朱倩男， 王玨， 陳銳， 查小明， 史躍年， 王水

上肢淋巴水腫是乳腺癌腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)(axillary lymph node dissection ，ALND)后最常見的并發(fā)癥之一。目前，前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node，SLN)活檢術(shù)廣泛用于臨床腋窩淋巴結(jié)陰性的患者，盡可能避免不必要的ALND。然而，對(duì)于SLN有轉(zhuǎn)移或者探查SLN失敗的患者依舊需要進(jìn)行ALND。少數(shù)行SLN活檢的患者也出現(xiàn)術(shù)后上肢水腫[1-4]。

Kimberg[5]于2007年提出逆行腋窩淋巴示蹤(axillary reverse mapping，ARM)的概念，通過顯影劑逆向顯影腋窩淋巴管網(wǎng)，以利于在行ALND和(或)前哨淋巴結(jié)活檢(sentinel lymph node biopsy,SLNB)時(shí)保護(hù)患者上肢至腋窩的淋巴通道，進(jìn)而降低上肢水腫的發(fā)生率，提高患者的生活質(zhì)量[6-13]。ARM的可行性基于以下假設(shè)：乳腺和上肢的淋巴回流通路在結(jié)構(gòu)和功能上有相對(duì)獨(dú)立性，兩者之間僅有極少的交通支，乳腺原發(fā)惡性腫瘤不會(huì)累及上肢來源的淋巴系統(tǒng)[14-16]。然而，ARM有一定局限性，有研究者發(fā)現(xiàn)在少數(shù)情況下SLN同時(shí)接收上肢淋巴液[2-19]。Casabona等[7]的研究結(jié)果顯示，在37.5%(27/72)的患者中上肢匯至腋窩的淋巴管道與乳腺匯至腋窩的淋巴管的獨(dú)立性不明顯，SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)有重疊。因此，有不少研究針對(duì)SLNB時(shí)ARM的可行性、ARM示蹤的淋巴結(jié)檢出率及分布情況、ARM示蹤的淋巴管分布情況、ARM示蹤的淋巴結(jié)腫瘤侵襲情況、SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)的關(guān)系等進(jìn)行了探討。亞洲的ARM臨床研究較少，且大多直接在患者身上借鑒西方經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行研究。我們希望通過動(dòng)物研究來驗(yàn)證ARM操作的可行性，探索適合ARM實(shí)行的最佳染料、最佳注射點(diǎn)，同時(shí)尋找ARM示蹤的淋巴結(jié)和淋巴管的分布規(guī)律，進(jìn)而指導(dǎo)ARM在臨床中的應(yīng)用。結(jié)合發(fā)展中國家核素法施行的困難以及熒光法需要專用設(shè)備提高操作成本等，我們選擇價(jià)格低廉、操作簡單的染料染色法(亞甲藍(lán)和納米炭混懸注射液)行ARM的研究。

1 研究材料

1.1 研究對(duì)象 健康雌性新西蘭大白兔54只，體重(1 800±300)g，非懷孕、非哺乳期，購自金陵種兔場(chǎng)，均單籠飼養(yǎng)，兔舍安靜，恒溫24 ℃，空氣濕度60%～70%，將全價(jià)飼料、飲水全部備入飼槽中，任兔自由采食。

1.2 研究染料 1%亞甲藍(lán)注射液(美藍(lán))，購自江蘇濟(jì)川制藥有限公司；納米炭混懸注射液(卡納琳)，0.5 ml：25 mg，購自重慶萊美藥業(yè)股份有限公司。

1.3 研究器材 動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，3%戊巴比妥鈉20 ml及1 ml注射器，紗布、棉球、繃帶，血管鉗、眼科剪、眼科鑷、刀柄、刀片，計(jì)時(shí)器。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

所有大白兔均用3%的戊巴比妥鈉麻醉，置于手術(shù)臺(tái)上。手術(shù)前刮除兔子雙側(cè)上肢兔毛，充分暴露皮膚。將兔子按照體重從輕到重編號(hào)后，通過安全隨機(jī)數(shù)隨機(jī)選取每次研究的大白兔。

