楊仁義，顏思陽，周德生，高曉峰，傅馨瑩，龔翠蘭，劉利娟*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

卒中作為最常見的腦血管病之一，是我國第一大死亡原因［1-2]。《中國卒中防治報告2019》［3]數據顯示，我國總體卒中終生發(fā)病風險為39.9%，位居全球首位，其中腦梗死約為82%，嚴重威脅居民身體健康［4]。目前全世界公認的腦梗死有效治療為靜脈溶栓、機械取栓，但嚴格的時間窗或副作用限制了其應用。腦梗死屬中醫(yī)“缺血性中風”范疇，榮氣［5]是一切精微物質的總稱，歸臟腑之氣，而榮氣虛滯［6]是缺血性中風的關鍵病機?；跇s氣理論創(chuàng)制的活血榮絡方是湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，納入臨床路徑已12 年，前期臨床研究發(fā)現［7-10]活血榮絡方能降低Glu、Asp、CF6、Ca2+、CD62p 等水平，升高GABA、Gly 等水平，有效抑制血小板聚集、清除氧自由基等，從而改善腦梗死后痙攣性癱瘓、認知能力、神經功能癥狀；前期實驗研究發(fā)現［11-15]活血榮絡方能上調Caveolin-1、CD31+、下調 MMP-9 表達，激活JAK2/STAT3 信號通路，減輕腦梗死急性期炎癥反應，促進血管新生，改善腦梗死后神經功能缺損。但活血榮絡方促腦梗死后血管新生的腦保護機制有待進一步深入研究，因此本項目結合生物信息學技術與大鼠腦缺血再灌注模型，以篩選出的“轉錄因子（TF）-微小RNA（miRNA）”反饋環(huán)為機制，在RNA 水平研究活血榮絡方改善腦梗死大鼠神經功能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 10～12 周齡SPF 級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40 只，體質量230～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，晝夜交替各12 h，溫度21～26 ℃，相對濕度40%～50%。實驗經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（20201010-13），操作均按照美國國立衛(wèi)生研究院制定的實驗動物使用指南標準［16]。

1.2 試劑與藥物 活血榮絡方（湘藥制字Z20080472），組方藥材雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g，均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經本院張裕民主任藥師鑒定為正品，質量均符合2020 年版《中國藥典》 規(guī)定。制備方法為將乳香、沒藥粉碎，其余藥材混合，10倍量水浸泡12 h 后煎煮2 h，第2 次加8 倍量水煎煮1 h，第3 次加5 倍量水煎煮1 h，合并3 次提取液，旋轉蒸發(fā)儀上濃縮冷卻，即得，4 ℃下保存?zhèn)溆?。根據人動物體表面積換算法，用蒸餾水將活血榮絡方浸膏稀釋為每1 mL 含1.1 g 生藥的藥液，按1 mL/100 g 劑量灌胃。丁苯酞軟膠囊（石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，批號H20050299）。RNA提取試劑盒、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為 G3013、G3330、G3322）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，貨號分別為10006818、80109218、10009218）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（美國HyClone 公司，貨號SH30538.02）。

1.3 儀器 石蠟切片機（美國Thermo Scientific 公司）；顯微成像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；超微量分光光度計（美國Thermo 公司）；臺式高速冷凍型微量離心機［大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

2 方法

2.1 腦梗死差異miRNA（DEMs）及差異基因（DEGs）的GEO 數據挖掘

2.1.1 數據檢索與下載 通過美國國家圖書館（NCBI）基因表達綜合數據庫GEO 子數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Cerebral Infarction”或“Cerebral Ischemia”為檢索詞，獲取腦梗死m(xù)iRNA（如GSE97532）與mRNA（如GSE119121）微陣列分析數據，下載數據集中表達矩陣文件。

