李育敏，蔡欽泉，覃俊龍，金 瀟，陳亞瓊，莫云均，李 悅，張秀明

（1.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518001；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院感染管理科，廣東 深圳 518001）

β地中海貧血（簡稱地貧）大部分由β珠蛋白基因點(diǎn)突變引起，少部分因基因缺失而導(dǎo)致[1]。β珠蛋白基因簇上的大片段DNA序列缺失常見于δβ地貧和遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白血癥（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）[1-2]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道的中國人群大片段β缺失型地貧至少有5種，其中3種屬于δβ地貧，包括中國型缺失、云南型缺失和廣州型缺失，均為Gγ（Aγδβ）0，另外2種分別為東南亞型-HPFH缺失和臺(tái)灣型缺失[1-2]。此外，有研究在中國人群中還發(fā)現(xiàn)了2種小片段β缺失合并β點(diǎn)突變，分別為CD89-93（-14bp）合并-28和CD54-58（-13bp）合并IVS-Ⅱ-654[3]。我國南方地區(qū)以中國型Gγ+（Aγδβ）0和東南亞型-HPFH[4-5]多見，其他β缺失型地貧的相關(guān)報(bào)道較少。由于我國大部分醫(yī)院采用的地貧基因診斷試劑盒僅能檢測(cè)常見的β基因點(diǎn)突變類型，較為少見的β基因缺失尚需通過其他方法進(jìn)行檢測(cè)，如臨床對(duì)β缺失型地貧血液學(xué)特征不熟悉，則易漏診該類地貧。本研究針對(duì)深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院近年來發(fā)現(xiàn)的中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺(tái)灣型β地貧及其合并其他類型地貧時(shí)的血液學(xué)表型進(jìn)行分析，為罕見β地貧的篩查和臨床遺傳咨詢提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年6月—2019年5月深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院接受血紅蛋白（hemoglobin，Hb）電泳檢測(cè)的門診和住院患者72 397例。采集HbF≥5%、年齡≥6個(gè)月患者的外周靜脈全血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，2～8 ℃保存，用于紅細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)、Hb電泳檢測(cè)、地貧基因檢測(cè)和DNA測(cè)序。

1.2 儀器與試劑

Hb電泳檢測(cè)采用Capillarys2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（法國Sebia公司）。紅細(xì)胞參數(shù)檢測(cè)采用XN-1000血細(xì)胞分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）。地貧基因檢測(cè)采用Hema T960 PCR擴(kuò)增儀（珠海黑馬公司）、ChemiDoc MP全自動(dòng)凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、YNH16恒溫雜交儀及配套試劑（深圳亞能公司）。DNA測(cè)序采用3730XL遺傳分析儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血液學(xué)分析 采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行Hb電泳檢測(cè)，電泳圖分為Z1～Z15區(qū)，分區(qū)鑒別Hb條帶類型，并分析各條帶所占比例，主要觀察HbF帶和HbA2帶。紅細(xì)胞參數(shù)主要觀察Hb、紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 地貧基因檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)-反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)3種α地貧缺失型基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3種α地貧非缺失型基因（αQS、αCS、αWS）和17種β地貧基因點(diǎn)突變類型（-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31）。采用跨越斷裂點(diǎn)-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺(tái)灣型β缺失型地貧。所有檢測(cè)和結(jié)果判讀均按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.3.3 DNA測(cè)序 DNA測(cè)序由深圳亞能公司完成。采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增Hb電泳檢測(cè)結(jié)果異常樣本α1、α2和β珠蛋白基因[6]。采用Sanger雙脫氧鏈終止法檢測(cè)珠蛋白基因序列。通過Vector NET 8.0軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用人類異常血紅蛋白和地中海貧血數(shù)據(jù)庫（http：//globin.bx.psu.edu）查找突變位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果

檢出19例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧患者，攜帶率為0.026%（19/72 397），其中2例為中國型Gγ+（Aγδβ）0復(fù)合-α3.7缺失雜合子、1例為中國型Gγ+（Aγδβ）0復(fù)合βE突變；檢出18例東南亞型-HPFH地貧患者，攜帶率為0.025%（18/72 397），其中4例為東南亞型-HPFH復(fù)合--SEA缺失雜合子；檢出3例臺(tái)灣型地貧患者，攜帶率為0.004%（3/72 397）。見表1。

