劉源, 張秀妍, 徐妙云, 鄭紅艷, 鄒俊杰, 張?zhí)m, 王磊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 北京 100081)

干旱脅迫影響植物生長發(fā)育、生理代謝、地理分布、品質(zhì)產(chǎn)量，是威脅糧食安全的主要環(huán)境因素之一[1]。在干旱條件下，植物會產(chǎn)生一系列結(jié)構(gòu)和生理改變，如葉片和根系形態(tài)改變、氣孔運(yùn)動、滲透損傷、物質(zhì)吸收失衡、光合能力降低等[2-5]。植物在干旱響應(yīng)過程中，大量抗旱相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平會發(fā)生改變，包括轉(zhuǎn)錄因子基因、滲透調(diào)節(jié)基因、抗氧化代謝基因和逆境誘導(dǎo)基因等，其中，許多基因在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平受small RNA調(diào)控[2, 5]。因此，small RNA及其靶基因組成調(diào)控模塊是植物干旱脅迫響應(yīng)過程中的關(guān)鍵因子。

microRNA(miRNA)是廣泛分布于植物基因組中的內(nèi)源性單鏈非編碼small RNA，長度18～24個核苷酸(nt)。miRNA通過結(jié)合靶基因上的互補(bǔ)序列誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)而發(fā)揮功能[6]。miRNA不僅是植物生長發(fā)育和生理代謝活動的重要調(diào)節(jié)因子，同時也參與了各種生物和環(huán)境脅迫(干旱、高鹽、高溫、冷凍等)的響應(yīng)過程[6-7]。目前，許多植物物種的干旱脅迫緊密相關(guān)或響應(yīng)miRNAs已被鑒定和研究[2-4]。然而，干旱逆境適應(yīng)和響應(yīng)是一個非常復(fù)雜的過程，更多干旱調(diào)控關(guān)鍵miRNAs及其功能有待鑒定和解析，而且miRNA-靶基因調(diào)控干旱脅迫的分子機(jī)制仍不完全清楚。

本研究擬通過高通量RNA-seq技術(shù)對水稻根、莖和葉片中small RNA在干旱處理后全基因組水平上的表達(dá)變化情況進(jìn)行研究，鑒定已知miRNAs和新miRNAs、篩選和挖掘干旱響應(yīng)差異表達(dá)miRNAs并對其預(yù)測的調(diào)控靶基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，為進(jìn)一步探明水稻干旱脅迫應(yīng)答和適應(yīng)過程中的miRNAs調(diào)控機(jī)制及其分子調(diào)控通路和網(wǎng)絡(luò)提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料培養(yǎng)

水稻材料OsPIR1-RNAi(背景為OryzasativaL. ssp.japonica)最初來自本課題組構(gòu)建的RNAi突變體庫[8]，為OsPIR1基因(Os03g0845000)的RNA干擾(RNA interference)植株。首先，選取該材料T2代的種子經(jīng)75%乙醇和2.5% NaClO(體積分?jǐn)?shù))消毒后在濾紙上室溫萌發(fā)約48 h，然后轉(zhuǎn)移至土壤，在16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度約8 000 lx，28 ℃光照培養(yǎng)箱生長至幼苗二葉期。

1.2 干旱處理與樣品收集

選取二葉期生長相對一致的水稻植株轉(zhuǎn)移至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，從該時期的水稻幼苗開始持續(xù)斷水處理。處理0、24、96 h采集根(root，R)、莖(stem，S)及葉(leaf，L)，分別命名為R-0 h、S-0 h、L-0 h、R-24 h、S-24 h、L-24 h、R-96 h、S-96 h、L-96 h，共9個樣品，立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Small RNA文庫構(gòu)建及測序

采用EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒(RN5301，Aidlab)提取9個樣品的總 RNAs，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增后經(jīng)過純化和大小選擇構(gòu)建small RNA文庫并進(jìn)行質(zhì)量評估[9-10]。將構(gòu)建合格的文庫使用北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司Illumia Solexa測序平臺進(jìn)行高通量single-end測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及注釋

