郭金喜，范田麗，郭武軍，何曉瑞，周玉貴

(1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊奶業(yè)協(xié)會(huì)，烏魯木齊 830011；3.新疆玉昆侖天然食品有限公司,新疆喀什 844400)

0 引 言

硒(selenium，Se)是人體必需的微量元素之一,具有抗氧化、調(diào)控人體血脂代謝、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、預(yù)防心肌病等重要功能,因此被譽(yù)為“生命之火”。研究表明硒的功能活性和作用機(jī)理與攝入硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[1-3]。硒的形主要有無(wú)機(jī)硒（硒酸鹽：Se（Ⅵ）、亞硒酸鹽：Se（Ⅳ））和有機(jī)硒（硒胱氨酸：SeMet、硒代蛋氨酸：SeCys）兩種，硒的不同化學(xué)形態(tài)對(duì)人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同，例如硒酸鹽和亞硒酸鹽等無(wú)機(jī)硒會(huì)導(dǎo)致生物體病變，過(guò)多攝入無(wú)機(jī)硒會(huì)引起硒中毒[4-8]，而Se-腺苷-硒半胱氨酸、Se-甲基-硒半胱氨酸、Se-胱硫醚、γ-谷氨酰胺-Se-甲基-硒半胱氨酸等有機(jī)硒是人類攝取硒元素的主要來(lái)源。新疆驢乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、脂肪亞油酸、?；撬岷臀榷喾N營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，經(jīng)檢測(cè)驢乳粉中硒含量較高，尤其是南疆（岳普湖縣）驢乳粉硒含量最高，根據(jù)查找資料記載南疆驢乳中硒的含量是牛乳的10倍以上[9-14]。目前對(duì)乳粉中硒的形態(tài)分型的報(bào)道很多，但未見(jiàn)對(duì)新疆驢乳粉中硒的形態(tài)分析未見(jiàn)報(bào)道，所以對(duì)新疆驢乳粉中硒的形態(tài)分型，確定驢乳粉中硒的形態(tài)就顯得尤為重要。

硒的形態(tài)分型常用的主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ICP-MS）和高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀（HPLC-HG-AFS）[15]兩種分型定量設(shè)備，HPLC-ICP-MS具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但其儀器原理復(fù)雜，使用成本和操作難度高，而原子熒光光譜儀（HG-AFS）是我國(guó)少數(shù)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中高端分析儀器之一，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分析成本低、靈敏度高、選擇性好和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[16-18]，所以本文采用高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀（HPLC-HG-AFS）對(duì)新疆南疆（岳普湖縣）驢乳粉中硒的形態(tài)和含量進(jìn)行分析研究。因?yàn)閮龈审H乳粉中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態(tài)，運(yùn)用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用作為酶解提取驢乳粉中硒形態(tài)的提取方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及試劑

凍干驢乳粉，購(gòu)買國(guó)產(chǎn)某品牌（南疆岳普湖縣）凍干驢乳粉。

硒單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，100 mg/L（GBW 0866）（1%鹽酸溶液介質(zhì)）；硒代蛋氨酸（SeCys）（GBW 10034），39.4±1.0μg/g（以硒計(jì)）、97.9±2.5μg/g（以硒代蛋氨酸計(jì)）；硒酸根（Se（Ⅵ））（GBW 10033），41.5±1.3μg/g（以硒計(jì)）、75.1±2.4μg/g（以硒酸根計(jì)）；亞硒酸根（Se（Ⅳ））（GBW 10032），42.9±0.9μg/g（以硒計(jì)）、68.9±1.4μg/g（以亞硒酸根計(jì)）；硒代胱氨酸（SeMet）（GBW 10087），44.2±1.0μg/g（以硒計(jì)）、93.5±2.5μg/g（以硒代胱氨酸計(jì)）；均由中國(guó)計(jì)量院提供。流動(dòng)相用5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL四丁基溴化銨（TBAB）+2%CH3OH（調(diào)解pH=4.5），現(xiàn)用現(xiàn)配；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、甲醇（優(yōu)級(jí)純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

