劉佰明，王 芳，劉 茹，楊澤眾，白義川，谷希樹

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，天津 300384)

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一類全球廣泛分布的農(nóng)業(yè)害蟲，至少由36個(gè)形態(tài)上難以區(qū)分但具有生殖隔離的隱種組成(Liuetal., 2012)。為方便，本文將B煙粉虱稱作MEAM1隱種，Q煙粉虱稱作MED隱種。近些年來，隨著MEAM1和MED煙粉虱相繼入侵我國(Luoetal., 2002；Chuetal., 2006)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煙粉虱為害的寄主多達(dá)600余種(Oliveiraetal., 2001)，不僅通過直接取食為害，更是傳播200多種植物雙生病毒(Hogenhoutetal., 2008)。雙生病毒是植物病毒中一類最大、最具破壞性的類群，在熱帶、亞熱帶及溫帶廣大地區(qū)引發(fā)作物病害，且這類病毒只能有煙粉虱傳播(Moffat, 1999)。其中，番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)是一種入侵性的雙生病毒，起源于中東，于2006年在上海首次被發(fā)現(xiàn)(Wuetal., 2006)，隨后迅速席卷我國主要的番茄產(chǎn)區(qū)(Panetal., 2012)，帶來巨大的損失。煙粉虱通過取食行為傳播雙生病毒，伴隨口針在韌皮部分泌唾液和吸食兩個(gè)關(guān)鍵的取食行為(Jiangetal., 2000)。病毒粒子隨煙粉虱吸食韌皮部汁液進(jìn)入食道，穿過中腸進(jìn)入血淋巴，再進(jìn)入唾液腺，然后隨著煙粉虱唾液分泌被注入到寄主植物韌皮部篩管中，具有持久、循環(huán)性，一旦獲毒終生可傳(Czosnek and Ghanim, 2011)。顯然，阻斷傳毒媒介煙粉虱，是控制植物病毒病的重要手段。

應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑是過去10年防治煙粉虱最為重要的手段之一，其中阿維菌素、呋蟲胺、氟啶蟲胺腈、螺蟲乙酯及溴氰蟲酰胺等藥劑均對煙粉虱起到很好的防治效果(褚棟等，2018)。通過防治煙粉虱控制TYLCV不乏成功的范例，Mason等(2000)研究表明，新煙堿類藥劑噻蟲嗪無論是葉面噴施還是灌根均對TYLCV有很好的防治效果。氟吡呋喃酮是拜耳公司新研發(fā)的新煙堿型殺蟲劑，無論是在國外(Roditakisetal., 2017)還是在國內(nèi)(Liuetal., 2021)，都被證明對煙粉虱及其傳播的TYLCV有很好的控制效果。但是長期使用單一類型的殺蟲劑，煙粉虱極易產(chǎn)生抗藥性，輪換使用不同種類殺蟲劑是抗性治理的主要手段。溴氰蟲酰胺是杜邦公司開發(fā)的魚尼丁受體抑制劑類殺蟲劑，在植物體內(nèi)具有雙向內(nèi)吸傳導(dǎo)特性，室內(nèi)生測表明對煙粉虱具有很強(qiáng)的內(nèi)吸殺卵和觸殺殺卵作用，對若蟲具有極高的毒力(王海娜等，2014)，在田間也表現(xiàn)出很好的防治效果(何翠娟等，2013；張秀霞等，2018)。田間煙粉虱及TYLCV協(xié)同防治試驗(yàn)證明，溴氰蟲酰胺在田間應(yīng)用劑量下對煙粉虱及其傳播的病毒病具有極佳的控制效果(Caballeroetal., 2015)。