2.1.2 數據歸一化 采用R 語言，利用Xi=［Xi-min（X1～n）] ∕［max（X1～n）-min（X1～n）]公式將表達矩陣進行歸一化處理。

2.1.3 DEMs 與DEGs 挖掘 采用R 語言“l(fā)imma包”對表達矩陣（如GSE97532、GSE119121）分別進行差異分析，以｜ logFC ｜ ＞1；P-value＜0.05為篩選條件確定DEMs 與DEGs，分別繪制DEMs熱圖、DEGs 火山圖。

2.2 DEMs 反向靶基因與正向轉錄因子的預測及對“TF-miRNA”反饋環(huán)的構建 TF 的翻譯合成受miRNA 調控，同時TF 具有轉錄miRNA 的功能，所以特定的TF 與miRNA 可形成“TF-miRNA”反饋環(huán)在疾病中發(fā)揮作用。

2.2.1 DEMs 反向靶基因預測 通過TargetScans［17]（http：//www.targetscan.org）、starBase［18]（http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/）數據庫對miRNA 反向靶基因進行預測，整合算法與實驗驗證的DEMs 反向靶基因。

2.2.2 DEMs正向TF 預測通過 TransmiR v2.0［19-20]數據庫（http：//www.cuilab.cn/transmir）對miRNA 正向TF 進行反向預測，整合算法與實驗驗證的DEMs 正向TF。

2.2.3 “TF-miRNA”反饋環(huán)中TF 聚焦 通過韋恩圖取“DEGs”“DEMs 反向靶基因”“DEMs 正向TF”三者的交集，以獲取反饋環(huán)中特定TF。

2.2.4 “TF-miRNA”反饋環(huán)中miRNA 聚焦 根據聚焦出的特定TF，結合TransmiR v2.0 數據，在DEMs 中檢索特定miRNA。

2.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備 各組大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，術前12 h 禁食不禁水。以10%水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，參考Longa 等［21]報道的大腦中動脈阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）梗阻大鼠右側中動脈，鈍性分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），從ECA 與ICA 分叉部約（4±2）mm 處剪口進拴線，插入約（18±2）mm，將ICA 掛線系牢，缺血2 h 后，拔出拴線進行再灌注。假手術組分離CCA、ECA、ICA，不插入拴線，其余過程同造模組，大鼠術后6 h 自由進食飲水。參考Zea-Longa’s 級［21]標準評分法，取1～3 分大鼠進行后續(xù)實驗。

2.4 分組及給藥 將SD 大鼠隨機分為4 組，分別為假手術組、模型組、活血榮絡方組及丁苯酞組，每組各10 只，實驗過程中出現死亡、取材時發(fā)現蛛網膜下腔出血或腦出血剔除則根據需要予以補充。術后6 h 灌胃，活血榮絡方組予以活血榮絡方藥液［11]（11.7 g/kg），丁苯酞組予以丁苯酞混懸液（60 mg/kg），假手術組與模型組予以生理鹽水（10 mL/kg），每天固定時間點灌胃給藥1 次，連續(xù)7 d［13-14]。

2.5 改良神經功能缺損評分（mNSS）大鼠神經功能采用改良神經功能缺損評分（mNSS）［22]進行評價，包括運動測試、感覺測試、平衡木測試、反射消失或動作異常共18 分，評分越高，損傷程度越嚴重，于1、3、7 d 開始。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色與尼氏（Nissl）染色 大鼠腹主動脈采血后心臟灌注生理鹽水200 mL，換4% 多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中保存。腦組織經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（3 μm，冠狀位）、脫蠟、復水、染色（HE、Nissl 染色）等步驟后，顯微成像系統(tǒng)獲取腦組織神經元圖像，參考丁元元等［23]報道，采用腦組織病理學評分表對大鼠HE染色進行評價，評定標準見表1。