表1 β缺失型地貧的基因型與血液學(xué)表型檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1

2.2 血液學(xué)表型檢測(cè)結(jié)果

單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子、單純東南亞型-HPFH雜合子和單純臺(tái)灣型雜合子地貧患者M(jìn)CV和MCH水平均降低，HbF水平均升高。單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子和單純東南亞型-HPFH雜合子地貧患者Hb水平均正常，單純臺(tái)灣型雜合子地貧患者Hb水平稍有下降。單純中國型Gγ+（Aγδβ）0雜合子地貧患者HbA2水平正常，單純東南亞型-HPFH雜合子地貧患者HbA2水平正?；蛏?，單純臺(tái)灣型雜合子地貧患者HbA2水平升高。見表1。

3種地貧患者M(jìn)CV、MCH、HbF、HbA2水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見表2。單純?chǔ)氯笔щs合子與合并其他類型地貧MCV、MCH、HbF、HbA2比較結(jié)果見表3。

表2 3種單純?chǔ)氯笔щs合子地貧的血液學(xué)參數(shù)比較

表2 3種單純?chǔ)氯笔щs合子地貧的血液學(xué)參數(shù)比較

注：*與中國型Gγ+（Aγδβ）0比較，*P＜0.05；與東南亞型-HPFH比較，#P＜0.05。

基因型 MCV/fL MCH/pg HbA2/% HbF/%中國型Gγ+（Aγδβ）0 69.1±2.2 22.7±1.1 2.5±0.2 15.4±2.6東南亞型-HPFH 75.0±5.3* 25.5±1.8* 3.9±0.8* 23.8±5.2*臺(tái)灣型 64.7±4.1# 20.2±2.1# 6.4±1.1*# 8.0±2.4*#P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 單純?chǔ)氯笔щs合子與合并其他類型地貧血液學(xué)參數(shù) x±s

3 討論

β珠蛋白基因簇的5個(gè)功能基因按照5'→3'的順序分別為ε-Gγ-Aγ-δ-β，其大片段缺失累及δ和β基因引起的地貧被稱為δβ地貧，按照分子缺陷和表型特征可分為GγAγ（δβ）0-地貧、Gγ（Aγδβ）0-地貧、（εγδβ）0-地貧和Hb Lepore[7]。此外，β基因簇大片段缺失還可導(dǎo)致HPFH，即成人體內(nèi)持續(xù)存在過量的胎兒HbF。根據(jù)基因缺陷不同，HPFH可分為缺失型和非缺失型兩大類，前者根據(jù)發(fā)現(xiàn)人群、缺失片段的大小和位置，可分為HPFH-1型～7型和French、French West-Indies和Algeria β缺失[8-9]。在中國人群中最常見的是中國型Gγ+（Aγδβ）0和HPFH-6型（東南亞型-HPFH），HPFH-6型是我國目前唯一發(fā)現(xiàn)的HPFH類型，缺失范圍累及β基因和3'-HS-1區(qū)域，缺失長度為27 kb[4，8]，而前者缺失范圍累及部分Aγ、全部δ基因、β基因和3'-HS-1區(qū)域，缺失長度為78.9 kb。本研究結(jié)果顯示，中國型Gγ+（Aγδβ）0與東南亞型-HPFH在深圳地區(qū)β缺失型地貧中占多數(shù)，攜帶率分別為0.026%和0.025%。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)3例臺(tái)灣型，該缺失于2008年由HUANG等[10]首先在中國臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)，后在中國大陸人群中也有個(gè)例報(bào)道[11]，其缺失長度為1 357 bp，5'端斷裂點(diǎn)落在β基因的Cap位點(diǎn)（位于-548），3'端斷裂點(diǎn)落在β基因的IVS-Ⅱ位點(diǎn)（位于+810）。

