郭慧，田粟，陸淳，劉麗，王清波，耿云惠

（1.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050200；2.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050200)

0 引 言

乳酸菌是一種腸道有益菌，具有維持腸道微生態(tài)平衡[1]、抑制腸道有害菌生長繁殖[1]、調(diào)節(jié)腸道免疫功能[2]、改善腸道屏障功能[3]等多種保健功能。乳酸菌益生作用的機(jī)理一般分為兩種：一是直接作用，菌體本身及其活性代謝物對有害物質(zhì)的黏附或降解；二是間接作用，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝酶活性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性及機(jī)體部分酶活性，起間接益生作用。

本研究通過讓志愿者分別飲用滅菌型和活菌型乳酸菌飲料產(chǎn)品，分析其飲用前后的排便情況，糞便中短鏈脂肪酸含量變化，通過16SrDNA V4區(qū)測序分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐富度的差異，探究腸道菌群和糞便脂肪酸的聯(lián)系，從而評價(jià)滅菌型乳酸菌飲料調(diào)節(jié)腸道健康的功能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及儀器

滅菌型乳酸菌飲料、活菌型乳酸菌飲料，石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司；7890B氣相色譜儀（帶火焰離子檢測器），美國Agilent公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司；低溫高速離心機(jī)，美國Thermo公司；產(chǎn)物純化Gene-JET膠回收試劑盒，美國Thermo公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒，美國Thermo公司；Ion S5TMXL測序系統(tǒng)，美國Thermo公司。乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸和正己酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；16S V4區(qū)引物515F-806R，北京諾禾致源科技股份有限公司；Phusion?高保真DNA聚合酶，美國New England Biolabs公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用的是隨機(jī)對照的交叉設(shè)計(jì)。招募健康志愿者70人，性別是隨機(jī)的，其中男性18人，女性52人，年齡范圍是22～26歲。采用隨機(jī)對照的交叉設(shè)計(jì)，將受試人群隨機(jī)分為兩組，分別飲用滅菌型乳酸菌飲料和活菌型乳酸菌飲料各10 d，每天一瓶（200 mL）；然后經(jīng)過2周的洗脫期，再進(jìn)行第二階段，原來飲用滅菌型乳酸菌飲料的受試人群改變?yōu)轱嬘没罹腿樗峋嬃?，原來飲用活菌型乳酸菌飲料的受試人群開始飲用滅菌型乳酸菌飲料，持續(xù)10 d，每天1瓶（200 mL）。交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的是消除受試人群的個(gè)體差異。干預(yù)之前進(jìn)行基線測量，包括記錄身高和體重、連續(xù)3天的膳食日記，以及食物頻率、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣、飲水量、排便習(xí)慣的調(diào)查，并提供糞便樣本，保存在-80℃冰箱中直至測定處理。干預(yù)后進(jìn)行食物改變情況、排便情況的調(diào)查，收集糞便用于pH值、含水量、短鏈脂肪酸含量和腸道菌群16S的測定。最終完成調(diào)查問卷70人，糞便收集70人，在保證數(shù)據(jù)樣本量達(dá)到最低限度的情況下，隨機(jī)選擇其中25人的糞便用于腸道菌群16S的測定。

1.2.2 調(diào)查問卷

排便情況的調(diào)查使用的是Cleveland便秘評分系統(tǒng)。排便次數(shù)的調(diào)查，受試者直接回答飲用前后的排便次數(shù)。采用布里斯托大便分類法來評價(jià)排便形狀。

1.2.3 糞便中短鏈脂肪酸的測定

將來自-80℃冰箱的濕糞便物質(zhì)稱量1.0 g，放入15 mL管中，加入純凈水2 mL，旋渦混勻后，將此勻漿4 000 r/min離心10 min，將上清液14 000 r/min離心10 min，取上清液500μL，加入磷酸125μL，制成17%磷酸溶液，再次14 000 r/min離心10 min，取上清液490μL,加入200 mmol/L 2-乙基丁酸10μL，混勻，經(jīng)0.2μm濾膜過濾入進(jìn)樣瓶中，采用氣相色譜儀進(jìn)行檢測。氣相色譜條件：HP-FFAP柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為高純氮?dú)猓髁?.0 mL/min；輔助氣為氫氣和空氣；色譜柱升溫程序：初始溫度50℃保持3 min，以8℃/min升至120℃，以5℃/min升至170℃，以15℃/min升至240℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；進(jìn)樣體積：1μL，分流比5∶1。