在田間，殺蟲劑施用后隨著時(shí)間的推移逐步降解，對害蟲的毒殺作用逐步減弱。溴氰蟲酰胺在亞致死濃度下顯著延長MED煙粉虱的發(fā)育時(shí)間、降低若蟲、偽蛹和成蟲期的存活率(Wangetal., 2017)。推測在亞致死濃度下，溴氰蟲酰胺仍然對煙粉虱傳毒相關(guān)的取食行為產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而影響傳毒效率。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究首先測定了溴氰蟲酰胺的亞致死劑量LC15，在此劑量下，利用昆蟲刺探電位(EPG)和熒光定量技術(shù)研究了MED煙粉虱取食行為及傳毒效率。研究結(jié)果將對充分理解溴氰蟲酰胺對煙粉虱傳播TYLCV的抑制作用，合理使用殺蟲劑控制煙粉虱及其傳播的病毒病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植物

選用中雜9號(hào)番茄作為供試植物，利用草炭土和蛭石(體積比2 ∶1)作為植物培養(yǎng)基質(zhì)。在番茄苗培養(yǎng)至3～4片真葉期注射農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TYLCV(上海分離物)侵染性克隆(引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所)，再培養(yǎng)4周表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀后，作為發(fā)病番茄苗使用。

1.2 供試?yán)ハx

所用MED煙粉虱于2015年引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，飼養(yǎng)在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)，用80目尼龍紗網(wǎng)籠(45 cm× 45 cm×60 cm)隔離飼養(yǎng)在棉花苗上，環(huán)境溫度26±2℃，相對濕度60%±10%，光周期14 L ∶10 D。將大約300頭煙粉虱成蟲轉(zhuǎn)移到發(fā)病番茄苗(6～7葉期)上，用上述紗網(wǎng)籠隔離飼養(yǎng)2代，獲得攜帶TYLCV煙粉虱成蟲。將另外 300頭煙粉虱成蟲轉(zhuǎn)移到健康番茄苗(6～7葉期)上，同樣條件飼養(yǎng)兩代建立未攜毒煙粉虱種群。

1.3 溴氰蟲酰胺對煙粉虱成蟲亞致死濃度測定

采用活體植物-微蟲籠法，首先將10%溴氰蟲酰胺可分散游懸浮劑(上海杜邦農(nóng)化有限公司)用蒸餾水稀釋5個(gè)處理濃度，每個(gè)濃度配制藥液200 mL，分別用500 mL小噴壺噴灑在未攜毒番茄苗(6～7片葉)表面，噴灑至頁面滴水為止。噴灑同樣體積蒸餾水作為空白對照。番茄苗噴藥后放置在室內(nèi)自然陰干，24 h后分別接入攜毒和未攜毒MED煙粉虱。每個(gè)濃度藥液處理攜毒和未攜毒煙粉虱分別設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)用直徑2 cm的微型夾葉籠接攜毒或未攜毒煙粉虱雌蟲30頭，夾在5株番茄植株中間葉片背面。接蟲48 h后檢查記錄煙粉虱的存活數(shù)和死亡數(shù)，用polo軟件計(jì)算致死中量LC50和亞致死劑量LC15。

1.4 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理對煙粉虱成蟲取食行為的影響

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別是攜毒MED煙粉虱取食溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理的番茄苗和蒸餾水處理的番茄苗，均采用6～7片葉大小的番茄苗。煙粉虱采用初羽化2～4 d的攜毒雌成蟲。EPG記錄方法參考Liu等(2013)，波形識(shí)別方法參考Liu等(2012)。每一對昆蟲-植物組合只記錄一次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件。

1.5 攜毒煙粉虱傳播TYLCV效率試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別用溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)和蒸餾水噴施番茄苗(6～7片葉)。24 h后，取初羽化24 h內(nèi)的攜毒煙粉虱雌成蟲，用直徑3 cm的夾葉籠加在番茄苗葉背面，每個(gè)處理16個(gè)重復(fù)，每重復(fù)用一株番茄苗接5頭攜毒煙粉虱。接蟲后在溫度26±2℃，相對濕度60%±10%，光周期14 L ∶10 D條件下培養(yǎng)48 h后，去除煙粉虱成蟲，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，取頂稍兩片真葉共100 mg組織，采用天根DP320植物基因組試劑盒進(jìn)行DNA提取。參考Ning等(2015)方法進(jìn)行qPCR相對定量檢測TYLCV。