首先將Illumia測序得到的圖像經(jīng)堿基識別[11]轉(zhuǎn)化為FASTQ格式的原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)。去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量讀數(shù)、接頭序列、冗余片段及短于18或長于30個核苷酸的序列，獲得高質(zhì)量序列(clean reads)，統(tǒng)計測序堿基質(zhì)量值Q30等[11-12]，盡可能地保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。將clean reads利用Bowtie軟件(v1.0.0)[13]比對Silva(http://www.arb-silva.de/)、GtRNAdb(http://lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/)、Rfam(http://rfam.xfam.org/)和Repbase(http://www.girinst.org/repbase/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，包括核糖體RNA(rRNA)、核內(nèi)小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)等非編碼RNA以及重復(fù)序列(repbase)，未比對上的clean reads則被認(rèn)定為未注釋序列(unannotated reads)。

1.5 已知miRNAs和新miRNAs鑒定

使用Bowtie軟件[13]將未注釋序列與水稻參考基因組(Oryza_sativa.IRGSP-1.0)進(jìn)行序列比對，獲取其在基因組上的位置信息。將比對到參考基因組的序列(mapped reads)與miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase(release 22；http://www.mirbase.org/)中的已知成熟miRNA序列及其上游2 nt與下游5 nt范圍內(nèi)進(jìn)行比對，最多允許一個堿基錯配，能比對到的序列即被鑒定為已知miRNAs。利用miRDeep2軟件(v2.0.5)[14]，通過mapped reads在參考基因組上的位置信息得到潛在前體序列，基于miRNA前體特征二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)及前體結(jié)構(gòu)能量信息(RNAfold randfold)采用貝葉斯模型經(jīng)打分最終實(shí)現(xiàn)新miRNAs的預(yù)測[15]。

1.6 差異表達(dá)miRNAs分析

首先將所有樣本中miRNAs表達(dá)量采用TPM(transcript per million)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化處理[16]。將干旱處理后24 和96 h的根莖葉(R/S/L-24 h、R/S/L-96 h)分別與0 h對應(yīng)的組織(R/S/L-0 h)進(jìn)行兩兩比較，使用edgeR軟件(v3.8.6)[17]用來確定差異表達(dá)，以|log2(FC)|≥1.0(fold change, FC)和FDR≤0.1(false discovery rate, FDR)為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的miRNAs。利用在線平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)構(gòu)建韋恩圖。使用R packages(http://www.rproject.org/)對差異表達(dá)的miRNAs以log2(TPM+1)值進(jìn)行層次聚類分析，TPM (transcripts per million)為標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA表達(dá)值。

1.7 靶基因預(yù)測及功能注釋

利用TargetFinder平臺(v1.6)[18-19]對獲得的差異表達(dá)的已知miRNAs和新miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測。然后通過BLAST軟件將靶基因序列與NR(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)、Swiss-Prot(http://www.uniprot.org/)、GO (http://www.geneontology.org/)、COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、KOG (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/KOG/)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索比對，進(jìn)而對靶基因進(jìn)行功能注釋。

1.8 靶基因GO與KEGG富集分析

使用GOseq[20]和KOBAS[21]對靶基因進(jìn)行GO富集分析(Wallenius non-central hyper-geometric distribution)和KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻干旱處理后small RNA的數(shù)量變化

干旱處理0、24和96 h的水稻根組織分別獲得4 120 407、2 538 241和2 130 755條高質(zhì)量序列(clean reads)；莖組織分別產(chǎn)生2 506 166、1 371 020和1 407 041條高質(zhì)量序列；葉組織分別產(chǎn)生2 995 912、1 741 575和1 617 673條高質(zhì)量序列。通過質(zhì)量控制，每個樣本堿基質(zhì)量值Q30均大于94%，表明small RNA-seq建庫測序過程中堿基識別精度很高，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

干旱處理后0、24和96 h的水稻根組織產(chǎn)生的未注釋序列(unannotated reads)占所有small RNA比例分別為87.15%、72.19%和76.57%；莖的占比分別為90.4%、71.78%和77.48%；葉的占比分別為92.06%、69.98%和79.34%(表1)。將以上得到的unannotated reads映射到水稻參考基因組，能比對到基因組正鏈(+)或負(fù)鏈(-)上的即為mapped reads。干旱處理0、24和96 h的水稻根組織mapped reads占所有unannotated reads比例分別為55.75%、13.42%和21.04%；莖的占比分別為60.05%、50.77%和43.78%；葉的占比分別為53.18%、39.04%和46.05%(表1)。這些結(jié)果表明，干旱處理后水稻根、莖和葉組織中的clean reads、unannotated reads、mapped reads均存在不同程度的下降。