2.1 淋巴管網(wǎng)的獨(dú)立性 隨機(jī)選擇9只大白兔，在其右側(cè)最上方乳腺注入0.5 ml亞甲藍(lán)行SLN活檢，右側(cè)上肢皮下注射0.5 ml卡納琳行ARM。同時(shí)在這批兔子的左側(cè)最上方乳腺注入0.5 ml卡納琳行SLN活檢，左側(cè)上肢皮下注射0.5 ml亞甲藍(lán)行ARM。5 min后解剖腋窩，評(píng)估上肢淋巴管網(wǎng)與腋窩淋巴管網(wǎng)的相對(duì)獨(dú)立性。

2.2 上肢淋巴管的匯集特點(diǎn) 隨機(jī)選擇3只大白兔，以環(huán)形網(wǎng)狀樣(縱向每隔1 cm、橫向每隔1 cm)于雙側(cè)趾蹼間、掌間、上肢的皮下、肌肉中注入亞甲藍(lán)，每側(cè)共注入亞甲藍(lán)2 ml，每個(gè)注射點(diǎn)均勻注射染料，解剖腋窩，觀察上肢染色的淋巴匯集至腋窩的情況。

2.3 注射染料、部位的選擇 隨機(jī)選擇9只大白兔并隨機(jī)分為3個(gè)亞組，每亞組3只，全麻后用亞甲藍(lán)染色右側(cè)上肢淋巴管，卡納琳染色左側(cè)上肢淋巴管，每亞組中每只大白兔雙側(cè)上肢染料計(jì)量相同，3只大白兔染料計(jì)量分別為2 ml、1 ml、0.5 ml。第一組注射部位選擇兔趾蹼間的皮下處，第二組選擇肘部屈側(cè)皮下處，第三組選擇上肢近腋窩內(nèi)側(cè)皮下與肌間溝處。等待5 min后解剖腋窩，觀察匯入腋窩的引流上肢淋巴液的淋巴結(jié)與淋巴管的顯色情況，選擇最佳注射部位并選定后續(xù)實(shí)驗(yàn)染料注射劑量。

2.4 ARM示蹤淋巴結(jié)與淋巴管的分布 根據(jù)上述三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步研究ARM下上肢淋巴液引流至腋窩淋巴結(jié)與淋巴管的分布情況：在33只雌性新西蘭大白兔雙側(cè)上肢近心1/3處內(nèi)側(cè)肌間溝的皮下、肌間溝及肌內(nèi)注射亞甲藍(lán)，充分按摩5 min后解剖腋窩，詳細(xì)記錄淋巴管、淋巴結(jié)顯色及分布情況。

本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)和南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的倫理批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：1601179。

3 結(jié)果

從上肢淋巴管網(wǎng)獨(dú)立性的研究可見大白兔雙側(cè)腋窩區(qū)藍(lán)染的淋巴管網(wǎng)與黑染的淋巴管網(wǎng)是相對(duì)獨(dú)立的。17側(cè)上肢ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN不是同一淋巴結(jié)(圖1A)。僅有一側(cè)發(fā)現(xiàn)了1枚(1/18)雙染的淋巴結(jié)，這枚淋巴結(jié)就是交匯的ARM示蹤淋巴結(jié)和SLN(圖1B)。

上肢淋巴管匯集的研究結(jié)果顯示上肢淋巴管道流入腋窩時(shí)分為淺層淋巴通路和深層淋巴通路，深層淋巴通路在腋窩區(qū)匯聚成數(shù)根較粗的淋巴干(圖1C)，亞甲藍(lán)對(duì)于淋巴管的顯色更為清晰。

注射染料、部位選擇研究的結(jié)果提示亞甲藍(lán)與卡納琳對(duì)淋巴結(jié)的染色效果相近，均可清晰呈現(xiàn)淋巴結(jié)，但亞甲藍(lán)對(duì)于淋巴管的顯象更為清晰，更適合用于ARM技術(shù)的施行。最佳的染料注射部位為上肢的肌間溝處(圖2)。