2 結(jié)果與分析

2 .1 溴氰蟲酰胺對MED煙粉虱的亞致死濃度

溴氰蟲酰胺對未攜毒和攜毒MED煙粉虱的亞致死濃度(LC15)分別為1.52 mg/kg和1.75 mg/kg，差異不顯著。未攜毒和攜毒煙粉虱的致死中濃(LC50)分別為4.01 mg/kg和11.91 mg/kg，未攜毒煙粉虱致死中濃度顯著低于攜毒煙粉虱(表1)。

表1 溴氰蟲酰胺對未攜毒和攜毒MED煙粉虱的亞致死和致死中濃度比較

2.2 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理對煙粉虱成蟲取食行為的影響

攜帶TYLCV的MED煙粉虱在溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理和空白對照處理的番茄苗上取食，在非韌皮部取食階段計(jì)算了6個(gè)EPG參數(shù)，其中第一次刺探起始時(shí)間在溴氰蟲酰胺處理下顯著推遲，是對照番茄苗上的3.7倍(圖1-A)，其余5個(gè)參數(shù)在處理和對照間均無顯著差異(圖1-B～F)。

圖1 溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理對攜帶TYLCV煙粉虱非韌皮部取食行為的影響Fig.1 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on non-phloem feeding behavior of Bemisia tabaci vectored TYLCV注：“*”表示處理和對照組間差異顯著(Mann-Whitney U test, P<0.05)。下圖同。Note：“*” indicated significant difference between treatment and control group (Mann-Whitney U test, P<0.05).The same below.

在韌皮部取食階段，計(jì)算了8個(gè)EPG參數(shù)，攜帶TYLCV的MED煙粉虱在溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理的番茄苗上唾液分泌平均時(shí)間(圖2-C)、韌皮部吸食總時(shí)間(圖2-D)和韌皮部吸食平均時(shí)間(圖2-F)顯著縮短，潛在取食指數(shù)(圖2-G)顯著降低，分別是對照組的0.10、0.14和0.10倍。其余4個(gè)參數(shù)在處理和對照組間差異不顯著。

圖2 溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理對攜帶TYLCV煙粉虱韌皮部取食行為的影響Fig.2 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on phloem feeding behavior of Bemisia tabaci vectored TYLCV

2.3 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理對煙粉虱傳毒效率的影響

與空白對照相比，溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理極顯著的降低了攜帶TYLCV的MED煙粉虱的傳毒效率(P<0.001)，攜毒煙粉虱取食48 h的番茄苗培養(yǎng)10 d后，TYLCV相對量仍接近于0(圖3)。

圖3 溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理對攜帶TYLCV煙粉虱傳毒效率的影響Fig. 3 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on virus transmission efficiency of Bemisia tabaci vectored TYLCV

3 結(jié)論與討論

本研究表明，攜帶TYLCV和不攜毒煙粉虱對溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理敏感性相當(dāng)，但攜毒煙粉虱對溴氰蟲酰胺致死中濃度(LC50)敏感性顯著低于未攜毒煙粉虱(表1)。這與前期研究攜帶TYLCV煙粉虱對氟吡呋喃酮亞致死濃度(LC15)處理和致死中濃度(LC50)處理的敏感性均顯著低于未攜毒煙粉虱結(jié)果基本一致(Liuetal., 2020)。溴氰蟲酰胺屬于鄰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑，作用于魚尼丁受體(楊桂秋等，2012)，與氟吡呋喃酮作用機(jī)理不同，后者屬于新煙堿類殺蟲劑，作用于乙酰膽堿受體(李晨雨等，2018)。本研究為TYLCV侵染煙粉虱后降低了對殺蟲劑的敏感性提供了又一個(gè)例證。煙粉虱攜帶TYLCV后提高對殺蟲劑耐藥性機(jī)制還不清楚，推測攜帶植物病毒后促進(jìn)煙粉虱體內(nèi)解毒酶的表達(dá)，需要后續(xù)更深入的研究來證實(shí)。

