韓曉瑜，李嘉斌，丁杰英，溫慶偉

（1.浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021）

糖尿病是人體代謝紊亂所造成的基礎疾病且無法根治而伴隨終身，因此長期高血糖會導致多種的并發(fā)癥所發(fā)生［1]。糖尿病腎病是因為腎臟的高糖環(huán)境使大量的活性氧（ROS）產(chǎn)生而造成腎臟微血管氧化應激損傷的常見糖尿病并發(fā)癥，其多出現(xiàn)于糖尿病后期病程上。對糖尿病腎病的治療主要以藥物調控血糖，同時聯(lián)合血管緊張素轉化酶抑制劑和鈣拮抗劑藥物進行治療［2-3]。但從治療效果看，存在著個體差異大、治療效果不佳等情況，所積極探索防治糖尿病腎病的藥物具有十分重要的現(xiàn)實意義。

姜黃素是從傳統(tǒng)中藥材姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa L.）的根莖中提取的一種多酚類物質，具有良好的降血糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性，但是其對糖尿病腎病的機制尚不完全清楚［4-5]。本研究采用多次注射低劑量鏈脲佐菌素及摘除右腎法誘導建立糖尿病腎病小鼠模型，探討姜黃素對糖尿病腎病小鼠腎臟自噬及氧化應激的影響，為其在糖尿病腎病的防治中提供科學的藥理學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠，SPF 級，體質量18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（桂）2017-0005。實驗開始前小鼠進行適應性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥品與試劑 纈沙坦片，海南皇隆制藥股份有限公司（批號190114）；姜黃素，瑞士Adamas 公司（純度98%，批號190124B）；鏈脲佐菌素，美國Sigma 公司（批號S075）；線粒體呼吸鏈復合物I、III 試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司（批號S075）；羥自由基（-OH）、活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號20190817、20190825）；錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）ELISA 試劑盒，晶美生物工程有限公司（批號20190907、20190912、20190909）；尿蛋白（UP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）試劑盒，上海榮盛生物技術有限公司（批號 20190814、20190811、20190820）；Beclin1、LC 3、磷酸 化-mTOR（p-mTOR）一抗，英國Abcam 公司（批號191017、191011、190927）。

1.3 儀器 血糖儀，瑞士羅氏公司ACCU-CHEK Performa；7060C 型全自動生化分析儀，日本日立公司；9602A 酶標儀，北京艾普生設備有限公司；垂直電泳儀、轉膜及顯影設備、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 糖尿病腎病小鼠模型建立和給藥 參考文獻［6]，50 只空腹昆明小鼠行右腎摘除手術，另取10 只昆明小鼠為空白組行不摘除右腎的假手術。手術結束1 周后，向行摘除右腎的小鼠尾靜脈注射40 mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ），每天1 次，連續(xù)3 d。末次注射3 d 后，檢測小鼠空腹血糖（FBG），將FBG ≥11.1 mmol/L 的小鼠隨機分為模型組、纈沙坦組20 mg/kg、姜黃素高劑量組400 mg/kg、姜黃素低劑量組200 mg/kg，每組10 只，各組小鼠連續(xù)灌胃90 d，每日1 次；空白和模型對照組給予等量生理鹽水。

2.2 腎臟組織形態(tài)學改變評分 根據(jù)文獻［7]，隨機取互不重疊的10 個視野，對腎小球系膜基質增生、空泡樣變性、組織炎癥細胞浸潤3 項進行病變程度的半定量評分。計分為正常，0 分；輕度損害（病變范圍＜30%），1 分；中度損害（病變范圍30%～60%），2 分；重度損害（病變范圍＞60%），3 分。

2.3 觀察指標 末次給藥后，收集小鼠尿液計算尿量，并檢測24 h 尿蛋白（UP）含有量。血糖儀檢查小鼠FBG，測定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。HE 染色法觀察糖尿病腎病小鼠腎臟的病理學變化。試劑盒檢測法檢測腎臟的羥自由基（-OH）、活性氧（ROS）水平及線粒體呼吸鏈復合物I、III（Complex I、III）的活性。ELISA 法檢測腎臟錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。Western blot 檢測腎臟組織中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC 3 的蛋白表達。

3 結果

3.1 姜黃素對DN 小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN水平的影響 與空白組相比，模型組小鼠24 h 尿量增加，UP 及血清Scr、BUN 水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦組、姜黃素高、低劑量組小鼠的24 h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 水平減少（P＜0.05）；姜黃素高劑量組小鼠24 小時的尿量、UP 及血清Scr、BUN 含量低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

表1 各組小鼠24 h 尿量、UP 及血清中Scr、BUN 水平（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 糖尿病腎病小鼠腎臟組織病理學 空白組小鼠腎小球飽滿無空泡，無細胞壞死及炎性細胞浸潤情況；模型組小鼠腎組織中存在大量的空泡，腎小球系膜基質增生，包曼氏囊腔皺縮且較多炎性細胞浸潤；纈沙坦組組織空泡少見，包曼氏囊腔輪廓有所恢復，炎性細胞浸潤減少（P＜0.01）；姜黃素高劑量組腎小球結構較完整飽滿，包曼氏囊腔有少量空泡，包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少，少量炎性細胞浸潤（P＜0.01）；姜黃素低劑量組曼氏囊腔空泡及炎性細胞浸潤較多，但較模型組少（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學改變評分（，n=10）