在研究ARM示蹤的淋巴結(jié)與淋巴管分布的33只大白兔中，有兩只大白兔因麻醉死亡，9只大白兔僅一側(cè)上肢ARM操作成功。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共45側(cè)上肢的腋窩區(qū)探查到藍(lán)染淋巴結(jié)，47側(cè)上肢腋窩區(qū)探查到藍(lán)染淋巴管，其中有37例同時(shí)探查到藍(lán)染的淋巴結(jié)與淋巴管。為了便于統(tǒng)計(jì)觀察，我們將腋窩通過下述方法劃分為五個(gè)區(qū)域[11]：以前鋸肌、腋靜脈、第二肋間臂神經(jīng)、背闊肌前緣及胸背神經(jīng)血管束為標(biāo)志物，區(qū)域A以腋靜脈和第二肋間臂神經(jīng)為上下界，胸背神經(jīng)與背闊肌前緣為前后界；區(qū)域B毗鄰A區(qū)域，在A區(qū)前方，以腋靜脈和第二肋間臂神經(jīng)為上下界，前鋸肌后緣與胸背神經(jīng)為前后界；區(qū)域C在B區(qū)下方，由第二肋間臂神經(jīng)、前鋸肌后緣和胸背神經(jīng)分隔而成；區(qū)域A的下方、區(qū)域C的后方即為區(qū)域D；腋靜脈上方的空間定位區(qū)域E(圖3A)。在我們的研究中，藍(lán)染淋巴結(jié)常位于某一個(gè)區(qū)域，只有1只大白兔的一側(cè)在A、B區(qū)均發(fā)現(xiàn)1枚藍(lán)染淋巴結(jié)。藍(lán)染淋巴結(jié)多數(shù)分布在腋靜脈與第二肋間臂神經(jīng)之間，也就是A、B區(qū)域，A區(qū)域檢出率為58.7%(27/46)，B區(qū)域檢出率為32.6%(15/46)，C區(qū)域檢出率為8.7%(4/46)，D、E區(qū)域未檢出藍(lán)染淋巴結(jié)。藍(lán)染淋巴管多伴行于腋靜脈。我們?nèi)鐖D3B所示，將其走行分成4種路線：路線1伴行于腋靜脈上方；路線2伴行于腋靜脈下方，但在第二肋間壁神經(jīng)上方；路線3從CD區(qū)域縱行向AB區(qū)域方向；路線4是較為細(xì)小的數(shù)條淋巴管走行于腋窩區(qū)域。只有一側(cè)上肢出現(xiàn)了同時(shí)伴行于腋靜脈上下的淋巴管分支，以及同時(shí)有路線1與2的走行，其他多數(shù)為單種走行路線，具體分布情況為：路線1占10.4%(5/48)，路線2占77.1%(37/48)，路線3占10.4%(5/48)、路線4占2.1%(1/48)。

1A：卡納琳黑染了1枚前哨淋巴結(jié)(箭頭1)，亞甲藍(lán)行ARM示蹤藍(lán)染了1枚淋巴結(jié)(箭頭2)，ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN不是同一個(gè)淋巴結(jié)；1B：有ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN重疊(箭頭3)；1C：通過亞甲藍(lán)行ARM發(fā)現(xiàn)，上肢淋巴管網(wǎng)分為深淺兩層，在匯入腋窩淋巴結(jié)之前會(huì)先匯聚成數(shù)根較粗的淋巴干(箭頭4)圖1 大白兔上肢與乳腺匯入腋窩的淋巴管網(wǎng)的情況

2A：沿著上臂內(nèi)側(cè)肌間溝皮下注射亞甲藍(lán)可以同時(shí)清晰的顯影淋巴管(箭頭1)和淋巴結(jié)(箭頭2)；2B：卡納琳可以清晰顯示淋巴結(jié)(箭頭3)，但是示蹤淋巴管效果較差圖2 分別用亞甲藍(lán)與卡納琳行ARM的示蹤情況

3A：ARM淋巴結(jié)多數(shù)位于腋靜脈和第二肋間壁神經(jīng)之間(A、B區(qū)域)。ARM淋巴結(jié)多數(shù)位于一個(gè)區(qū)域中，少數(shù)可同時(shí)存在于A、B區(qū)域；3B：ARM淋巴管多沿腋靜脈走行，多數(shù)為路線1的情況圖3 ARM淋巴結(jié)和淋巴管在腋窩的分布情況