表1 腦組織病理學評分Tab.1 Scores for brain tissue histopathological assessment

2.7 腦組織“TF-miRNA”反饋環(huán)miRNA、mRNA的檢測 采用熒光定量PCR（real-time PCR，RTPCR）法檢測腦梗死大鼠腦組織中“TF-miRNA”反饋環(huán)相關KLF4、KLF5、VEGF mRNA 及miR-206、miR-429 miRNA，取腦組織100 mg，用1 mL Trizol Reagent 提取腦組織總RNA，Nanodrop 2000檢測RNA 濃度及純度。采用RT First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，按照試劑盒說明書進行擴增，反應體系為2× qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmmol/L 基因引物1.5 μL，反轉錄產物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL，預變 性95 ℃，10 min，循環(huán)（40 次）95 ℃，15 s 至60 ℃，60 s，熔解曲線60～95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。miRNA 以U6 為內參，mRNA 以GAPDH 為內參，相對表達量采用2-ΔΔCt進行分析，引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences

2.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，組間比較若符合正態(tài)性且方差齊性時，采用單因素方差分析LSD、SNK 法進行兩兩比較；方差不齊時，采用Tamhane T2、Dunnett T3 法進行方差檢驗和兩兩比較；若不符合正態(tài)性時，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 DEMs、DEGs 篩選 采用R 語言“l(fā)imma 包”對GSE97532、GSE119121 表達矩陣進行差異分析，將模型組與假手術組進行對比以獲取DEMs、DEGs。DEMs（圖1）共有36 個，其中有27 個miRNA（miR-206、miR-429、miR-23a-5p 等）在模型組中高表達，9 個miRNA（miR-23b-5p、miR-181a、miR-107-5p 等）在模型組中低表達；DEGs（圖2）共有271 個，其中有169 個mRNA（KLF4、TLR2、KLF5 等）上調，102 個mRNA（CD79B、EBF1、HMGN3 等）下調。

圖1 DEMs 表達熱圖Fig.1 Heat map of DEMs expression

圖2 DEGs 表達火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs expression

3.2 DEMs 反向靶基因與正向轉錄因子預測及“TF-miRNA”反饋環(huán)構建 采用TargetScans、starBase 預測出36 個DEMs 的反向靶基因（如TLR2、BNDF、STAT3 等）共13 764 個，采用TransmiR v2.0 數據庫預測出36 個DEMs 的正向TF（如 KLF4、KLF5、STAT3 等）共 309 個。取“DEGs”“DEMs 反向靶基因”“DEMs 正向TF”三者的交集（圖3），共獲取5 個腦梗死差異表達轉錄因子基因，分別為 KLF4、KLF5、HMGN3、EBF1、TLR2。

圖3 “DEGs”“反向靶基因”與“正向TF”韋恩圖Fig.3 Venn diagrams for“DEGs”，“Downstream-Target-Genes”and“Upstream-TF”

根據聚焦出的5 個特定TF 結合TransmiR v2.0數據，在DEMs 中檢索特定TF 能轉錄的miRNA，其中TLR2 能轉錄的miRNA 與DEMs 無交集，取余下4 個特定TF 轉錄的miRNA 與DEMs 的交集，可初步構成“TF-miRNA”反饋環(huán)（圖 4），即“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-544”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”“EBF1-miR-429”5 個“TF-miRNA”反饋環(huán)。KLF4、KLF5 屬于轉錄因子Kruppel 家族蛋白，在神經再生、血管新生、細胞凋亡等機體修復生命進程中發(fā)揮重要作用；EBF1 屬于早期B 細胞因子家族蛋白，主要與B 細胞介導的免疫反應有關，因此本研究以機體修復為切入點，采用分子和動物實驗方法，以“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”為重點研究對象，對生物信息學預測的“TF-miRNA”反饋環(huán)進行初步驗證，同時為后續(xù)研究提供新機制及理論基礎。

圖4 “TF-miRNA”反饋環(huán)韋恩圖Fig.4 Venn diagrams for“TF-miRNA”feedback loop

3.3 改良神經功能缺損評分 與假手術組比較，模型組、活血榮絡方組、丁苯酞組1、3、7 d 評分升高（P＜0.01），神經功能缺損嚴重（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡方組、丁苯酞組1 d 評分無明顯變化（P＞0.05），神經功能缺損無明顯改善，3、7 d 評分降低（P＜0.01），神經功能缺損改善，見表3。