表1 水稻small RNA分類注釋和比對到水稻參考基因組信息統(tǒng)計Table 1 Summary of classification of rice small RNA and unannotated reads mapped on rice genome

2.2 水稻干旱處理后small RNA的長度分布變化

small RNA的長度一般為18～30 nt，其中21～24 nt的small RNA在植物體內(nèi)豐度較高且發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。對干旱處理后水稻根、莖和葉組織中small RNA長度分布的變化趨勢進(jìn)行分析，結(jié)果(圖1)表明：①R/S/L-0 h、S/L-24 h和R/S/L-96 h中24 nt small RNA豐度最高，而R-24 h中21 nt small RNA豐度最高；②隨著干旱處理時間的延長，水稻根和莖中21 nt small RNA豐度先升高后下降，而葉片中的21 nt small RNA則不斷下降；③根、莖和葉中22 nt small RNA豐度在處理后均呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢；④隨著干旱處理時間的增加，根中23 nt small RNA豐度先迅速下降后緩慢上升，而莖和葉中23 nt small RNA豐度則不斷下降；⑤根、莖和葉中24 nt small RNA的豐度在干旱處理后均呈先下降后上升趨勢。

圖1 干旱處理后水稻根、莖和葉中small RNA長度分布Fig.1 Length distribution of small RNAs in rice root, stem and leaf under drought

2.3 水稻干旱處理后miRNAs變化

將mapped reads與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對和莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，所有樣品共鑒定到403個miRNAs，其中已知miRNA 352個，新預(yù)測miRNA 51個，而且水稻干旱處理后不同時間的根、莖和葉組織中已知miRNAs和新miRNAs表達(dá)數(shù)量不同。

表2 miRNAs數(shù)量統(tǒng)計Table 2 Summary of miRNAs number

2.4 水稻干旱處理后差異表達(dá)的miRNAs

根據(jù)表達(dá)量計算各miRNA在同一組織不同時間點(diǎn)樣本間的表達(dá)水平變化情況，結(jié)果(表3)顯示，水稻葉片干旱處理96 h后差異表達(dá)的miRNAs最多，而根部處理96 h后和莖部處理24 h后差異表達(dá)的miRNAs最少。其中，miRNAs表達(dá)上調(diào)數(shù)量最多的是干旱處理后96 h的葉，數(shù)量最少的是處理后24 h的根和莖；miRNAs表達(dá)下調(diào)數(shù)量最多的是干旱處理后96 h的莖部，數(shù)量最少的是處理后96 h的根部。為深入挖掘參與調(diào)控水稻干旱脅迫響應(yīng)過程中的miRNAs，進(jìn)一步對差異表達(dá)miRNAs在干旱處理后不同組織的變化趨勢進(jìn)行詳細(xì)分析。

表3 干旱處理后水稻根、莖和葉差異表達(dá)的miRNAs數(shù)量Table 3 Number of differentially expressed miRNAs in drought-treated root, stem and leaf

2.4.1根差異表達(dá)miRNAs分析 從圖2可以看出，21個miRNAs在處理后兩個時間點(diǎn)的水稻根組織中都差異表達(dá)。根據(jù)表達(dá)量變化趨勢，將這21個差異表達(dá)miRNAs分為三類。第Ⅰ類包含Osa-miR11337-5p和Osa-miR11340-5p，它們在干旱處理24 h內(nèi)表達(dá)量迅速降低，在24 至96 h內(nèi)逐漸升高；第Ⅱ類包含12個miRNAs，它們的表達(dá)量在干旱處理96 h內(nèi)持續(xù)升高；第Ⅲ類包含7個miRNAs，它們的表達(dá)量在干旱處理24 h內(nèi)迅速升高，在24 至96 h內(nèi)逐漸下降。

圖2 干旱處理后水稻根中差異表達(dá)miRNAs情況Fig.2 Changes in miRNAs expression of root under drought