1.2.4 腸道菌群的分離和16SrDNA擴(kuò)增子

采用CTAB法[4]對已處理樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，樣本濃度1 ng/μL，對16SV4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。文庫構(gòu)建使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行，將構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，用Ion S5TMXL高通量測序系統(tǒng)上機(jī)測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用EpiData 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，并進(jìn)行一致性檢驗(yàn)以保證雙錄入信息的準(zhǔn)確性。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對所得數(shù)據(jù)做正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，并根據(jù)相關(guān)結(jié)果進(jìn)一步分析，統(tǒng)計(jì)分析方法包括描述性統(tǒng)計(jì)、方差分析、t檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis Test等方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試人群兩次基線排便習(xí)慣的比較

交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，受試人群兩次基線排便習(xí)慣的比較，結(jié)果如表1所示。表1是交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，受試人群排便習(xí)慣各指標(biāo)兩次基線數(shù)據(jù)的比較結(jié)果。結(jié)果顯示，受試人群這兩次排便習(xí)慣各指標(biāo)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明洗脫時(shí)間是合理的，洗脫效果是成功的?？紤]到交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，同一種飲品是兩部分人在不同的時(shí)期飲用的，為了數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)，下述兩種飲料飲用前后排便習(xí)慣的比較時(shí)，基線數(shù)據(jù)都是每個(gè)人在喝該種飲品時(shí)相對應(yīng)的當(dāng)時(shí)的基線結(jié)果，而非兩個(gè)時(shí)期的基線的結(jié)果。

表1 受試人群兩次基線排便習(xí)慣結(jié)果的比較

2.2 排便情況變化

受試人群排便習(xí)慣各指標(biāo)的變化情況見表2～表4。其中，配對秩和，是將飲用后的數(shù)據(jù)與飲用前數(shù)據(jù)相減，得到差值，然后對差值絕對值排序，正數(shù)的秩次加起來是正秩和，負(fù)數(shù)的秩次加起來是負(fù)秩和。正秩和占優(yōu)，表明飲用后得分上升，負(fù)秩和占優(yōu)，表明飲用后得分下降。結(jié)果顯示，飲用滅菌型乳酸菌飲料后，受試人群的排便次數(shù)顯著增加，排便不完全感和排便困難程度得到了改善；飲用活菌型乳酸菌飲料后，可以顯著改變排便不完全感和排便形狀；但是從飲用后兩者各指標(biāo)比較的結(jié)果看，滅菌型和活菌型是沒有差異的（P＞0.05）。

表2 飲用滅菌型乳酸菌飲料前后比較結(jié)果

表3 飲用活菌型乳酸菌飲料前后比較結(jié)果

表4 飲用滅菌型和活菌型乳酸菌飲料排便習(xí)慣的比較

2.3 糞便中短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

如表5顯示，與基線數(shù)據(jù)比較，飲用滅菌型乳酸菌飲料后，短鏈脂肪酸中的乙酸、丙酸、正戊酸以及總短鏈脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有顯著性的降低，且乙酸、丙酸和總短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著性低于飲用活菌型乳酸菌飲料的結(jié)果。飲用活菌型乳酸菌飲料后，受試人群糞便中短鏈脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與基線沒有出現(xiàn)顯著性差異，但是，數(shù)據(jù)顯示有增加的趨勢，這可能與樣本量不夠多有關(guān)。

表5 糞便中短鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化 mg/g

結(jié)腸是人體內(nèi)短鏈脂肪酸的主要產(chǎn)生部位，多是由未消化吸收的碳水化合物經(jīng)結(jié)腸內(nèi)厭氧菌酵解產(chǎn)生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸[5]，約占短鏈脂肪酸總量的90%～95%。丁酸是人類結(jié)腸、盲腸上皮細(xì)胞最重要的能量來源[6]，還被認(rèn)為是抗生素的潛在替代品，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[7-8]，丁酸水平的增減會(huì)影響腸道上皮細(xì)胞的正常功能。本研究結(jié)果表明，飲用滅菌型和活菌型乳酸菌飲料后，樣本糞便中丁酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著性變化，不會(huì)對腸上皮細(xì)胞造成影響。