表3 活血榮絡方對腦梗死大鼠1、3、7 d 神經功能的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on rats’ neural function on the 1st，3rd and 7th days after cerebral infarction（，n=10）

表3 活血榮絡方對腦梗死大鼠1、3、7 d 神經功能的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on rats’ neural function on the 1st，3rd and 7th days after cerebral infarction（，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 HE、Nissl 染色 圖5A、5C 顯示，假手術組神經元形態(tài)完整、排列緊密、結構清晰；與假手術組比較，模型組神經元細胞固縮、數量減少、染色質不均勻、部分細胞水腫、細胞間隙增寬（P ＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡方組、丁苯酞組神經元損傷減輕、數量增多、水腫減輕、間隙變?。≒＜0.05，P＜0.01）；圖5B、5D 顯示，假手術組神經元完整，尼氏體結構清晰，排列緊密。與假手術組比較，模型組神經元結構異常，數量較少，呈空泡樣變或壞死，尼氏小體數目減少（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡組、丁苯酞組神經元形態(tài)好轉，損傷減輕，尼氏小體數目增多，染色均勻，間隙變?。≒＜0.05）。各組腦組織皮質、海馬區(qū)病理學評分及尼氏小體數目見表4。

表4 各組腦梗死大鼠腦組織皮質、海馬區(qū)病理學評分及尼氏小體數目比較（，n=5）Tab.4 Comparison of pathological scores and Nissl body counts in cerebral cortex and hippocampus of cerebral infarction rats among various groups（，n=5）

表4 各組腦梗死大鼠腦組織皮質、海馬區(qū)病理學評分及尼氏小體數目比較（，n=5）Tab.4 Comparison of pathological scores and Nissl body counts in cerebral cortex and hippocampus of cerebral infarction rats among various groups（，n=5）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖5 各組腦梗死大鼠病理變化（×400）Fig.5 Pathological changes of cerebral infarction rats in various groups（×400）

3.5 大鼠腦組織“TF-miRNA”反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達 與假手術組比較，模型組、活血榮絡方組、丁苯酞組大鼠腦組織KLF4、KLF5、VEGF mRNA、miR-206 與miR-429 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡方組與丁苯酞組KLF4 表達升高（P＜0.01），活血榮絡方組KLF5、VEGF 表達升高（P＜0.05），丁苯酞組KLF5、VEGF 表達升高（P ＜0.01），活血榮絡方組與丁苯酞組miR-206、miR-429 表達降低（P＜0.01），見表5。

表5 活血榮絡方對“TF-miRNA” 反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of miRNA and mRNA in“TF-miRNA”feedback loop（，n=5）

表5 活血榮絡方對“TF-miRNA” 反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of miRNA and mRNA in“TF-miRNA”feedback loop（，n=5）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