對這21個差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Osa-miR166家族和Osa-miR820家族中表達(dá)發(fā)生變化的成員最多，其中Osa-miR166家族的4個成員表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，而Osa-miR820家族的3個成員表達(dá)則持續(xù)升高，表明這兩個miRNA家族可能在水稻根對干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能。

2.4.2莖差異表達(dá)miRNAs分析 從圖3可以看出，28個miRNAs在處理后兩個時間點(diǎn)的水稻莖組織中都呈現(xiàn)差異表達(dá)。根據(jù)表達(dá)水平變化趨勢，將這28個差異表達(dá)miRNAs分為四類。第Ⅰ類包含4個miRNAs：Osa-miR167i-3p、Osa-miR408-5p、Osa-miR2878-5p和Osa-miR11340-5p，它們的表達(dá)量在干旱處理96 h內(nèi)持續(xù)下調(diào)；第Ⅱ類包含3個miRNAs：Osa-miR1425-5p、Osa-miR5788和Osa-miR11337-5p，它們的表達(dá)量在24 h內(nèi)迅速降低，在24 至96 h內(nèi)逐漸升高；第Ⅲ類包含10個miRNAs，它們在干旱處理96 h內(nèi)表達(dá)量持續(xù)升高；第Ⅳ類包含了11個miRNAs，它們的表達(dá)量在96 h內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

差異表達(dá)的miRNA家族中，Osa-miR166家族的5個成員和Osa-miR159家族的2個成員在干旱處理后表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，而3個新miRNAsnovel_miR_13、novel_miR_24和novel_miR_29則受干旱脅迫誘導(dǎo)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，推斷它們可能也參與了水稻莖部干旱響應(yīng)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.4.3葉差異表達(dá)miRNAs的變化 從圖4可以看出， 38個miRNAs在處理后兩個時間點(diǎn)的水稻葉組織中都呈現(xiàn)差異表達(dá)。根據(jù)表達(dá)量變化趨勢，將這38個差異表達(dá)miRNAs分為五類。第Ⅰ類包含8個miRNAs，它們的表達(dá)水平在干旱處理96 h內(nèi)持續(xù)下降；第Ⅱ類包含4個miRNAs，它們在24 h內(nèi)表達(dá)量迅速降低，在24 至96 h內(nèi)逐漸升高；第Ⅲ類包含19個miRNAs，它們在干旱處理96 h內(nèi)表達(dá)量持續(xù)上調(diào)；第Ⅳ類包含5個miRNAs，它們的表達(dá)量在96 h內(nèi)先升高后降低；第Ⅴ類包含Osa-miR1425-3p和Osa-miR11342-5p，它們只在0 h的葉中表達(dá)，而在處理后24 和96 h均未檢測到表達(dá)。

對這38個差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步家族分析發(fā)現(xiàn)，Osa-miR160家族的3個成員、Osa-miR166家族的5個成員和Osa-miR820家族的3個成員表達(dá)量受干旱誘導(dǎo)持續(xù)上升，而Osa-miR159家族的2個成員表達(dá)水平隨著處理時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，表明這些miRNA家族在水稻葉片中響應(yīng)干旱脅迫。

2.4.4根、莖和葉中共同差異表達(dá)miRNAs的變化 進(jìn)一步對21、28和38個分別在水稻根、莖和葉差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，共有15個miRNAs在干旱處理后24和96 h的各組織中均差異表達(dá)。其中Osa-miR159f、Osa-miR164f、Osa-miR5082和Osa-miR5493的表達(dá)水平隨處理時間的增加而持續(xù)升高，表明它們受干旱脅迫誘導(dǎo)。因此，這些miRNAs是水稻營養(yǎng)組織干旱逆境適應(yīng)與響應(yīng)機(jī)制中關(guān)鍵調(diào)控因子。進(jìn)一步對比水稻不同組織的差異表達(dá)miRNAs發(fā)現(xiàn)：Novel_miR_37在0 h的根、莖和葉中表達(dá)水平很低，而干旱處理后迅速上升；Osa-miR11337-5p和Osa-miR11340-5p在0 h的根、莖和葉中表達(dá)量較高，而處理后迅速降至很低水平；Osa-miR166c-3p在根、莖和葉中的表達(dá)變化趨勢相同，均表現(xiàn)為先升后降；Osa-miR1876在根和葉中表達(dá)量隨處理時間持續(xù)上升，而在莖中則先顯著上調(diào)后緩慢下降。這些結(jié)果說明，不同處理時間的根、莖和葉組織具有明顯不同的miRNAs表達(dá)譜，而且同一個miRNA在不同組織部位的表達(dá)水平也并不相同。

