劉 野，王紅艷，劉金麗，秦福霞，劉志鵬，韓昊丞，郭素芬

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室；2.牡丹江市第二人民醫(yī)院病理科;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物制劑專業(yè)2017級1班，黑龍江 牡丹江 157011；4.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部2019級臨床醫(yī)學(xué)6班，黑龍江 佳木斯 154007)

Hippo信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條高度保守的抑制細(xì)胞生長的信號通路，主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化來控制器官大小[1-2]。YAP1主要作用于Hippo信號通路下游，可與多種蛋白相互調(diào)節(jié)，參與機(jī)體內(nèi)多條信號通路的調(diào)控，從而行使多種生物學(xué)功能，包括促進(jìn)惡性表型、腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)增和腫瘤細(xì)胞的耐藥性[3]。Notch信號異常激活與腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)[4]，參與腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤干細(xì)胞、促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)、化療耐藥及腫瘤血管增殖[5]。JAG1作為Notch信號的配體之一，在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用[6]。TNBC是一種缺乏雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER2)表達(dá)的浸潤性乳腺癌，約占所有乳腺癌病例的10%～20%[7]。由于其與其他亞型乳腺癌相比惡性程度高、侵襲性強(qiáng)且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，且對激素及化療反應(yīng)不敏感，尋找TNBC發(fā)生中的致癌因素及影響其發(fā)展的分子對判斷其預(yù)后及靶向藥物開發(fā)具有重要意義。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測YAP1、JAG1蛋白在TNBC組織中的表達(dá)，探討YAP1、JAG1蛋白與TNBC患者的臨床病理特征的關(guān)系，從而去發(fā)現(xiàn)促進(jìn)TNBC發(fā)生發(fā)展的致癌因素，并幫助判斷預(yù)后及開發(fā)靶向治療藥物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料所選標(biāo)本均為2016年1月至2020年12月間牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心、牡丹江市第二人民醫(yī)院和牡丹江市腫瘤醫(yī)院病理科石蠟組織標(biāo)本。收集TNBC標(biāo)本30例為實(shí)驗(yàn)組(II級13例，III級17例)，取10例距腫物距離>5 cm以上組織做對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所選病例患者均為女性，術(shù)前均未進(jìn)行任何放化療及內(nèi)分泌治療等，術(shù)后經(jīng)過病理學(xué)證實(shí)確診為乳腺浸潤性癌，經(jīng)IHC檢測結(jié)果為ER(-)，PR(-)，HER2(-/+)，且腫物最小徑均大于0.5 cm，并有完整詳細(xì)的臨床資料。所有使用標(biāo)本均符合倫理委員會要求并簽署知情同意書。

1.2 方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，采用IHC進(jìn)行檢測。YAP1抗體購自于Proteintech公司，JAG1抗體購自于武漢云克隆科技股份有限公司，一抗?jié)舛染鶠?:100，二抗試劑盒(包含DAB顯色液)購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。選用微波法修復(fù)，修復(fù)液為檸檬酸鈉(pH 6.0)。一抗4 ℃孵育過夜。

1.3 結(jié)果判讀YAP1雖然在正常乳腺肌上皮細(xì)胞核陽性表達(dá),但在腺上皮細(xì)胞不表達(dá)(判讀為陰性)，在癌組織中細(xì)胞陽性部位為癌細(xì)胞核和細(xì)胞漿[8]。JAG1在癌組織細(xì)胞陽性部位為細(xì)胞核[9]，在癌旁組織不表達(dá)。陽性部位出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性。隨機(jī)觀察5個高倍視野(×200)，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評估，最后將二者相乘總積分進(jìn)行評定。陽性細(xì)胞著色評分：0分為無染色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。陽性細(xì)胞的百分率評分：陽性細(xì)胞<10% 為0分、陽性細(xì)胞10%～25%為1分、陽性細(xì)胞26%～50%為2分、陽性細(xì)胞>50% 為3分。總積分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞百分率評分。0～1分為 (-)、2～3分為 (+)、4～6分為 (++)、7～9為 (+++)；定義 (-/+) 為低表達(dá)， (++/+++) 為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，采用Fisher確切概率分析數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP1和JAG1在TNBC及癌旁組織中的表達(dá)情況IHC結(jié)果見圖1。IHC結(jié)果顯示，YAP1在TNBC組織的表達(dá)明顯，而在癌旁組織中未見表達(dá)，且二者差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表1。較II級TNBC組織相比，YAP1在III級TNBC組織中，無論是陽性細(xì)胞著色程度還是陽性細(xì)胞數(shù)量，均有增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表2。JAG1在TNBC組織中的表達(dá)水平較癌旁組織相比呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。另外，與YAP1的表達(dá)相似，JAG1的在III級TNBC組織中的表達(dá)也明顯強(qiáng)于II級TNBC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。以上結(jié)果說明YAP1、JAG1參與TNBC發(fā)生發(fā)展。