“TF-miRNA”反饋環(huán)［24]是TF 與miRNA 之間存在的直接或間接的反饋調控關系。TFs 能轉錄基因的表達，miRNA 能靶向抑制基因的轉錄后翻譯，腦梗死發(fā)生時，細胞中TFs 與miRNAs 會被廣泛影響，可構成“TF-miRNA”反饋環(huán)，共同影響腦梗死疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后。本研究從GEO 數據庫中挖掘出腦梗死相關DEGs 與DEMs，結合“TFmiRNA”反饋環(huán)模式，初步構成“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-544”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”“EBF1-miR-429”5 個腦梗死相關“TFmiRNA”反饋環(huán)。反饋環(huán)中TF主要由KLF4、KLF5、EBF1 構成，miRNA 主要由miR-206、miR-429、miR-544 構成。研究發(fā)現 KLF4［25-27]、KLF5［28]在缺血性腦損傷中被上調，其轉錄后水平調控主要與miRNA（miR-200b［29]、miR-195［28]等）的靶向抑制翻譯作用有關，而KLF4 的過表達能促進miRNA（miR-200b、miR-183［30]等）的表達，KLF5的過表達促進miRNA（miR-29a［31]、miR-200［32]等）的表達，因此本研究初步構成的5 個“TF-miRNA”反饋環(huán)可能在腦梗死疾病中發(fā)揮作用。同時研究發(fā)現缺血缺氧環(huán)境下，KLF4 可上調VEGF 的水平［33]，促進血管內皮細胞（ECs）增殖、遷移和管形成。Zhou 等［34]研究發(fā)現沉默eEF2K 可以有效降低KLF5 轉錄因子的蛋白水平，降低與VEGF 啟動子結合的KLF5 的水平，導致VEGF mRNA 表達下降，抑制血管新生。因此，以KLF4、KLF5 為轉錄因子構成的反饋環(huán)可轉錄上調VEGF 分子，激活VEGF 信號通路，在腦梗死后血管新生中發(fā)揮正向調節(jié)作用。

榮氣是一切精微物質的總稱［5]，榮氣氣化［35]是“精化氣→氣生變→變成形”的過程，可促進腦梗死后血管再生。本團隊首次提出缺血中風辨治理論體系——“榮氣虛滯”，并創(chuàng)立活血榮絡法，制定了活血榮絡方，在臨床中頗有療效。前期研究證實活血榮絡方［11，13]以常規(guī)劑量干預腦梗死大鼠7 d具有較好的促腦梗死血管新生的作用，因此本研究采用腦梗死大鼠模型，進一步驗證構成的“TF-miRNA”反饋環(huán)可能在腦梗死疾病中發(fā)揮作用，并驗證該保護作用可能與此反饋機制介導的血管新生有關。

本研究表明，活血榮絡方與丁苯酞可改善腦梗死大鼠神經功能缺損，且具有時間依賴性；HE、Nissl 染色結果顯示藥物干預下神經元損傷及水腫減輕，細胞間隙縮小，尼氏小體數目增加，表明活血榮絡方與丁苯酞均能對腦梗死大鼠起到神經保護作用；RT-PCR 結果顯示，腦梗死大鼠腦組織中KLF4、KLF5、VEGF 與miR-206、miR-429 表達均升高，同時活血榮絡方與丁苯酞能進一步升高腦梗死大鼠腦組織中KLF4、KLF5、VEGF 表達，而降低miR-206、miR-429 表達，結合反饋環(huán)模式，可認為活血榮絡方與丁苯酞可能下調miR-206、miR-429，上調KLF4、KLF5，影響腦梗死中存在的“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”負反饋環(huán)，進而上調VEGF，促腦梗死后血管新生，從而起到神經保護作用。VEGF［36]能促進ECs 增殖、遷移、分化，介導三級側支循環(huán)血管新生，改善腦梗死后局部血供，代償性營養(yǎng)神經元。Zhou 等［37]采用同步輻射血管造影（SRA）技術，發(fā)現丁苯酞干預 7、14 d，能上調 VEGF、VEGFR2、CD31 等血管新生蛋白表達，增加腦梗死大鼠血流灌注及血管密度，促進腦梗死后血管新生。因此活血榮絡方與丁苯酞均能上調TFs（KLF4、KLF5）、下調miRNAs（miR-206、miR-429）的表達，打破腦梗死大鼠中存在的“TFmiRNA”反饋環(huán)，介導ECs 中VEGF 的表達，促進腦梗死后血管新生。

綜上所述，活血榮絡方能抑制miRNA（miR-206、miR-429 等）的表達，促進細胞質中特定的TF（KLF4、KLF5 等）的表達，打破特定“TFmiRNA”反饋環(huán)，促進VEGF 分子表達，可能在腦梗死后神經保護方面發(fā)揮作用；同時為研究中成藥/中醫(yī)藥提供新的研究方向或是思路。