圖5 干旱處理后水稻根、莖、葉共同差異表達(dá)的miRNAsFig.5 Differentially expressed miRNAs all in root, stem and leaf under drought treatment

2.5 預(yù)測的miRNAs靶基因及GO/KEGG富集

miRNA是通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平從而發(fā)揮生理功能，靶基因被進(jìn)一步利用TargetFinder平臺進(jìn)行預(yù)測，最終發(fā)現(xiàn)403個miRNAs共對應(yīng)4 537個靶基因。其中，352個已知miRNAs共對應(yīng)3 883個靶基因，51個新miRNAs共對應(yīng)785個靶基因。進(jìn)一步使用數(shù)據(jù)庫比對方法獲得靶基因的詳細(xì)功能注釋信息，4 537個靶基因中4 484個獲得注釋信息。在干旱處理24和96 h后,根中差異表達(dá)的51個miRNAs共對應(yīng)923個靶基因，莖中差異表達(dá)的69個miRNAs共對應(yīng)641個靶基因，葉中差異表達(dá)的83個miRNAs共對應(yīng)1 247個靶基因。

為了進(jìn)一步了解干旱處理后水稻根、莖和葉組織中差異表達(dá)miRNAs對應(yīng)的靶基因主要富集到哪些代謝途徑和生物學(xué)過程，進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。結(jié)果(圖6)表明：對于根，在GO生物學(xué)過程中靶基因顯著富集于氧化還原、木質(zhì)素分解代謝等過程，在GO細(xì)胞組分中顯著富集于細(xì)胞膜相關(guān)囊泡和質(zhì)外體等；在GO分子功能中顯著富集于電子載體活性和血紅素結(jié)合等，而角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成及堿基切除修復(fù)等是顯著富集的KEGG通路；對于莖，在GO分子功能中顯著富集于ADP結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)合等，在GO生物學(xué)過程中靶基因顯著富集于防御應(yīng)答和細(xì)胞凋亡過程等，在GO細(xì)胞組分中顯著富集于核仁組織區(qū)和葉綠體基質(zhì)類囊體等，而甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及脂肪酸生物合成等是顯著富集的KEGG通路；對于葉，在GO生物學(xué)過程中靶基因顯著富集于氧化還原和細(xì)胞凋亡過程等，在GO分子功能中顯著富集于染色質(zhì)結(jié)合和質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)活性等，在GO細(xì)胞組分中顯著富集于泛素連接酶復(fù)合體和細(xì)胞膜相關(guān)囊泡等，而角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成以及油菜素內(nèi)酯生物合成等是顯著富集的KEGG通路。總之，這些結(jié)果為揭示水稻根、莖和葉組織響應(yīng)干旱脅迫應(yīng)答的分子細(xì)胞機(jī)制提供了線索和參考。

A:根；B：莖；C：葉；左圖：GO分析；右圖：KEGG富集分析。A: Root; B: Stem: C: Leaf; Left: GO analysis; Right: KEGG analysis.圖6 干旱處理?xiàng)l件下差異表達(dá)miRNAs對應(yīng)靶基因GO和KEGG分析Fig.6 GO and KEGG analysis of genes targeted by differentially expressed miRNAs after drought stress