HPLC-AFS9800高效液相色譜-雙道原子熒光分光光度計(jì)（配有砷-汞空心陰極燈），北京吉天儀器公司；HamiltonPRPX陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm、10μm），瑞士漢密爾頓；Agilent M P-C18反相色譜柱（150 mm×4.65 mm、10μm)，美國(guó)安捷倫；TOPEX微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；TS-110X 30恒溫水浴振蕩器，上海捷呈；PHS-3C數(shù)字酸度計(jì)，上海楚定分析儀器有限公司；GTSONIC-D 6超聲波清洗儀，廣東固特超聲股份有限公司；BSA124S-CW分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；SIGAMA3-30K臺(tái)式高速型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma。實(shí)驗(yàn)用所有玻璃和聚四氟乙烯器皿均以20%（體積分?jǐn)?shù)）的硝酸浸泡24 h，用去離子水沖洗干凈。

2 方 法

2.1 樣品前處理

2.1.1 總硒提取前處理

由于驢乳粉基體復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)和油脂，比常規(guī)樣品難消化徹底，未確保最大限度的提取驢乳粉中總硒。本方法減少樣品稱樣量，準(zhǔn)確稱取約0.3～0.5 g（精確至0.0001 g）樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸5.0 mL，混合均勻，放置2 h，于通風(fēng)廚電熱爐上220℃進(jìn)行預(yù)消化，待硝酸即將剩余0.5 mL左右取下冷卻后補(bǔ)加5 mL硝酸，然后密封好消化管，放入微波消解器，消解完畢后，放入趕酸器種趕酸至約剩0.5 mL，不可蒸干。冷卻后，用去離子水少量多次洗滌定容至25 mL容量瓶中搖勻過(guò)0.45μm濾膜及C18小柱凈化備用。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)、樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)、空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 硒形態(tài)提取前處理

因?yàn)樾陆辖ㄔ榔蘸h）凍干驢乳粉中蛋白質(zhì)和脂肪含量很高，分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態(tài)，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用讓驢乳粉中蛋白質(zhì)和脂肪酶解成更易硒形態(tài)提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物質(zhì)，提高硒形態(tài)的提取率。

準(zhǔn)確稱取0.3 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品于15 mL離心管中，加入混5 mL合酶系列4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.08 g）、pH=7.5、水浴溫度40℃、水浴時(shí)間為3 h，對(duì)樣品進(jìn)行恒溫水浴振蕩酶解提取，提取結(jié)束于4℃下以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上層清液定容至25 mL容量瓶中搖勻過(guò)0.45μm濾膜及C18小柱凈化備用。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)、樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)、空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

2.2 標(biāo)液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確移取硒單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液1.00 mL，用體積分?jǐn)?shù)0.5%硝酸（以濃硝酸為基準(zhǔn)）稀釋并定容至100.0 mL容量瓶，配制成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超純水溶解分別定容至100 mL容量瓶中，制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液冷藏保存，用時(shí)逐步稀釋。

Se標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：臨用前將Se標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液從冷藏柜種取出，恢復(fù)到室溫。將恢復(fù)到室溫的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各點(diǎn)濃度依次為0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配置：臨用前將SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液從冷藏柜種取出，恢復(fù)到室溫。將恢復(fù)到室溫的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各點(diǎn)濃度依次為0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 流動(dòng)相的選擇

通過(guò)前期試驗(yàn)和查閱資料發(fā)現(xiàn)通過(guò)運(yùn)用磷酸氫二銨溶液或者檸檬酸作為流動(dòng)相時(shí)都不能對(duì)驢乳粉中硒的形態(tài)進(jìn)行有效分離，磷酸氫二銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)不能實(shí)現(xiàn)Se（Ⅳ）和SeMet的基線分離，分離效果不好，而采用檸檬酸作為流動(dòng)相時(shí)SeCys和SeMet檢測(cè)靈敏度會(huì)有所下降。本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸作為流動(dòng)相的同時(shí)添加一定量的四丁基溴化銨（TBAB），可以有效實(shí)現(xiàn)SeCys和SeMet的分離和提高檢測(cè)靈敏度[19]。本次實(shí)驗(yàn)采用5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作為流動(dòng)相（pH=4.5）。

2.4 儀器設(shè)備參數(shù)

測(cè)定總硒的樣品經(jīng)過(guò)微波消解、趕酸、定容后過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。形態(tài)分型樣品經(jīng)過(guò)酶提取、離心、定容后過(guò)0.45μm濾膜然后上機(jī)測(cè)定。設(shè)備參數(shù)見(jiàn)表1,硒形態(tài)液相譜圖見(jiàn)圖1。