圖1 YAP1和JAG1在癌旁組織和TNBC組織中的表達(dá)情況(×200)

表1 YAP1和JAG1在組織中的表達(dá)情況

表2 YAP1和JAG1在TNBC組織學(xué)分級中的差異性表達(dá)

2.2 YAP1蛋白和JAG1蛋白在TNBC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性通過與相關(guān)臨床病理參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析可以發(fā)現(xiàn)，YAP1蛋白和JAG1蛋白的表達(dá)與患者年齡和月經(jīng)情況無關(guān)，而均與腫物大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級相關(guān)。YAP1蛋白和JAG1蛋白高表達(dá)者，腫瘤增大明顯，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且病理組織學(xué)分級較高(見表3)。

表3 YAP1和JAG1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討論

世界衛(wèi)生組織發(fā)起全球應(yīng)對乳腺癌倡議，并稱預(yù)計(jì)到2040年，每年將乳腺癌死亡率降低2.5%，將挽救250萬人的生命。TNBC作為乳腺癌的一個亞型，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)等諸多特點(diǎn)。YAP1作為Hippo信號通路末端效應(yīng)因子，已成為一個重要的癌基因，受Hippo信號通路激酶級聯(lián)反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。既往研究表明，Hippo通路下游效應(yīng)因子YAZ/TAZ可以激活JAG1，而Notch受體活化形式NICD通過抑制TAZ降解，起到穩(wěn)定TAZ蛋白的作用，從而增強(qiáng)YAZ/TAZ的活性，則Notch信號通路配體JAG1與Hippo信號通路效應(yīng)因子YAZ/TAZ之間形成正反饋回路[10-11]。有研究表明，YAP1過表達(dá)與多種癌癥放化療抵抗及耐藥性有關(guān)。通過使用YAP1抑制劑不僅能增強(qiáng)浸潤性乳腺癌對標(biāo)準(zhǔn)療法的反應(yīng)，還能使TNBC靶向藥物放療增敏[12-13]。JAG1是Notch信號的一個關(guān)鍵配體，有文獻(xiàn)報(bào)道，JAG1與ER/PR/HER-2受體狀態(tài)等有密切關(guān)聯(lián)，在TNBC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于其他亞型乳腺癌[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平可以直接影響患者預(yù)后，并能預(yù)測患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生與否[15]。

本研究通過對YAP1蛋白和JAG1蛋白的表達(dá)水平的觀察，發(fā)現(xiàn)此二種蛋白在TNBC組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，且差異顯著，P值均<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且與II級TNBC組織相比，YAP1和JAG1蛋白在III級TNBC組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，證明YAP1和JAG1的表達(dá)與TNBC惡性程度呈正相關(guān)。由此可以看出，YAP1和JAG1共同促進(jìn)TNBC的發(fā)生發(fā)展。另外，在與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析中我們可以看出，YAP1和JAG1的表達(dá)情況與患者年齡大小和月經(jīng)情況無明顯相關(guān)性，而與腫物大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和病理分級有明顯相關(guān)性。其中，二者的表達(dá)與臨床病理分級的相關(guān)性也驗(yàn)證了如前所述的YAP1和JAG1的表達(dá)與腫物惡性程度相關(guān)這一觀點(diǎn)。

綜上所述，YAP1和JAG1在TNBC可能作為促癌基因，通過Hippo/Notch信號通路，共同促進(jìn)TNBC發(fā)生發(fā)展，YAP1和JAG1有望成為TNBC治療的新靶點(diǎn)。