染色情況并拍照。采用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞熒光面積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分析。采用方差分析，所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

原代培養(yǎng)的人牙髓組織，在第5～10 d時(shí)可觀察到組織周圍有長梭形的細(xì)胞爬出（圖1a），14～20 d可見細(xì)胞逐漸融合（圖1b）；礦化誘導(dǎo)14 d后，ALP染色結(jié)果呈陽性（圖1c）；熒光顯微鏡下可見基質(zhì)細(xì)胞抗原（stromal cell antigen，STRO?1）單克隆抗體陽性表達(dá)（圖1d）。結(jié)果表明分離DPSCs成功，具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性及形成礦化結(jié)節(jié)的能力，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1 Isolation，culture and identification of dental pulp stemcells圖1 牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

2.2 石墨烯的表征

從GO與石墨烯的拉曼光譜可以看出，兩種材料特征性的D峰（1 350 cm?1）與G峰（1 580 cm?1）非常顯著。G峰代表石墨烯及GO表面特征性的C＝C鍵；D峰代表石墨烯芳香環(huán)中的sp2碳原子氧化后轉(zhuǎn)化為sp3結(jié)構(gòu)。GO經(jīng)還原得到的石墨烯ID/IG值減?。℅O:ID/IG＝1.06；Graphene:ID/IG＝0.88），說明經(jīng)過還原，有一部分的sp3結(jié)構(gòu)被還原成了sp2結(jié)構(gòu)。見圖2。

原子力顯微鏡結(jié)果顯示，GO與石墨烯主要以單層形式存在；與GO相比，經(jīng)還原后石墨烯呈現(xiàn)出較為光滑的細(xì)小薄片狀，尺寸分布比較均勻，厚度也有所減小（GO厚度約為1.2 nm；石墨烯為0.8～0.9 nm）。見圖3。

Figure 2 Raman spectra of GOand graphene圖2 GO與石墨烯的拉曼光譜

Figure 3 The surface morphologies of GO and graphene were observed by atomic force microscopy圖3 原子力顯微鏡觀察GO與石墨烯的表面形貌

2.3 石墨烯對(duì)DPSCs增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0μg/mL）相比，僅100μg/mL組在72 h對(duì)DPSCs的增殖有抑制作用（P＝0.012），其余各濃度組（石墨烯分散液1、5、10、20、50、100μg/mL）對(duì)DPSCs的增殖均沒有顯著影響（P＞0.05）。見圖4。

2.4 石墨烯對(duì)DPSCs遷移能力的影響

Figure 4 Effects of graphene on the proliferation ability of dental pulp stem cells圖4 石墨烯對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)6 h后，各組細(xì)胞劃痕邊緣有散在細(xì)胞爬出；12 h后，各組細(xì)胞劃痕面積均減小，但是各組間遷移率沒有顯著性差異（P＞0.05）；24 h后，細(xì)胞劃痕面積明顯減小，石墨烯分散液10μg/mL組與20μg/mL組部分區(qū)域已有融合，10 μg/mL組遷移率最大，其次為20μg/mL組，均顯著高于對(duì)照組（10μg/mL組vs.對(duì)照組:P＜0.001；20μg/mL組vs.對(duì)照組:P＝0.003）；50μg/mL組與對(duì)照組（0μg/mL）無顯著性差異（P＝0.320）。見圖5。

Figure 5 Influence of graphene on the migration ability of DPSCs圖5 石墨烯對(duì)DPSCs遷移能力的影響

2.5 石墨烯對(duì)DPSCs細(xì)胞形態(tài)的影響

20μg/mL石墨烯分散液培養(yǎng)DPSCs 3 d后，可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞梭形胞體收縮，向類圓形胞體轉(zhuǎn)變，突起變長，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)；而對(duì)照組（0μg/mL）細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。見圖6。

Figure 6 Effect of graphene on the morphology of DPSCs（×100）圖6 石墨烯對(duì)DPSCs細(xì)胞形態(tài)的影響（×100）

免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)過3 d培養(yǎng)，20μg/mL石墨烯分散液組細(xì)胞鋪展面積大，熒光素密度高，可見粗大且有序排列的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)長突觸、多邊形形態(tài)。20μg/mL組細(xì)胞熒光面積與對(duì)照組（0μg/mL）相比無顯著性差異（P＝0.729）。石墨烯對(duì)細(xì)胞鋪展面積沒有顯著的影響，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。見圖7。

Figure 7 Effect of graphene on the morphology of DPSCs圖7 石墨烯對(duì)DPSCs細(xì)胞形態(tài)的影響