表1 設(shè)備參數(shù)條件

圖1 4種硒形態(tài)色圖譜

2.5 檢出限及精密度測(cè)定

先對(duì)空白樣品連續(xù)進(jìn)行21次測(cè)定，求出測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)樣品中4種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)系列重復(fù)測(cè)定3次，取算術(shù)平均值后，按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。以3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，得到檢出限[20]。連續(xù)11次重復(fù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度為60μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算RSD值[21]。同事測(cè)定空白加標(biāo)回收率和樣品加標(biāo)回收率，對(duì)樣品4種形態(tài)硒進(jìn)行分型和含量測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 硒的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.3～0.5 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品采用微波消解，消解好樣品經(jīng)冷卻定容至15 mL離心管中，過(guò)定容后過(guò)0.45μm濾膜然后上機(jī)測(cè)定。采用GB5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》中第一法（氫化物原子熒光光譜法）對(duì)硒含量進(jìn)行測(cè)定。

3.2 酶解提取硒形態(tài)參數(shù)的確定

準(zhǔn)確稱取0.3 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品于15 mL離心管中，加標(biāo)后加入10 mL混合酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.08 g）、調(diào)解pH值、水浴溫度40℃、水浴時(shí)間，對(duì)樣品進(jìn)行恒溫水域振蕩酶解提取，提取結(jié)束于4℃下以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上層清液定容至25 mL容量瓶中搖勻過(guò)0.45μm濾膜及C18小柱凈化后上機(jī)測(cè)定。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)、樣品加標(biāo)、空白加標(biāo)上機(jī)測(cè)定。確定酶解提取溫度、酶添加量、時(shí)間、pH值4個(gè)因素提取樣品中4種形態(tài)硒的最佳參數(shù)條件。

3.2.1 酶解提取溫度的確定

以提取時(shí)間為2 h、提取酸pH值為7、提取用蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.04 g為提取條件，確定提取溫度分別為30、35、40、45、50時(shí)，提取凍干驢乳粉4種硒形態(tài)的最佳溫度條件。溫度對(duì)提取效果的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)4種硒形態(tài)提取的影響

由圖2可以看出在提取溫度為40℃時(shí)提取效果最好，這表明40℃時(shí)酶的活性最好，達(dá)到最佳提取效果，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶活性，所以本實(shí)驗(yàn)采用40℃，作為本次實(shí)驗(yàn)的酶解提取溫度。

3.2.2 酶解提取酶濃度的確定

以提取時(shí)間為2 h、提取酸pH值為7、提取溫度為40℃，為提取條件，確定提取酶添加量分別為STD1（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.02 g）STD2（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.04 g）、STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、STD4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.08 g）、STD 5（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.1 g）時(shí)提取凍干驢乳粉4種硒形態(tài)的最佳酶濃度條件。

由圖3可以看出，在酶添加量為STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）時(shí)4種形態(tài)硒達(dá)到最大值，趨于穩(wěn)定，說(shuō)明STD3時(shí)酶添加量最為合適，酶解達(dá)到飽和狀態(tài)，在多就會(huì)出現(xiàn)過(guò)飽和，造成酶的浪費(fèi)，過(guò)少提取效果不好。所以本次實(shí)驗(yàn)選取酶添加量為STD3作為本次實(shí)驗(yàn)酶添加量。

圖3 酶添加量對(duì)4種硒形態(tài)提取的影響

3.2.3 酶解提取時(shí)間的確定

以提取pH值為7、溫度為40℃、酶添加量為STD3，為提取條件，確定提取時(shí)間分別為2、2.5、3、3.5、4 h時(shí)提取凍干驢乳粉4種硒形態(tài)的最佳時(shí)間條件。

由圖4可以看出，提取時(shí)間在3 h的4種形態(tài)硒的提取達(dá)到最大值，過(guò)后趨于穩(wěn)定，說(shuō)明時(shí)間3 h時(shí)已經(jīng)最大限度提取樣品中4中硒形態(tài)，無(wú)需增加提取時(shí)間來(lái)增大提取率，所以本次實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間選取3 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)4種硒形態(tài)提取的影響

