俞 錢

（南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院，江蘇 蘇州 215002）

《醫(yī)院檢驗科建設(shè)管理規(guī)范》[1]，第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[2]，《CNAS—CL02：2012 醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則（ISO 15189：2012，IDT）》[3]等均要求實驗室在設(shè)備安裝使用前和使用中驗證其能達到必要的性能。線性是整個檢測系統(tǒng)對應(yīng)于系列分析物濃度與儀器最終輸出的信號間是否比例恒定的性能，是方法學性能評價的重要指標之一。本研究根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）定量測量方法的線性評價文件——EP6-A[4]和《WS/T408—2012 臨床化學設(shè)備線性評價指南》[5]要求，使用紅細胞裂解液制備高濃度白細胞（white blood cell，WBC）懸液，并對WBC計數(shù)定量檢測方法線性進行驗證。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院健康體檢者100名，用乙二胺四乙酸二鉀真空采血管采集其肘靜脈血2 mL。所有標本無溶血、黃疸、脂血。

1.2 儀器與試劑

XE-2100全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑；KDC-2046低溫離心機（安徽中佳公司）；氯化氨（分析純）、碳酸氫鉀（分析純）購自天津致遠化學試劑有限公司，乙二胺四乙酸二鈉（分析純）購自天津市大茂化學試劑廠。

1.3 方法

1.3.1 驗證準備 按《WS/T347—2011血細胞分析的校準指南》[6]要求對XE-2100全自動血液分析儀進行校準。在進行線性驗證前，本底計數(shù)、攜帶污染率、精密度必須符合《WS/T 406—2012 臨床血液學檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》[7]相關(guān)規(guī)定。

1.3.2 配制紅細胞裂解液 取碳酸氫鉀1.0 g、氯化氨8.3 g、乙二胺四乙酸二鈉0.037 g，加雙蒸水至1 000 mL，配制成工作液[8]。

1.3.3 制備高濃度白細胞懸液 （1）將100份體檢者血常規(guī)標本，分別裝入15 mL的玻璃試管中，每管加入工作液6 mL，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（2）每管加入工作液1 mL，混勻，每10管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（3）每管加入工作液1 mL，混勻，每5管轉(zhuǎn)移至1支玻璃試管中，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（4）用0.9%NaCl溶液混懸2支試管中的沉淀，混勻15 min后，400×g離心10 min，棄上清液。（5）重復(fù)步驟（4）3次后，用AB型血漿混懸所得的沉淀，制成5 mL約200×109/L的白細胞懸液。

1.3.4 分段驗證 白細胞醫(yī)學決定水平在臨床診斷和治療中具有重要意義[9]。為了覆蓋所有白細胞醫(yī)學決定水平，線性驗證分低、中、高（0～2.0）×109/L、（2.0～20.0）×109/L、（20.0～200.0）×109/L 3段進行驗證。

1.3.5 線性范圍評價試驗 按NCCLS EP6-A[4]方案將稀釋液（L）標記為1號標本，制備的高濃度標本（H）標記為6號標本，2、3、4、5號標本按0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H體積比配制，每份標本重復(fù)測定3次，取均值；先初步檢查數(shù)據(jù)，再進行離群值檢驗，然后進行多項式回歸分析；以回歸標準誤（standard error，SE）最小為最適多項式，如最適多項式為一次多項式，則為線性；如為二次或三次多項式，則進行t檢驗，公式為：t=bi/SEi，式中bi為非線性系數(shù)b2或b3，SEi為非線性系數(shù)b2或b3的SE，判斷非線性系數(shù)b2和b3與0的差異是否有統(tǒng)計學意義，無即為臨床可接受線性，有則為非線性；計算線性偏離，公式為：DLi=p（Xi）-（b0+b1Xi），式中p（Xi）為最適多項式在每個稀釋度處的估計值，b0+b1Xi為擬合線性在每個稀釋度處的估計值；線性偏移=（DLi/b0+b1Xi）× 100%，判斷標準為7.5%，白細胞計數(shù)為1/2允許總誤差（allowable total error，TEa），如線性偏移＜7.5%，則為臨床可接受線性，線性偏移＞7.5%，則為非線性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低、中、高濃度白細胞懸液測定結(jié)果

采用格拉布斯法進行離群值檢驗，計算每個濃度點數(shù)據(jù)統(tǒng)計量t1、t2，結(jié)果顯示t1＜1.135、t2＜1.135，沒有離群值，具體結(jié)果見表1。

表1 低、中、高濃度白細胞懸液線性驗證測定結(jié)果

2.2 低、中、高濃度多項式回歸分析

低濃度回歸SE（0.052）最小，以一次多項式為最適多項式，白細胞計數(shù)在（0.0～2.0）×109/L濃度范圍內(nèi)呈線性。中濃度二次多項式回歸SE（0.189）最小，以二次多項式為最適多項式，對非線性系數(shù)b2進行t檢驗，自由度為15，t=1.056，P=0.369；b2與0比較差異無統(tǒng)計學意義，白細胞計數(shù)在（2.0～20.0）×109/L濃度范圍內(nèi)為臨床可接受線性。高濃度三次多項式回歸SE（0.615）最小，以三次多項式為最適多項式，對非線性系數(shù)b2、b3進行t檢驗，自由度為14，b2：t=4.829，P=0.040；b3：t=-5.702，P=0.029；b2、b3與0比較差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 低、中、高濃度白細胞計數(shù)多項式回歸參數(shù)及最適多項式的非線性系數(shù)

續(xù)表2

2.3 高濃度白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值的偏移

白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值最大偏移為4.3%，＜7.5%，在臨床可接受誤差允許范圍內(nèi)，白細胞計數(shù)在（20.0～195.0）×109/L范圍內(nèi)為臨床可接受線性。見表3。

表3 高濃度白細胞計數(shù)三次多項式與一次多項式估計值的線性偏移

3 討論

臨床工作中，進行全血細胞計數(shù)性能驗證時，需要大量高濃度標本，有文獻報道用臨床標本離心分離白細胞[10]，吸取白細胞層，進一步濃縮獲得高濃度白細胞懸液，此法要求操作精度較高，對操作人員技術(shù)要求也較高。本研究用紅細胞裂解液方法獲得高濃度標本，來源方便、配制簡單，經(jīng)驗證，重復(fù)性好、精密度高，是制備高濃度白細胞標本的理想方法?？梢栽谘毎嫈?shù)性能驗證工作中推廣使用。

目前，一般采用幾個不同濃度標本測量2～3次的平均值與實際值之間是否有趨勢上的線性關(guān)系來進行全血細胞計數(shù)線性驗證，r≥0.975，斜率為0.95～1.05，則驗證呈線性，這一方法簡單、適用，但不太科學。本研究采用多項式回歸分析，先判斷非線性多項式擬合數(shù)據(jù)是否比線性好，如非線性多項式擬合數(shù)據(jù)點比線性好，再對各個數(shù)據(jù)點進行非線性評估，判斷最適多項式與線性擬合之間的線性偏移是否＜1/2 TEa，當評價結(jié)果統(tǒng)計學上為非線性時，若采用線性方式處理患者檢測結(jié)果，引入的誤差在臨床允許誤差范圍內(nèi)，則為臨床可接受線性，可按線性處理結(jié)果，這一方法雖然驗證過程較為繁瑣，但更科學、合理，且更有說服力。NCCLS EP6-A文件[1]推薦的方法利用統(tǒng)計學原理保證了結(jié)果的準確和客觀，將線性評價與臨床目標完美結(jié)合，更適合臨床應(yīng)用。