3討論

石墨烯是一種二維碳納米材料，具有諸多優(yōu)良特性。研究表明，石墨烯及其衍生物具有良好的生物相容性，可以誘導(dǎo)細(xì)胞成骨及成神經(jīng)向分化［5?6］。DPSCs為神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能。近年來，被認(rèn)為是組織工程良好的種子細(xì)胞［7］。本實(shí)驗(yàn)將石墨烯配制成不同濃度的分散液培養(yǎng)DPSCs，研究石墨烯對(duì)DPSCs增殖、遷移能力及細(xì)胞形態(tài)的影響，探討石墨烯未來應(yīng)用于組織工程學(xué)的可能。

對(duì)于納米材料的細(xì)胞毒性大小，研究者們一直存在爭(zhēng)議，但普遍認(rèn)可的是納米材料細(xì)胞毒性的大小呈現(xiàn)濃度依賴性，受生產(chǎn)工藝及材料表面形態(tài)的影響，并與細(xì)胞與材料作用方式及細(xì)胞培養(yǎng)方法有關(guān)［8?9］。目前對(duì)于制備培養(yǎng)細(xì)胞的石墨烯的方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且多將石墨烯改性或制備成石墨烯片來培養(yǎng)細(xì)胞。而本實(shí)驗(yàn)通過氧化還原法獲得的石墨烯具有特征性D峰與G峰［10?11］，表面較為光滑且尺寸均勻。將其配制成不同濃度的分散液培養(yǎng)DPSCs，使其與細(xì)胞充分作用，與對(duì)照組相比，僅100μg/mL組在72 h對(duì)DPSCs的增殖有抑制作用，其余各組對(duì)DPSCs的增殖均沒有顯著的影響。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似，低濃度石墨烯培養(yǎng)上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，沒有明顯的細(xì)胞毒性且細(xì)胞攝取率較低，而高濃度石墨烯會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞活性［12?13］。

研究表明，石墨烯復(fù)合物會(huì)增加細(xì)胞遷移能力［14］，本實(shí)驗(yàn)中顯示，適宜濃度的石墨烯分散液會(huì)促進(jìn)DPSCs的遷移。而在組織損傷修復(fù)與再生領(lǐng)域，細(xì)胞遷移能力的增加會(huì)促進(jìn)組織的愈合與再生［15］。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所制備的石墨烯具有良好的生物相容性。

石墨烯是一種以sp2雜化的碳原子組成的片層狀納米材料，除了良好的電學(xué)、機(jī)械學(xué)和熱學(xué)性能，還展現(xiàn)出優(yōu)異的生物特性，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有巨大前景。本實(shí)驗(yàn)中用20μg/mL的石墨烯分散液培養(yǎng)DPSCs 3 d后，可見DPSCs形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體由長梭形轉(zhuǎn)變成類圓形，細(xì)胞由雙極性轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄻O性，細(xì)胞突起伸長，呈現(xiàn)出神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)［16?17］。有證據(jù)表明石墨烯可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的分化并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)過程［18］。這可能是由于石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，而適宜的電信號(hào)可以為細(xì)胞的生長提供適宜的微環(huán)境，通過傳導(dǎo)電流刺激促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移、分化及發(fā)育。

隨著對(duì)納米材料認(rèn)識(shí)的加深，石墨烯由于諸多優(yōu)良特性成為近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。有證據(jù)表明，石墨烯及其衍生物可以促進(jìn)細(xì)胞的成骨向分化，石墨烯本身具有良好的導(dǎo)電性，而神經(jīng)元主要是靠神經(jīng)電活動(dòng)行使其功能，因此越來越多的學(xué)者認(rèn)為石墨烯有利于細(xì)胞成神經(jīng)向分化及神經(jīng)組織修復(fù)再生。目前對(duì)于石墨烯促進(jìn)細(xì)胞成神經(jīng)向分化的研究多采用雪旺細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞，但兩種細(xì)胞的獲取方式具有一定的侵入性。DPSCs來源于顱神經(jīng)嵴，來源廣泛且免疫原性低，可在誘導(dǎo)下分化成神經(jīng)元，故本實(shí)驗(yàn)選取DP?SCs進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)中合成的石墨烯具有良好的生物相容性，還可能具有促進(jìn)DPSCs成神經(jīng)向分化的潛能，這與文獻(xiàn)報(bào)道的石墨烯可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞分化的結(jié)果一致。

目前，對(duì)于石墨烯對(duì)DPSCs成神經(jīng)向分化的影響及其機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將對(duì)石墨烯是否可促進(jìn)DPSCs成神經(jīng)向分化及其機(jī)制進(jìn)一步研究。

【Author contributions】Sun JX processed the research and wrote the article.Li YP，Pan S，He LN，Sun XY and Zhang Srevised the ar?ticle.Niu YM reviewed the article.All authors read and approved the fi?nal manuscript as submitted.