3.2.4 酶解提取pH的確定

以提取溫度為40℃、酶添加量為STD3，時(shí)間為3 h，為提取條件，確定提取pH值分別為6.5、7、7.5、8、8.5時(shí)提取凍干驢乳粉4種硒形態(tài)的最佳pH值條件。

由圖5可以看出，在提取pH為7.5時(shí)候達(dá)到最大值，pH過(guò)高或者過(guò)低時(shí)酶解提取率都會(huì)下降，主要原因是選取的酶為弱堿性酶，在酶解pH為7.5的時(shí)候效果達(dá)到最好，所以每次實(shí)驗(yàn)選取酶解提取pH為7.5。

圖5 提取pH對(duì)4種硒形態(tài)提取的影響

本次實(shí)驗(yàn)選取酶解提取溫度為40℃、時(shí)間3 h、酶添加量STD3、pH為7作為本次實(shí)驗(yàn)的最佳提取條件。

3.3 硒檢測(cè)結(jié)果

考察硒形態(tài)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0～100μg/L范圍內(nèi)其線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)建立4種形態(tài)硒標(biāo)準(zhǔn)系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)，對(duì)空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，計(jì)算準(zhǔn)偏差、檢出限、RSD值、加標(biāo)回收率，對(duì)樣品4種形態(tài)硒進(jìn)行分型和含量測(cè)定。

3.3.1 硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeM et標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超純水分別定容至100 mL容量瓶中，制成1 000μg/kg標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏保存。臨用前將4種SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液從冷藏柜種取出，恢復(fù)到室溫。將恢復(fù)到室溫的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐步稀釋，配置成各點(diǎn)濃度依次為0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。詳見(jiàn)圖6～7。

圖6 4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)系列液相圖譜

圖7 4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)系列曲線

3.3.2 線性范圍及檢出限

建立4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)空白樣品連續(xù)進(jìn)行21次測(cè)定，求出測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。以3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，得到檢出限。連續(xù)11次重復(fù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度為60μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算RSD值。同時(shí)測(cè)定空白加標(biāo)回收率和樣品加標(biāo)回收率，對(duì)樣品4種形態(tài)硒進(jìn)行分型和含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，HPLC-HG-AFS測(cè)定新疆南疆（岳普湖）凍干驢乳粉中4種硒形態(tài)r2在0.9993～0.9998之間、檢出限為0.3μg/kg、定量限為1μg/kg之間、RSD在0.98%～1.03%之間，結(jié)果表明本研究方法檢出限、定量限低、精密度，結(jié)果穩(wěn)定，完全滿足檢驗(yàn)要求。

表2 4種硒形態(tài)測(cè)定的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、RSD

3.3.3 樣品加標(biāo)測(cè)定結(jié)果

按酶解提取的前處理最佳酶解提取溫度為40℃、時(shí)間3 h、酶添加量STD3、pH為7作對(duì)處理加標(biāo)實(shí)驗(yàn)樣品。對(duì)3組樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，用時(shí)做空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出3種硒形態(tài)Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）樣品加標(biāo)回收率在88.1%～95.2%之間，而SeCys的樣品加標(biāo)回收為30.5%～39.4%，不超過(guò)40%，但是空白加標(biāo)四種硒形態(tài)回收率在99.5%～101.7%之間結(jié)果很好。這是由于該方法提取驢乳粉中SeCys的時(shí)候，由于（SeCys）2中的Se-Se化學(xué)鍵不穩(wěn)定，容易斷開且易與乳粉中的蛋白質(zhì)吸附沉淀。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態(tài)樣品加標(biāo)回收率在88.1%～95.2%之間，表明這3種形態(tài)硒的分型檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用測(cè)定凍干驢乳粉中總硒含量，然后減去測(cè)定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態(tài)含量得到SeCys的形態(tài)含量。

表3 樣品加標(biāo)回收結(jié)果

3.3.4 硒形態(tài)含量測(cè)定結(jié)果

通過(guò)測(cè)定樣品中總硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）含量，用總硒含量減去Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態(tài)含量計(jì)算出SeCys含量，有機(jī)硒含量，詳見(jiàn)表4。