表2 各組小鼠腎臟組織形態(tài)學改變評分（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖1 各組小鼠腎臟病理變化（HE，×400）

3.3 姜黃素對糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS 水平及Mn-SOD、CAT 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎臟中-OH、ROS 水平增加，Mn-SOD、CAT 的活性下降（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠的腎臟-OH、ROS 水平降低，Mn-SOD、CAT 水平增加（P＜0.05）；姜黃素高劑量組小鼠腎臟-OH、ROS 水平較姜黃素低劑量組低，Mn-SOD、CAT 的活性較姜黃素低劑量組高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

表3 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中-OH、ROS、Mn-SOD、CAT 水平（，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 姜黃素對糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性的影響 與空白組相比，模型組小鼠腎臟Complex I、III 活性降低（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠腎臟中Complex I、III 活性提高（P＜0.01）；姜黃素高劑量組小鼠腎臟Complex I、III 活性較姜黃素低劑量組高。見表4。

表4 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性（，n=10）

表4 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中Complex I、III 活性（，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

3.5 姜黃素對糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 的蛋白表達影響 與空白組比較，模型組小鼠腎臟中p-mTOR 蛋白表達增加，Beclin1表達及LC3 II/LC3 I 比值減少（P＜0.01）；與模型組相比，纈沙坦、姜黃素高、低劑量組小鼠的腎臟中p-mTOR 蛋白減少，Beclin1 蛋白表達及LC 3 II/LC 3 I 比值增加（P＜0.01）。見表5、圖2。

圖2 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白pmTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達

表5 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達（，n=10）

表5 各組糖尿病腎病小鼠腎臟中線粒體自噬蛋白p-mTOR、Beclin1、LC3 II/LC3 I 表達（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

自噬為真核細胞的一種高度保守的進化過程，是細胞內的自身修復、物質再利用、抵抗氧化應激和慢性炎癥反應等損傷的主要途徑，對維持細胞的穩(wěn)定起重要的作用［8]。自噬小體會包裹受損或老化的細胞質、細胞器、細胞內錯誤折疊蛋白質及大分子物質，通過溶酶體降解的方式，消除細胞毒性蛋白的聚集，使細胞內線粒體所產(chǎn)生的能力能被正常細胞所利用，維持細胞存活，而自噬異常則導致細胞功能障礙［9]。在腎組織中，自噬是腎小球濾過屏障的重要保護機制，正常情況下在腎臟的近端小管、足細胞都表現(xiàn)出高活躍度的自噬［10]。高糖的內環(huán)境下，會促進足細胞的自噬流，加速毛細血管擴張及腎小球硬化，誘導足細胞凋亡，致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

腎臟內的高血糖內環(huán)境激活DAGPKC-NADPH 氧化酶信號通路，上調ROS 的生成，大量ROS 的堆積及機體抗氧化酶水平相對不足，使體內氧化/抗氧化作用失衡，進一步損傷線粒體呼吸鏈酶中Complex I、III 活性和線粒體內三羧酸循環(huán)，致線粒體功能障礙引起細胞凋亡［11]。提高機體的抗氧化酶Mn-SOD、CAT 的活性，增加對ROS、-OH 的清除能了，減少體內的氧化應激的損傷，使線粒體呼吸鏈復合物活性提高，恢復線粒體功能，對治療糖尿病腎病有著重要的治療意義。但單純的提高機體的抗氧化酶的活性并不能很好的恢復腎臟細胞及線粒體的功能，因為被氧化應激損傷的線粒體、凋亡的細胞需要通過機體內的自噬降解，以提高線粒體及細胞的質量，增強細胞活力。因此在提高機體抗氧化能力的同時，還需增加機體對受損及壞死組織的自噬清除能力，才能更好的使線粒體所產(chǎn)生的能力能被正常細胞所利用，增強細胞的活力。

mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為自噬信號通路中一個十分關鍵的中心抑制劑［12]。mTOR 是缺乏氨基酸、生長因子、氧或ATP 等細胞應激源的自噬反應的匯集點，其通過負性調節(jié)的反饋機制，激活溶酶體重組多種因素誘導自噬的發(fā)生［13-14]。自噬效應蛋白Beclin1 和微管相關輕鏈蛋白LC 3 均是重要的自噬標記蛋白。自噬早期的囊泡由自噬效應蛋白Beclin1 與Ⅲ級PI3K 所結合形成的復合物［15]。正常情況下，LC 3 蛋白以LC 3 I 存在于細胞核內。當自噬啟動時，LC 3 I 會被Atg 4 酶切轉變成LC 3 II 的自噬體膜型，并與自噬體膜相結合［16]。故機體內LC 3 II 與LC 3 I 的比值及Beclin1 蛋白的表達水平會作為衡量自噬水平高低的評判指標。

本研究結果表明，姜黃素能改善糖尿病腎病下小鼠尿量、Scr、BUN、UP 的腎功能指標及其病理狀態(tài)，同時能提高腎臟中CAT、Mn-SOD、Complex I、III 的活性及降低-OH、ROS 的含量。減少p-mTOR 蛋白表達，增加Beclin1蛋白表達及LC 3 II/LC 3 I 比值。提示，姜黃素對糖尿病腎病小鼠的作用機制為提高機體抗氧化能力的同時增加機體自噬活性，以達到對腎臟的治療保護作用。