張 悅徐占玲孫慧峰雷 霞劉國良姚 遠張 寧*劉 斌*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江佳木斯 154007）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?]，以認知缺陷和神經(jīng)元喪失為特征，迄今缺少有效的治療藥物。所以，研發(fā)有效防治AD 的藥物是非常必要的。

AD 發(fā)病機制十分復雜，β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）被認為是誘發(fā)AD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［2]。近年來，黃酮類等天然多酚類物質(zhì)的抗氧化特性在對神經(jīng)退行性疾病方面潛在、有益的作用成為科學研究的重點［3]。柚皮苷全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種天然的二氫黃酮類化合物，以往對柚皮苷的研究大都集中在治療骨質(zhì)疏松［4]、預(yù)防動脈粥樣硬化［5]等方面?，F(xiàn)在，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向柚皮苷的神經(jīng)損傷保護等方面。Okuyama 等［6]將富含橙皮苷和柚皮苷果汁的干燥粉末給予腦缺血小鼠，發(fā)現(xiàn)口服后可以顯著抑制腦缺血誘導的海馬神經(jīng)細胞死亡，具有改善小膠質(zhì)細胞活化的能力。Singh 等［7]灌胃給予腦出血小鼠不同劑量的柚皮苷，再對探討動物進行一系列行為測試，用強迫游泳試驗和水迷宮試驗評估卒中后抑郁和記憶障礙，研究表明，柚皮苷可改善腦出血誘導的神經(jīng)認知缺陷，還能通過下調(diào)海馬中乙酰基膽堿酯酶活性和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）信號傳導途徑來消除順鉑引起的認知缺陷和膽堿能功能障礙［8]。由此可見，柚皮苷可能會成為治療神經(jīng)退行性疾病的佼佼者，但作用機制尚不清楚。

代謝組學以代謝產(chǎn)物或代謝網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)探究常見復雜疾病的發(fā)病機制或宿主環(huán)境發(fā)病機制的相互影響，在臨床前和臨床研究上都有廣泛的應(yīng)用［9]。代謝體是基因-環(huán)境相互作用的最終產(chǎn)物之一，它能識別并鑒別AD 的病理生理特征［10]。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）具有高分辨率、高靈敏度、有可供參考的標準圖譜庫、可對代謝產(chǎn)物定性等特點，已經(jīng)成為代謝組學實驗室的重要組成部分。

本研究首先采用Aβ25-35誘導PC12 細胞建立細胞損傷模型，將柚皮苷作用于損傷模型，利用GC-MS 技術(shù)對細胞進行代謝組學研究，檢測并解析給予柚皮苷后Aβ25-35誘導PC12 細胞內(nèi)小分子代謝物及相關(guān)分子通路的變化，為AD病理機制研究提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 柚皮苷（純度98%，批號LL60O53）購自北京百靈威科技股份有限公司。PC12 細胞（北京協(xié)和細胞資源中心）；Aβ25-35（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、雙抗、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清（美國HyClone 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）購于美國Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器 Agilent 6890N 型氣相色譜儀、Agilent 5975B 型質(zhì)譜儀、DB-5MS 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國安捷倫公司）；MK3 型酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；IX-71-21PH 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；HF90 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海立新儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 細胞培養(yǎng) PC12 細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）在含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中生長，37 ℃下通入5%的CO2進行培養(yǎng)，每2～3 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.1.2 MTT 法測定細胞活力 將細胞分為空白組（加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液）、Aβ25-35模型組（分別用10、20、40 μmol/L 的Aβ25-35處理PC12 細胞24 h）、給藥組（分別先給予柚皮苷1.0×10-3、1.0×10-2、1.0×10-1μmol/L處理2 h 后，再加入20 μmol/L Aβ25-35孵育24 h），每組6 個平行。

取對數(shù)生長的PC12 細胞，消化離心，棄掉上清，沉淀用DMEM 完全培養(yǎng)基重懸至均勻懸液，以2×104/mL 細胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，放進細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h，細胞進入對數(shù)期后吸棄舊的培養(yǎng)液，按照分組狀況加入相應(yīng)溶液（200 μL）孵育24 h 后加入MTT 溶液，每孔20 μL，在細胞培養(yǎng)箱中再孵育4 h，取出，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，在37 ℃恒溫振蕩器中振蕩10 min，充分溶解藍紫色甲臜結(jié)晶，用酶標儀在570 nm 波長下進行吸光度檢測，每個樣本3 次，取平均值。細胞增殖率=（OD實驗組/OD空白組）×100%。