由表4可以看出SeMet含量在10.43～12.79μg/kg之間，占總硒含量的55.1%～77.9%，SeCys含量4.06 μg/kg～7.76μg/kg，占總硒含量的22.1%～39.4%，有機(jī)硒（SeM et和SeCys總量）含量在16.68～18.60μg/kg，占總硒含量的94.4%～100.0%。除2#、6#、9#樣品分別含有1.08μg/kg、1.00μg/kg、1.03μg/kg的Se（Ⅵ），其它7個(gè)樣品均未檢出無(wú)機(jī)硒。結(jié)果顯示新疆南疆凍干驢乳粉中有機(jī)硒含量在16.68～18.60μg/kg之間占總硒在94.4%～100.0%，含有少量或不含有無(wú)機(jī)硒。

表4 樣品分析結(jié)果

4 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)通液相色譜-原子熒光光譜（HPLC-HGAFS）聯(lián)用儀檢測(cè)新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態(tài)含量，流動(dòng)相對(duì)于分離硒形態(tài)有著很大的影響，通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)和查閱資料發(fā)現(xiàn)通過(guò)運(yùn)用磷酸氫二銨溶液或者檸檬酸作為流動(dòng)相時(shí)都不能對(duì)驢乳粉中硒的形態(tài)進(jìn)行有效分離，磷酸氫二銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)不能實(shí)現(xiàn)Se（Ⅳ）和SeMet的基線分離，分離效果不好，而采用檸檬酸作為流動(dòng)相時(shí)SeCys和SeMet檢測(cè)靈敏度會(huì)有所下降。本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸作為流動(dòng)相的同時(shí)添加一定量的四丁基溴化銨（TBAB），可以有效實(shí)現(xiàn)SeCys和SeMet的分離和提高檢測(cè)靈敏度。流動(dòng)相為5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作為流動(dòng)相（pH=4.5）。

因?yàn)樾陆辖ㄔ榔蘸h）凍干驢乳粉中蛋白質(zhì)和脂肪含量很高，分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態(tài)，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用讓驢乳粉中蛋白質(zhì)和脂肪酶解成更易硒形態(tài)提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物質(zhì)，提高硒形態(tài)的提取率。但是酶法提取對(duì)酶的添加量、溫度、pH、時(shí)間等提取條件要求很嚴(yán)格，所以本方法探討優(yōu)化了酶法提取驢乳粉中硒形態(tài)的參數(shù)條件，研究得出結(jié)論酶法提取最佳參數(shù)條件為溫度40℃、時(shí)間3 h、酶添加量STD 3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、pH為7。

凍干驢乳粉中3種硒形態(tài)Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）樣品加標(biāo)回收率在88.1%～95.2%之間，而SeCys的樣品加標(biāo)回收為30.5%～39.4%，不超過(guò)40%，但是空白加標(biāo)4種硒形態(tài)回收率在99.5%～101.7%之間結(jié)果很好。這是由于該方法提取驢乳粉中SeCys的時(shí)候，由于（SeCys）2中的Se-Se化學(xué)鍵不穩(wěn)定，容易斷開且易與乳粉中的蛋白質(zhì)吸附沉淀，致使加標(biāo)回收率下降。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態(tài)樣品加標(biāo)回收率在88.1%～95.2%之間，表明這3種形態(tài)硒的分型檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用測(cè)定凍干驢乳粉中總硒含量，然后減去測(cè)定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態(tài)含量得到SeCys的形態(tài)含量，很好的計(jì)算了新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中總硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）、SeCys含量和占比。

新疆驢乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、脂肪亞油酸、?；撬岷臀榷喾N營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，經(jīng)檢測(cè)驢乳粉中硒含量較高，尤其是新疆南疆（岳普湖縣）驢乳粉硒含量最高。研究表明硒的功能活性和作用機(jī)理與攝入硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。硒的形主要有無(wú)機(jī)硒有機(jī)硒，硒的不同化學(xué)形態(tài)對(duì)人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同，無(wú)機(jī)硒會(huì)導(dǎo)致生物體病變，而有機(jī)硒是人類攝取硒元素的主要來(lái)源，所以過(guò)多攝入無(wú)機(jī)硒會(huì)引起硒中毒。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC-HG-AFS法測(cè)定新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態(tài)，結(jié)果顯示新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態(tài)中有機(jī)硒含量在在16.68～18.60μg/kg之間，占總硒含量的94.4%～100.0%，含有很少或者不含無(wú)機(jī)硒。研究表明新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒含量豐富且都是人體有益的有機(jī)硒。