乙酸可降低腸道內(nèi)的pH值，抑制腐敗菌的生長，減少結(jié)腸癌的發(fā)生[9]；丙酸可抑制膽固醇的合成，提高高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平，降低血糖和胰島素水平[10]。目前的研究表明，超過95%腸道產(chǎn)生的短鏈脂肪酸被宿主吸收，糞便中乙酸、丙酸水平的下降可能是吸收增加或產(chǎn)量下降的結(jié)果。

2.4 腸道菌群多樣性分析

2.4.1 Alpha多樣性分析

在人體腸道微生物菌群中，主要以擬桿菌門、厚壁菌門的細(xì)菌為主[11]。Alpha多樣性用于度量群落生態(tài)單樣本的物種多樣性，是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，如圖1所示。通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)測得的物種數(shù)在滅菌型乳酸菌飲料組-活菌型乳酸菌飲料組、基線組-滅菌型乳酸菌飲料組兩組間具有明顯的差異(P＜0.05)，顯著性P值分別為0.0003和0.0377。測得的物種數(shù)在基線組-活菌型乳酸菌飲料組不具有明顯的差異(P＞0.05)，P值為0.0741。結(jié)果表明，滅菌型乳酸菌飲料可以增加受試人群腸道菌群的豐富度。

圖1 所有樣本不同組別間物種總數(shù)的散點(diǎn)分布

2.4.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性用于不同環(huán)境群落之間物種差異性的比較。圖2顯示的是微生物群落的組間差異，反映不同微生物群落的Unweighted Unifrac Beta多樣性（b）的結(jié)果表明滅菌型乳酸菌飲料與基線、活菌型乳酸菌飲料飲用時(shí)的微生物群落是存在差異的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；如果考慮到菌群豐度[12]的Weighted Unifrac Beta多樣性（a）結(jié)果也顯示滅菌型乳酸菌飲料與基線、活菌型乳酸菌飲料存在著顯著性差異（P＜0.001）。

圖2 多樣性的箱形圖

2.4.3 飲用滅菌型乳酸菌飲料后腸道菌群的變化

如圖3和圖4所示，飲用滅菌型乳酸菌飲料后，在門水平下腸道菌群中厚壁菌占總菌的比例較基線時(shí)降低，而變形桿菌門和放線菌門占總菌的比例增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果也顯示出滅菌型乳酸菌飲料可以抑制厚壁菌和擬桿菌的生長。研究表明，厚壁菌主要幫助宿主從膳食中吸收能量；擬桿菌具有碳水化合物發(fā)酵，參與多糖代謝、膽汁酸和類固醇代謝，維持腸道正常生理等諸多功能。有研究認(rèn)為，肥胖人群厚壁菌門占優(yōu)勢，厚壁菌/擬桿菌門比值較高[13]，而且經(jīng)過飲食方式干預(yù)（使用低脂肪或低碳水化合物，限制能量攝入）后，肥胖者的F/B值會(huì)隨著體重的降低而減小[14]。本研究結(jié)果顯示，飲用滅菌型乳酸菌飲料后參與人體吸收能量的厚壁菌比例減少，以及厚壁菌厚壁菌與擬桿菌比例下降，提示君暢滅菌型乳酸菌飲料對降低體重可能有一定的作用。

