郁晨蕾，江 淵，李 靜，王莉莉，陳 煒，沈旭暉，張陽(yáng)奕

（上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，上海 200336）

耐藥結(jié)核?。╮esistant tuberculosis，R-TB）的防治是我國(guó)結(jié)核病防治工作中的難題之一，隨著GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)在疑似肺結(jié)核病患者檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的利福平耐藥結(jié)核?。╮ifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）患者被確診[1]。一線、二線抗結(jié)核藥物的體外藥物敏感性試驗(yàn)在個(gè)體患者的治療和人群結(jié)核病的防控中都起著重要作用[2]。TREK Sensititre MYCOTB藥敏板（簡(jiǎn)稱(chēng)MYCOTB，美國(guó)賽默飛世爾公司）可測(cè)定12種一線、二線抗結(jié)核藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），相較于傳統(tǒng)固體比例法藥物敏感性試驗(yàn)，有著耗時(shí)少、單次可檢測(cè)多種藥物、藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果更精細(xì)等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。因MYCOTB在需要判讀多個(gè)孔內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況時(shí)對(duì)細(xì)菌的接種量有著極其嚴(yán)格的要求，使其在臨床應(yīng)用上存在雙人判讀結(jié)果不一致和重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果不一致的問(wèn)題。

MYCOTB操作手冊(cè)建議采用玻璃珠振蕩研磨法對(duì)菌株進(jìn)行研磨分散，用配套濁度儀定量，菌懸液需要多次稀釋定量以達(dá)到目標(biāo)濃度。接種于藥敏板的菌液終濃度受人為因素影響較大，多次稀釋容易產(chǎn)生大量氣溶膠，存在實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患。細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀利用超聲波分散原理，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌分散與濁度檢測(cè)的同步，快速、簡(jiǎn)單、安全[6]。本研究將細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)比2種菌懸液制備方法的效果，通過(guò)肉眼觀察、抗酸染色鏡檢、藥敏板中菌落形態(tài)和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，評(píng)估細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀在MTB MIC檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

以上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室收集保藏的23株耐多藥MTB臨床菌株（編號(hào)1～23），5株全敏感MTB臨床菌株（編號(hào)24～28）為研究對(duì)象，MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC 27294）由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與試劑

BACspreader 1100細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀（簡(jiǎn)稱(chēng)1100分散儀，廣東體必康生物科技有限公司）；Sensititre微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，包括Vortex-Genie2多功能漩渦混合器（Cole-Parmer）、手工比濁儀、AIM-自動(dòng)菌液接種系統(tǒng)、Vizion-自動(dòng)微生物藥敏分析系統(tǒng)、MTB藥敏板（MYCOTB，含12種不同濃度抗結(jié)核藥物）、振蕩管（含玻璃珠和含0.5% Tween-80的0.9%NaCl溶液）、0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)管、0.9%NaCl溶液。

1.3 制備菌懸液

1.3.1 玻璃珠震蕩法 采用接種環(huán)挑取改良羅氏培養(yǎng)基（瑞士羅氏公司）斜面適量菌落，放入振蕩管中，在漩渦混合器中振蕩30 s，在室溫條件下靜置15 min后，放入手工比濁儀器中，滴加0.9%NaCl溶液混合及定量，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫取?/p>

1.3.2 分散儀法 采用接種環(huán)挑取改良羅氏培養(yǎng)基斜面適量菌落，放入含2 mL無(wú)菌0.9%NaCl溶液的超聲分散專(zhuān)用試管中，將試管放入1100分散儀，超聲分散30 s（超聲分散5 s，暫停5 s，實(shí)際對(duì)細(xì)菌超聲分散15 s）。按照儀器顯示屏上顯示的數(shù)字，加入相應(yīng)體積的0.9%NaCl溶液，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫取?/p>

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

取100 μL制備好的菌懸液，加入11 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基（美國(guó)BD公司）中混勻，采用AIM-自動(dòng)菌液接種系統(tǒng)分裝至96孔MYCOTB中，每孔100 μL。完成后將MYCOTB貼上封膜，放置在37 ℃溫箱中孵育。培養(yǎng)10 d后，采用Vizion-自動(dòng)微生物藥敏分析系統(tǒng)判讀結(jié)果，并拍照保存。每個(gè)藥敏板都由雙人判讀，以第1個(gè)人的判讀結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，第2個(gè)人的判讀結(jié)果用于評(píng)估2個(gè)人判讀結(jié)果的一致性。