γ珠蛋白基因因在患兒出生前后關(guān)閉而迅速減少，HbF（α2γ2）在患兒6個(gè)月時(shí)一般不超過5%，1歲時(shí)一般不超過1%[1]。β缺失導(dǎo)致HbF水平升高的機(jī)制尚不完全清楚，有學(xué)者認(rèn)為該機(jī)制可能為β基因簇上多個(gè)參與基因表達(dá)調(diào)控的元件失控，影響了γ基因的發(fā)育開關(guān)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致患兒出生后HbF水平持續(xù)升高，使得γ基因替代β基因功能，從而緩解了α與β肽鏈的不平衡[8，12]。β基因簇中有2個(gè)表達(dá)γ鏈的基因，即Gγ和Aγ，因此組成HbF的為Gγ和Aγ鏈，≥1歲患兒Gγ和Aγ的含量比為40%∶60%。中國型Gγ+（Aγδβ）0和東南亞型-HPFH由于缺失的分子基礎(chǔ)不同，HbF以及Gγ和Aγ的含量均存在差異。東南亞型-HPFH的HbF水平通常較中國型Gγ+（Aγδβ）0更高，其雜合子可高達(dá)29%[4]，這可能與Gγ和Aγ導(dǎo)致HbF水平升高的機(jī)制有關(guān)[8，12]。東南亞型-HPFH的HbF水平升高的機(jī)制主要為：（1）缺失高敏位點(diǎn)3'-HS-1后，失去對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，導(dǎo)致γ基因僅受上游5'端基因座控制區(qū)（locus control region，LCR）的正調(diào)控，同時(shí)又缺失了β基因的競(jìng)爭作用；（2）缺失使3'端下游的增強(qiáng)子更靠近γ基因而產(chǎn)生較強(qiáng)的正效應(yīng)，即增強(qiáng)子距離效應(yīng)；（3）缺失γ基因沉默子，使本應(yīng)關(guān)閉的γ基因持續(xù)表達(dá)[8，12]。然而，中國型Gγ+（Aγδβ）0缺失還涉及到部分Aγ和鄰近Aγ基因3'端的增強(qiáng)子，這可能是導(dǎo)致Gγ和Aγ表型差異的主要原因[8，12]。另外，中國型Gγ+（Aγδβ）0的斷點(diǎn)位于Aγ基因的 IVS-Ⅱ，保留了完整的Gγ基因，因此其HbF的Aγ含量明顯減少，Gγ含量可高達(dá)72%～100%，而東南亞型-HPFH的Gγ含量僅略高于正常值，為57%～63%[12]。

本研究選取年齡≥6個(gè)月、HbF≥5%的患者進(jìn)行中國型Gγ+（Aγδβ）0、東南亞型-HPFH和臺(tái)灣型3種罕見β缺失型地貧檢測(cè)，結(jié)果顯示，3種地貧單純?nèi)笔щs合子以東南亞型-HPFH的HbF水平最高，中國型Gγ+（Aγδβ）0次之，臺(tái)灣型最低；而HbA2水平以臺(tái)灣型最高，東南亞型-HPFH次之，中國型Gγ+（Aγδβ）0最低；3種地貧患者HbF和HbA2水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，3種地貧患者M(jìn)CV和MCH水平差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但當(dāng)兩兩比較時(shí)，東南亞型-HPFH較其他2種地貧更高（P＜0.05），而中國型Gγ+（Aγδβ）0和臺(tái)灣型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05） ，這與杜麗等[4]的研究結(jié)果相符。臺(tái)灣型地貧的HbA2在3種地貧中最高，為（6.4±1.1）%；HbF最低，為（8.0±2.4）%。機(jī)制可能與缺失的分子基礎(chǔ)有關(guān)，其缺失長度在3種地貧中最短，范圍累及β基因的啟動(dòng)子至IVS-Ⅱ，不包括第三外顯子和3'端非翻譯區(qū)，因此其血液學(xué)表型更類似β基因點(diǎn)突變。

中國型Gγ+（Aγδβ）0與其復(fù)合-α3.7缺失雜合子相比，血液學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中國型Gγ+（Aγδβ）0復(fù)合βE的MCV和MCH均較單純雜合子低，而HbF水平升高，無HbA；東南亞型-HPFH與其復(fù)合--SEA缺失雜合子相比，僅MCH存在差異，但后者的MCV和HbF均較前者更低，可能需要更多樣本來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常情況下，β缺失復(fù)合α地貧，α基因和β基因表達(dá)均減少，使α鏈和β鏈合成相對(duì)平衡，臨床多表現(xiàn)為輕型地貧，但是也存在異質(zhì)性[4]；而β缺失復(fù)合β地貧，2種突變均位于β基因上，導(dǎo)致β鏈合成更低或不合成，α鏈主要合成HbF和HbA2，而無HbA或僅少量HbA形成，臨床表現(xiàn)為中間型或重型地貧[4]，表明單純?chǔ)氯笔щs合子與復(fù)合其他類型地貧的表型差異主要與其合并的地貧類型有關(guān)。鑒于成年男性和女性的Hb參考區(qū)間不同，本研究按性別分別統(tǒng)計(jì)了各β缺失型地貧患者的血液學(xué)參數(shù)，分析了MCV、MCH、HbF和HbA2指標(biāo)的差異，而未進(jìn)行Hb的比較。

綜上所述，3種β缺失型地貧均以HbF升高為特征，臨床應(yīng)注意鑒別其血液學(xué)表型，并進(jìn)行地貧基因檢測(cè)以明確基因型。另外，HbF水平升高還可見于非缺失型HPFH 和δβ地貧，以及妊娠和骨髓惡性腫瘤等[12-14]，臨床應(yīng)注意區(qū)分其原因，以避免漏診和誤診。