3 討論

miRNA不僅受干旱脅迫誘導(dǎo)而改變表達(dá)水平，也通過在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)干旱響應(yīng)靶基因表達(dá)而參與植物干旱環(huán)境適應(yīng)及干旱抗性應(yīng)答過程[2, 5]。目前，已有研究使用芯片技術(shù)對斷水干旱處理?xiàng)l件下分蘗期和花序形成期的水稻植株[22]，以及利用small RNA測序?qū)?0% PEG模擬干旱脅迫條件下幼苗期的水稻根和苗組織[23]和斷水干旱處理?xiàng)l件下開花期的水稻劍葉、穗[24]與成熟花序[25]進(jìn)行了表達(dá)譜分析。本研究通過分析全基因組范圍內(nèi)miRNA轉(zhuǎn)錄組的變化深入挖掘干旱逆境相關(guān)miRNAs，并結(jié)合先前研究結(jié)果解析水稻不同組織響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

miR159受干旱脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，而且它通過抑制MYB類靶基因的表達(dá)來參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而在干旱響應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能[3, 26]。本研究結(jié)果顯示，Osa-miR159f的表達(dá)水平在營養(yǎng)組織中受干旱脅迫誘導(dǎo)持續(xù)上調(diào)，而Osa-miR159f的預(yù)測靶基因Os01g0812000、Os03g0578900、Os05g0490600和Os06g0605600編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子，其中Os03g0578900和Os06g0605600已被報道在干旱條件下的水稻葉和花序組織中表達(dá)下調(diào)[27-28]，表明干旱脅迫下Osa-miR159f與Os03g0578900和Os06g0605600可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。miR164通過調(diào)節(jié)NAC類靶基因的表達(dá)水平來參與生長素信號并負(fù)調(diào)控干旱抗性[29-30]。本研究中Osa-miR164f在干旱處理后持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而其預(yù)測靶基因Os02g0579000、Os04g0460600、Os06g0675600、Os08g0200600和Os12g0610600編碼NAC類轉(zhuǎn)錄因子，其中Os02g0579000和Os08g0200600的表達(dá)在水稻葉或幼苗中受干旱誘導(dǎo)下調(diào)[27, 31]，表明Osa-miR164f在干旱響應(yīng)過程中可能負(fù)調(diào)控Os02g0579000和Os08g0200600。已有研究表明，miR166通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Homeobox-leucinezipper(HD-ZIP)類靶基因的表達(dá)參與干旱脅迫下側(cè)根發(fā)育[2, 4]。本研究中五個miR166家族成員在干旱處理后的營養(yǎng)組織中都差異表達(dá)，而它們的預(yù)測靶基因編碼HD-ZIP類轉(zhuǎn)錄因子，其中Os12g0612700在干旱處理后的水稻葉中表達(dá)被下調(diào)[27]，表明在干旱響應(yīng)過程中它們可能也存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。因此上述調(diào)控模塊在水稻營養(yǎng)組織響應(yīng)和抵御干旱脅迫過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR160、miR167、miR408和miR528也被證實(shí)涉及響應(yīng)、緩解和抵御植物干旱逆境脅迫[2-4]，而本研究中這些miRNAs也在干旱處理后根、莖或葉組織中也差異表達(dá)。Osa-miR5082和Osa-miR5493在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，但它們在干旱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的具體功能目前尚未被報道。而且本研究中發(fā)現(xiàn)的許多差異表達(dá)的新miRNAs可能與干旱脅迫調(diào)控緊密相關(guān)，它們的具體分子機(jī)制也有待于進(jìn)一步挖掘和解析。

植物在遭遇干旱脅迫時會通過干旱響應(yīng)miRNAs-靶基因在分子水平啟動干旱適應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而改變生理代謝活動和形態(tài)結(jié)構(gòu)如抗氧化物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、細(xì)胞失水保護(hù)物質(zhì)合成等來緩解或抵御干旱逆境[2,5,32-34]。本研究中差異miRNAs對應(yīng)的靶基因顯著富集在氧化還原途徑、脯氨酸和α-亞麻酸(alpha-linolenic acid)代謝以及角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成等，證實(shí)這些生物過程和代謝途徑可能參與干旱逆境響應(yīng)，但它們的具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。

總之，miRNAs在水稻根、莖和葉組織對干旱脅迫的適應(yīng)和響應(yīng)過程中扮演了重要的角色，而且本文構(gòu)建的miRNAs-靶基因的調(diào)控模塊也為進(jìn)一步闡明和完善植物在干旱脅迫條件下結(jié)構(gòu)、生理和分子改變的詳細(xì)機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)，并將為分子遺傳育種改良水稻抗旱性提供了分子數(shù)據(jù)資源。