1.5 質(zhì)量控制

每批藥物敏感性試驗(yàn)均以MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC 27294）作為質(zhì)控菌株。玻璃珠震蕩研磨法中，每批試驗(yàn)前均用配套的0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)管對(duì)所用的比濁儀進(jìn)行校準(zhǔn)；分散儀法中所用的1100分散儀使用前均進(jìn)行濁度校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0軟件和Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)理整理和分析。對(duì)2種方法制備菌懸液的MIC藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一致性檢測(cè)（Kappa檢驗(yàn)），以Kappa值≥0.75為2種方法一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 分散效果

應(yīng)用玻璃珠震蕩研磨法和分散儀法制備28株MTB臨床菌株和MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC 27294）0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?。肉眼觀察結(jié)果顯示，分散儀法制備的菌懸液比玻璃珠振蕩研磨法更均勻，無(wú)明顯大的菌落顆粒（圖1）。取2種方法制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙焊?滴，紫外照射固定2 h后抗酸染色，顯微鏡下觀察，鏡下可見(jiàn)分散儀法制備的菌懸液比玻璃珠振蕩研磨法分散更均勻，細(xì)菌成團(tuán)較少（圖2）。

圖1 2種方法制備的菌懸液分散效果比較

2.2 藥敏板中菌落形態(tài)

根據(jù)MYCOTB說(shuō)明書(shū)要求，經(jīng)過(guò)10 d 37℃溫箱培養(yǎng)后，將MYCOTB放入Vizion-自動(dòng)微生物藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀。結(jié)果顯示，相較于玻璃珠振蕩研磨法，分散儀法制備的菌懸液細(xì)菌生長(zhǎng)活力更好，孔中細(xì)菌生長(zhǎng)面積更大，結(jié)果更易判讀（圖3）。

圖3 2種方法制備的菌懸液在MYCOTB中的菌落形態(tài)

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

28株MTB臨床菌株和MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC 27294）的MIC值結(jié)果和藥物敏感性試驗(yàn)比對(duì)結(jié)果顯示，2種不同前處理方法制備的菌懸液對(duì)12種一線和二線抗結(jié)核藥物（鏈霉素、異煙肼、乙胺丁醇、利福平、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、對(duì)氨基水楊酸、乙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸和卡那霉素）的符合率均為100%，Kappa值均為1.00，僅有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的環(huán)絲氨酸和3株菌株的卡那霉素的MIC值存在1個(gè)梯度的量化誤差。由于這些量化誤差均不處于MTB對(duì)各藥物的耐藥濃度附近，故不影響結(jié)果的判讀。見(jiàn)表1、表2。

表1 玻璃珠振蕩法和分散儀法制備菌懸液進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)的MIC值 μg/mL

續(xù)表1

表2 2種方法制備的菌懸液藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較 株

3 討論

菌懸液的制備和定量是MTB藥物敏感性試驗(yàn)，尤其在MIC藥物敏感性試驗(yàn)這類(lèi)定量試驗(yàn)中的關(guān)鍵操作[6]。目前，我國(guó)大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室主要采用研磨棒研磨和玻璃珠振蕩的方法進(jìn)行菌落分散，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芑虮葷醿x進(jìn)行定量，多次加入含0.5%Tween-80的0.9%NaCl溶液進(jìn)行逐步稀釋比對(duì)，最終獲得目標(biāo)濃度的菌懸液。上述2種方法在研磨、多次稀釋混合中均會(huì)產(chǎn)生大量氣溶膠，存在生物安全隱患。同時(shí)，由于是手工操作，細(xì)菌懸浮液的均勻度受細(xì)菌研磨時(shí)間等人為因素影響，樣本個(gè)體之間存在很大差異，這也是影響藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的最常見(jiàn)的人為因素[7]。細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀通過(guò)超聲波在液體中的空化作用來(lái)分散菌落，分散、濁度檢測(cè)和稀釋體積計(jì)算的整個(gè)過(guò)程在一個(gè)封閉的空間中完成[8]，不需要移動(dòng)液體，減少了污染，最大程度地確保了生物安全性，并大大提高了效率。