圖3 微生物物種（Top 10）在不同水平上的差異

圖4 飲用滅菌型乳酸菌飲料（藍(lán)色）后的微生物物種與基線（橙色）的差異

結(jié)合綱水平的結(jié)果顯示，滅菌型乳酸菌飲料組厚壁菌的豐度降低主要表現(xiàn)在Clostridia梭菌綱和negativicutes菌綱方面。Clostridia梭菌綱在目水平上進(jìn)一步表現(xiàn)出Clostridiates梭菌的豐度降低，在屬水平的Blautia豐度增加和Lachnoclostridium豐度下降，種水平的Ruminococcaceae瘤胃菌科的豐度降低。negativicutes菌綱菌群不同水平的豐度改變表現(xiàn)為目水平的Selenomonadales、科水平的Veillonellaceae、屬水平的Megamonas的豐度的降低。其中，Megamonas和Lachnoclostridium菌屬的作用是發(fā)酵各種碳水化合物，其終產(chǎn)物是乙酸、丙酸和乳酸，飲用滅菌型乳酸菌飲料后Megamonas菌屬豐度的顯著下降，這與飲用滅菌型乳酸菌飲料后糞便中乙酸和丙酸含量顯著低于基線的結(jié)果是一致的。而厚壁菌門梭菌屬中的Blautia，Lachnospira和Roseburia與丁酸的生成密切相關(guān)，飲用滅菌型乳酸菌飲料后糞便中丁酸的含量比基線比較沒有顯著性差異，考慮可能與Blautia豐度增加，而Lachnospira和Roseburia豐度下降的綜合作用有關(guān)。如圖4所示，在種水平上，還顯示出飲用滅菌型乳酸菌飲料后Faecalibacterium prausnitzii普拉梭菌的豐度的增加，普拉梭菌是腸道具有重要保護(hù)作用的益生菌，其減少會(huì)導(dǎo)致腸道抗炎能力和免疫調(diào)節(jié)能力的減弱，也與加強(qiáng)腸上皮屏障有關(guān)，還具有治療腸易激綜合癥腹痛的潛力等有益腸道健康的作用[15]。

除了厚壁菌和擬桿菌之外，飲用滅菌型乳酸菌飲料后，變形菌和放線菌的豐度顯著增加了。其中，放線菌門的大多數(shù)細(xì)菌為有益菌，如雙歧桿菌，可產(chǎn)生抗生素、各種酶、維生素B12和有機(jī)酸等活性物質(zhì)。本研究的結(jié)果也顯示飲用滅菌型乳酸菌飲料后，雙歧桿菌占總菌的比例在目水平、科水平、屬水平和種水平，都比基線時(shí)高，這個(gè)結(jié)果提示君暢具有提高腸道健康的可能性。有關(guān)慢性便秘的人群研究顯示，便秘患者的梭菌屬豐度增加，而且益生元可以通過增加雙歧桿菌數(shù)量和減少梭菌數(shù)量來治療慢性便秘，本研究飲用滅菌型乳酸菌飲料后，雙歧桿菌豐度的增加和梭菌屬豐度的下降也提示滅菌型乳酸菌飲料潤腸通便的效果。

2.4.4 飲用活菌型乳酸菌飲料后腸道菌群的變化

飲用活菌型乳酸菌飲料后，與基線相比，腸道菌群的變化主要體現(xiàn)在擬桿菌門的豐度下降和放線菌豐度的增加上。它們都參與乙酸和丙酸的生成，考慮兩者的共同作用，受試人群糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量與基線沒有出現(xiàn)顯著性差異。值得注意的是，飲用后乳酸桿菌和雙歧桿菌、Coriobacteriale這樣的放線菌的豐度都增加了，而它們與腸道健康密切相關(guān)，這些結(jié)果提示活菌型乳酸菌飲料可能會(huì)對腸道健康發(fā)揮有益作用。

圖5 飲用活菌型乳酸菌飲料（藍(lán)色）后的微生物物種與基線（橙色）的差異

3 結(jié) 論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)飲用滅菌型乳酸菌飲料后可以調(diào)節(jié)腸道菌群的種類、數(shù)量、比例等，并影響腸道微生物穩(wěn)態(tài)；排便習(xí)慣的調(diào)查結(jié)果顯示滅菌型乳酸菌飲料具有一定的增加排便次數(shù)、改善了排便困難程度和排便不完全感的潤腸通便的效果，但是潤腸通便的效果不是因?yàn)楫a(chǎn)生了更多的短鏈脂肪酸引起的，考慮可能是因?yàn)轱嬘脺缇腿樗峋嬃虾笏缶鷮儇S度的下降和雙歧桿菌豐度的增加所致。飲用滅菌型乳酸菌飲料后普拉梭菌的豐度的增加和雙歧桿菌豐度的增加，也提示君暢具有有益腸道健康的可能性。