4 討論

目前不少研究結(jié)果認(rèn)為多數(shù)情況下乳腺的淋巴引流與上肢的淋巴引流在腋窩區(qū)鮮有匯聚，SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)不重疊，偶爾兩者會(huì)出現(xiàn)交匯[1-3,6-13]。本研究中，藍(lán)染的淋巴網(wǎng)與黑染的淋巴網(wǎng)相對(duì)獨(dú)立，也證實(shí)了SLN與ARM示蹤的淋巴結(jié)的相對(duì)獨(dú)立性。在多數(shù)研究中，為了藍(lán)染上肢淋巴管網(wǎng)，前哨淋巴結(jié)的活檢僅用核素法進(jìn)行操作，部分術(shù)者認(rèn)為單一示蹤劑會(huì)降低SLN檢出率，堅(jiān)持染料結(jié)合核素法行SLN活檢，拒絕ARM技術(shù)[11]。我們將亞甲藍(lán)用于ARM技術(shù)、卡納琳結(jié)合核素法用于SLN活檢，可以保證SLN檢出率的同時(shí)進(jìn)行ARM技術(shù)。

盡管ARM示蹤的淋巴結(jié)不等同于SLN淋巴結(jié)，但是少數(shù)案例中兩者是可以重疊的，側(cè)面解釋了為什么有的患者僅進(jìn)行了SLN活檢也會(huì)出現(xiàn)上肢淋巴結(jié)水腫。一般ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN兩者的交匯率波動(dòng)于0～21%(3/14)[1-3,5-21]。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)兩者有為同一枚淋巴結(jié)的可能，交匯率為5.56%(1/18)，與臨床結(jié)果相似。當(dāng)然，這些研究的樣本量較小，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后深入研究，進(jìn)一步分析臨床數(shù)據(jù),評(píng)估交匯可能。

值得一提的是上肢淺層與深層的淋巴液在匯入腋窩的過程中會(huì)由細(xì)小的分支匯成數(shù)根主干。通過解剖證實(shí)保護(hù)這些淋巴干管道可以維持上肢淋巴管網(wǎng)的完整性。ARM技術(shù)可以顯示這些淋巴干并有助于術(shù)者在術(shù)中可視的情況下對(duì)這些淋巴干進(jìn)行保護(hù)，減少因淋巴干切斷后引起上肢淋巴水腫。

我們研究中的一部分是通過對(duì)不同注射點(diǎn)注射同等計(jì)量的染料來進(jìn)行ARM操作，對(duì)比發(fā)現(xiàn)上肢近心端的肌間溝內(nèi)側(cè)為最佳注射點(diǎn)。和其他注射點(diǎn)如指蹼間、肱二頭肌、肱三頭肌相比，肌間溝內(nèi)側(cè)注射點(diǎn)不僅可以有效地進(jìn)行ARM操作，同時(shí)可以最大限度降低染色導(dǎo)致的不美觀。用亞甲藍(lán)進(jìn)行ARM技術(shù)簡易且價(jià)格適中，其染色速度快，染色效果鮮明，對(duì)匯入腋窩淋巴系統(tǒng)中的上肢淋巴管顯色清晰，淋巴結(jié)及淋巴管染色效果均較理想；卡納琳對(duì)淋巴結(jié)染色效果明顯，但難以清晰顯示淋巴管，不利于術(shù)中保護(hù)上肢淋巴管道，而上肢匯總?cè)胍父C的淋巴管往往是維持上肢淋巴循環(huán)的關(guān)鍵，因此卡納琳難以用于ARM技術(shù)[14]。但在行ARM時(shí)，卡納琳可結(jié)合核素和(或)熒光染料進(jìn)行SLN活檢，且檢出率較為穩(wěn)定。上肢淋巴引流可分淺深兩層，深層淋巴管至腋窩一般匯集成數(shù)根淋巴管，主淋巴管有1～3根，匯入相近位置的淋巴結(jié)，ALND主要損傷上肢深部淋巴引流的主管道，術(shù)中如果保留1～2根藍(lán)染淋巴管并保留部分藍(lán)染淋巴結(jié)，一定程度上維持了上肢淋巴循環(huán)的完整性，減少了對(duì)上肢淋巴循環(huán)的破壞，進(jìn)而減少術(shù)后水腫的發(fā)生。絕大多數(shù)情況下，上肢引流至腋窩的淋巴管沿腋靜脈下方走行，其匯入的ARM示蹤的淋巴結(jié)多數(shù)位于腋靜脈下方、第二肋間臂神經(jīng)上方、近上肢處。此次研究中并未發(fā)現(xiàn)D區(qū)、E區(qū)有藍(lán)染淋巴結(jié)，但并不能排除D區(qū)、E區(qū)出現(xiàn)藍(lán)染淋巴結(jié)的可能，腋窩5個(gè)區(qū)域均有可能找到ARM示蹤的淋巴結(jié)，但是A區(qū)域探及到ARM示蹤淋巴結(jié)的幾率最大，手術(shù)操作時(shí)需格外注意。SLN多數(shù)位于腋窩淋巴結(jié)中央?yún)^(qū)，少數(shù)情況下ARM示蹤淋巴結(jié)也可在此區(qū)域，需盡量精細(xì)化操作，避免活檢SLN時(shí)切除范圍過大而連帶切除了ARM示蹤的淋巴結(jié)。