本研究通過(guò)肉眼觀察、抗酸染色鏡檢、藥敏板中菌落生長(zhǎng)形態(tài)和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)，對(duì)玻璃珠振蕩研磨法和分散儀法制備的菌懸液的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，相較于玻璃珠振蕩研磨法，分散儀法對(duì)MTB分散得更均勻，無(wú)明顯大的菌落顆粒，且抗酸染色鏡檢未見(jiàn)明顯菌體聚集現(xiàn)象。有多項(xiàng)研究將手工研磨處理的菌懸液和分散儀處理的菌懸液進(jìn)行比較，結(jié)果均顯示分散儀對(duì)微生物菌落的分散效果更好[6-8]。本研究比較了玻璃珠振蕩研磨法和分散儀法對(duì)菌落的分散效果，結(jié)果仍是分散儀的分散效果更均勻，說(shuō)明應(yīng)用超聲波在液體中的空化作用來(lái)分散菌株的效果要遠(yuǎn)優(yōu)于手工和機(jī)械物理研磨。馮通明等[6]的研究結(jié)果也證實(shí)了只要分散時(shí)間不超過(guò)120 s，超聲并不會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)活性。

本研究中，將采用2種方法制備的菌懸液接種于MYCOTB 37 ℃培養(yǎng)10 d后，接種分散儀法制備的菌懸液的藥敏板孔內(nèi)菌落面積更大，更便于檢測(cè)人員通過(guò)Vizion-自動(dòng)微生物藥敏分析系統(tǒng)判讀結(jié)果。由于藥物敏感性試驗(yàn)是定量試驗(yàn)，MYCOTB需要檢測(cè)人員在1個(gè)視野下觀測(cè)96孔板中各個(gè)孔內(nèi)菌落的生長(zhǎng)情況，這給MIC藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的判讀帶來(lái)挑戰(zhàn)。有研究結(jié)果顯示，MYCOTB存在雙人判讀結(jié)果不一致的情況[2]，分散儀法能很好地解決這一問(wèn)題。這可能是由于分散儀法制備的菌懸液分散均勻，且無(wú)大顆粒菌塊，使得96孔板中每個(gè)孔內(nèi)細(xì)菌的接種菌量相對(duì)穩(wěn)定、分散，使得相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)接種分散儀法制備的菌懸液的藥敏板孔內(nèi)菌落面積更大，提高了雙人判讀的一致率。

以美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)液體培養(yǎng)基中抗結(jié)核藥物耐藥臨界濃度為耐藥判斷依據(jù)[9]，本研究2種菌懸液制備方法得到的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，12種抗結(jié)核藥物的耐藥性結(jié)果符合率為100%；但有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的環(huán)絲氨酸和3株菌株的卡那霉素2種方法制備的菌懸液藥物敏感性試驗(yàn)的MIC值存在1個(gè)梯度的量化誤差。后續(xù)我們對(duì)這些存在1個(gè)梯度誤差的樣本進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)玻璃珠振蕩研磨法制備的菌懸液的MIC值存在前后2次結(jié)果不一致的情況，而分散儀法的重現(xiàn)性則非常好。提示接種菌量的差異可能導(dǎo)致MIC檢出結(jié)果出現(xiàn)上下1個(gè)濃度差異的結(jié)果。國(guó)外也有研究結(jié)果顯示，在MYCOTB 藥物敏感性試驗(yàn)中，增加或減少接種濃度會(huì)極大降低部分藥物MIC值的重現(xiàn)性[10]。由于臨床上耐受乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星和莫西沙星這類(lèi)抗結(jié)核藥物的菌株的耐藥濃度常處于判定耐藥與否的臨界濃度附近[11-12]，導(dǎo)致藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果中的梯度誤差會(huì)造成上述藥物藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的誤判，所以分散儀法可提高藥物敏感性試驗(yàn)這類(lèi)定量試驗(yàn)中接種菌量的精確性，增加MIC值處于臨界濃度的臨床菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀可以提高M(jìn)TB菌懸液制備的自動(dòng)化程度，尤其在藥物敏感性試驗(yàn)這類(lèi)定量試驗(yàn)中，可改善接種菌量的精確度和結(jié)果判讀的一致性，減少人為因素引起的定量誤差，有利于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和重現(xiàn)性。