2.1.3 統(tǒng)計學分析 以AIA 格式文件收集獲得的原始數(shù)據(jù)，用MZmine 2.5 軟件進行前處理，之后導入SIMCA-P軟件中進行PCA 和PLS-DA 分析統(tǒng)計，VIP 預(yù)測以及SPSS19.0 軟件做t 檢驗，篩選出潛在的代謝標記物。PC12細胞吸光度值及增值率結(jié)果用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較使用LSD 檢驗，S-N-K 法進行統(tǒng)計后校正，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 GC-MS 條件 色譜條件為DB-5Ms 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm）；進樣時溫度270 ℃；以高純氦氣為載氣；載氣體積流量1.0 mL/min，溶劑延遲3 min；分流采樣5∶1；進樣1 μL。質(zhì)譜條件為四級桿溫度150 ℃；電離方式EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描方式全掃描，掃描間隔0.2 s；電子倍增器電壓0.90 kV。細胞樣品梯度加熱程序為初始溫度70 ℃，運行3 min，以10 ℃/min 升至180 ℃，5 ℃/min 升至290 ℃，運行9 min。

2.2.2 細胞提取及衍生方法 取成對數(shù)生長期細胞，丟棄舊DMEM 完全培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌3 次，棄去生理鹽水，液氮淬滅，加入1.5 mL 乙腈-水（4∶1），用細胞刮刀刮下細胞，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，渦旋，細胞經(jīng)超聲細胞破碎儀破碎（功率為20%，工作2 s，間歇2 s）7 min，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，去除蛋白等大分子物質(zhì)。取1.2 mL 上清液置于離心管中，在40 ℃下氮吹，殘余物用50 μL 甲氧胺鹽酸鹽（15 mg/mL）復溶，渦旋，30 ℃水加熱90 min，37 ℃下加入70 μL MSTFA，持續(xù)30 min，取上清進行GC-MS 分析。

2.2.3 分組 空白組為PC12 細胞培養(yǎng)于新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基，不加Aβ；模型組為20 μmol/L Aβ25-35孵育PC12細胞24 h；給藥組為1.0×10-1μmol/L 柚皮苷孵育PC12 細胞2 h 后，加入20 μmol/L Aβ25-35后再孵育24 h。

2.2.4 數(shù)據(jù)提取 GC-MS 得到的原始數(shù)據(jù)利用自動質(zhì)譜去卷積鑒定（AMDIS）系統(tǒng)以AIA 的格式導出文件，將其導入Matlab 軟件，得到有代謝物保留時間和相應(yīng)峰面積組成信息的峰表。

2.2.5 模式識別與差異表達代謝物鑒定 將獲得的峰表導入SIMCA-P 12.0 軟件，進行主成分分析（PCA）和最小二乘法判別分析（PLS-DA），找到差異表達代謝物。再利用NIST 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對空白組和模型組共有的內(nèi)源性代謝物作鑒定，以匹配度＞70% 為衡量標準，得到可信的差異代謝物的結(jié)構(gòu)和名稱。

3 結(jié)果

3.1 細胞增殖率測定 與空白組比較，20 μmol/L Aβ25-35作用于細胞24 h 后細胞增殖率下降（P＜0.01），并且增殖率隨著Aβ25-35終濃度的增加而減小，說明造模成功。根據(jù)實驗結(jié)果結(jié)合文獻［11]，最后選用20 μmol/L Aβ25-35作用PC12 細胞24 h 來制備AD 的體外細胞模型。見表1。

表1 不同濃度的Aβ25-35處理24 h 對PC12 細胞增殖率的影響（，n=6）

表1 不同濃度的Aβ25-35處理24 h 對PC12 細胞增殖率的影響（，n=6）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01。

由表2 可以看出，與Aβ25-35模型組比較，柚皮苷處理后PC12 細胞增殖率增加（P＜0.01），說明柚皮苷能夠保護細胞，起到抗Aβ 損傷的作用。

表2 柚皮苷對Aβ25-35損傷PC12 細胞增殖率的影響（，n=6）

表2 柚皮苷對Aβ25-35損傷PC12 細胞增殖率的影響（，n=6）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與Aβ25-35 20 μmol/L 組比較，**P＜0.01。

3.2 GC-MS 分析 利用GC-MS 法對樣品進行掃描，得到細胞代謝樣本的總離子流圖，見圖1。根據(jù)各個化合物的質(zhì)荷比、保留時間、保留指數(shù)等進行鑒定，共鑒定出152個化合物，包括氨基酸類、脂肪酸類、糖類等小分子成分。