本研究也存在一些局限性。首先，結(jié)合發(fā)展中國家經(jīng)濟(jì)、政策特點(diǎn)，亞甲藍(lán)用于ARM是可行的，但是ARM研究的人群樣本量極其有限且單一染色法行ARM的成功率并不理想。其次，ARM示蹤的淋巴結(jié)被腫瘤累及的風(fēng)險(xiǎn)缺乏大樣本數(shù)據(jù)，保留ARM示蹤的淋巴結(jié)和淋巴管的最關(guān)鍵問題是其腫瘤安全性和保留適應(yīng)證，這也直接影響ARM是否可應(yīng)用于實(shí)際。一些臨床研究已證實(shí)ARM示蹤的淋巴結(jié)有腫瘤侵襲的可能[11-12, 17-20]。第三，對(duì)于ARM示蹤的淋巴結(jié)有腫瘤轉(zhuǎn)移或ARM示蹤淋巴結(jié)與SLN淋巴結(jié)為同一淋巴結(jié)的情況下，術(shù)者難以接受保留ARM示蹤的淋巴管道和淋巴結(jié)，因此患者不能從ARM技術(shù)中獲益。保留ARM示蹤的淋巴管道和淋巴結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)尚不明確。ARM可施行的前提是基于上肢淋巴通路不會(huì)受原發(fā)乳腺癌侵襲這一假設(shè)，所以我們需要擴(kuò)大研究樣本量并結(jié)合腫瘤模型去評(píng)估ARM示蹤淋巴結(jié)受腫瘤侵襲的風(fēng)險(xiǎn)性。最后，目前沒有關(guān)于ARM術(shù)后的長期隨訪，ARM技術(shù)運(yùn)用的價(jià)值尚未得以肯定。

綜上所述，ARM技術(shù)是可行的，但是進(jìn)行ALND或者SLN活檢時(shí)ARM示蹤的淋巴結(jié)與SLN淋巴結(jié)重疊的患者難以從ARM中獲益。上肢的淋巴管道匯聚成幾條較粗的淋巴管進(jìn)入腋靜脈，在進(jìn)行卡納琳聯(lián)合核素或熒光染料進(jìn)行SLN活檢術(shù)時(shí)，可通過在上臂內(nèi)側(cè)肌間溝的皮下注射亞甲藍(lán)染料進(jìn)行ARM，操作保護(hù)上肢淋巴引流通路。在動(dòng)物研究中，ARM示蹤的淋巴結(jié)與淋巴管的分布情況與臨床結(jié)果相近，同時(shí)也存在ARM示蹤淋巴結(jié)與SLN的交匯。ARM示蹤淋巴結(jié)與淋巴管的保留條件和保留后能否改善上肢淋巴水腫的發(fā)生有待進(jìn)一步研究。