圖1 PC12 細胞代謝物的GC-MS 基峰色譜圖

4 討論

PCA 分析顯示，各組樣品之間有較好的分離度，說明模型組使細胞代謝通路發(fā)生改變，即造模成功，通過三維PLS-DA 示意圖進一步地證明了各組之間分離度良好。選取VIP 值＞1.0 且P＜0.05 的物質(zhì)，然后對照質(zhì)譜庫信息獲得27 個潛在生物標記物，并對化合物含量變化進行了分析，見表3。

表3 潛在生物標記物信息（）

表3 潛在生物標記物信息（）

注：↓表示下降，↑表示升高。與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

表3 顯示，模型組中氨基酸代謝途徑發(fā)生了變化，包括谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸等。谷氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)GABA 合成的前體，也是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，從突觸囊泡釋放后將結(jié)合NMDA 受體激活細胞［12]；丙氨酸由丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶胺化而成，涉及丙氨酸、丙酮酸、α-酮戊二酸的相互轉(zhuǎn)化［13]；谷氨酸和丙氨酸參與細胞生物能量學，模型組丙氨酸水平較低，表明模型組存在能量缺乏和線粒體功能障礙［14]。以絲氨酸為原料合成甘氨酸和半胱氨酸，前者是一種神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，本研究中其含量發(fā)生了變化。以往發(fā)現(xiàn)在AD 大鼠模型中，海馬、頂葉皮層D-絲氨酸水平升高［15]；L-絲氨酸水平也有所上升；絲氨酸消旋酶產(chǎn)生L-絲氨酸，后者水平降低；苯丙氨酸是芳香族氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，其改變在癡呆過程中起著關(guān)鍵作用［16]，表明模型組細胞內(nèi)氨基酸代謝紊亂。

高度不飽和脂肪酸可以引起脂質(zhì)過氧化，促進神經(jīng)毒性的產(chǎn)生。參與脂質(zhì)代謝的差異代謝物有棕櫚酸、硬脂酸、蘋果酸和膽固醇，模型組細胞內(nèi)棕櫚酸、硬脂酸及膽固醇減少，蘋果酸增加，柚皮苷可以使這些代謝物的含量恢復到空白組水平。APP/PS1 小鼠組織中磷脂含量明顯下降，這與磷脂酶活性增加有關(guān)［17]。硬脂酸是磷脂形成的最豐富的脂肪酸，脂肪代謝異常會導致細胞膜的功能異常。在以往對AD 患者血液的研究中，發(fā)現(xiàn)患者的棕櫚酸明顯低于正常組［18]，這與本實驗結(jié)果一致。有研究表明膽固醇異常與AD 發(fā)病有關(guān)，用T0901317 激活A(yù)PP/PS1 小鼠腦內(nèi)的肝X 受體，能使額葉皮層和海馬腦區(qū)膜膽固醇明顯降低，減少老年斑的沉積，改善小鼠記憶能力［19]，除了脂質(zhì)代謝發(fā)生變化還有許多與能量相關(guān)的代謝產(chǎn)物也發(fā)生了變化。

葡萄糖代謝、磷酸肌醇代謝與碳水化合物代謝有著密切的聯(lián)系，葡萄糖代謝異常是AD 典型病理特征［20]。本研究中與糖代謝相關(guān)的代謝物有檸檬酸、α-D-吡喃葡萄糖等，模型組à-D-吡喃葡萄糖和檸檬酸的含有量發(fā)生了變化，葡萄糖代謝出現(xiàn)異常。肌醇參與多種細胞功能，如信號傳導過程、細胞生長和分化等［21]，還是一種重要的膜成分，其腦衍生物參與突觸轉(zhuǎn)運和神經(jīng)遞質(zhì)分泌，并調(diào)節(jié)自噬［22]。模型組中肌醇含量發(fā)生改變，說明碳水化合物代謝異常。

綜上所述，本研究以GC-MS 代謝組學為理論依據(jù)，對空白組、模型組和給藥組代謝物進行多元統(tǒng)計分析，篩選出可能的生物標志物。Aβ25-35損傷組有多種代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生了改變，這些物質(zhì)主要與氨基酸代謝、碳水化合物代謝及脂質(zhì)代謝等相關(guān)聯(lián)，說明柚皮苷主要通過影響多種氨基酸和能量代謝發(fā)揮對Aβ25-35損傷的PC12 細胞的保護作用。