在前人發(fā)現(xiàn)田間應(yīng)用濃度溴氰蟲酰胺顯著抑制MED煙粉虱韌皮部取食的基礎(chǔ)上(Civolanietal., 2014)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)亞致死濃度(LC15)溴氰蟲酰胺對煙粉虱韌皮部取食行為仍具有顯著抑制作用(圖2)，這與前期研究亞致死濃度(LC15)氟吡呋喃酮顯著抑制MED煙粉虱取食行為結(jié)果一致(Liuetal., 2021)。殺蟲劑改變昆蟲行為，與殺蟲劑作用靶標(biāo)位點(diǎn)密切相關(guān)。大多數(shù)殺蟲劑作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，在殺蟲劑在亞致死濃度作用下，廣泛影響昆蟲行為。新煙堿類殺蟲劑是應(yīng)用最廣泛的一類殺蟲劑之一，屬乙酰膽堿激動(dòng)劑，可有選擇的作用于昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿受體(nAChR)(Bassetal., 2015)。不同種類煙堿類殺蟲劑改變各種昆蟲行為的現(xiàn)象已被廣泛報(bào)道，例如吡蟲啉暴露還對蜜蜂蜂巢中工蜂行為產(chǎn)生顯著不利影響(Cralletal., 2018)。亞致死濃度(LC10、LC30)噻蟲嗪處理白菜可顯著縮短桃蚜Myzuspersicae韌皮部吸食時(shí)間(Choetal., 2011)，亞致死劑量噻蟲嗪不但顯著縮短大豆蚜蟲韌皮部吸食時(shí)間，顯著延長其非刺探時(shí)間(Stammetal., 2013)。氟吡呋喃酮，一種新型的新煙堿類藥劑，與噻蟲嗪等無交互抗性，但是作用于昆蟲乙酰膽堿受體的特點(diǎn)使之亞致死濃度(LC15)處理顯著降低攜帶TYLCV的MED煙粉虱韌皮部取食行為(Liuetal., 2021)。溴氰蟲酰胺與煙堿類藥劑作用方式不同，其作用靶標(biāo)是昆蟲的魚尼丁受體，暴露于該藥劑的昆蟲釋放橫紋肌和平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)受損，蟲體麻痹死亡(楊桂秋等，2012)。肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)可能和昆蟲取食行為密切相關(guān)，已有研究表明在溴氰蟲酰胺田間劑量處理下，MED煙粉虱不能到達(dá)韌皮部取食(Civolanietal., 2014)。在亞致死劑量作用下，溴氰蟲酰胺顯著影響昆蟲體內(nèi)多種酶變化，例如亞致死濃度處理鱗翅目幼蟲甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner和小地老虎AgrotisypsilonRottemberg，其羧酸酯酶(CarE)先被誘導(dǎo)升高、后被抑制降低，多功能氧化酶(MFOs)活性則受到抑制(余慧靈等，2015；何發(fā)林等，2019)。半翅目昆蟲灰飛虱在溴氰蟲酰胺亞致死劑量(LD10和LD30)處理下，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)被極顯著誘導(dǎo)升高(張凱倫等，2020)。據(jù)此推測在溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理下，雖然不會(huì)導(dǎo)致昆蟲立刻死亡，但是肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)損傷、酶類失調(diào)、影響能量代謝減弱等均是昆蟲多種行為受損的原因。本研究溴氰蟲酰胺對MED煙粉虱的亞致死效應(yīng)，與前人研究溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC30)處理煙草，可顯著減弱桃蚜韌皮部取食行為的作用效果一致(Zengetal., 2016)，為溴氰蟲酰胺對昆蟲行為的亞致死效應(yīng)又增添一個(gè)例證，但其生理生化及分子機(jī)理研究尚需進(jìn)一步深入。

前人研究表明，溴氰蟲酰胺在田間劑量作用下可效控制TYLCV(Caballeroetal., 2015)；本研究表明溴氰蟲酰胺亞致死濃度(LC15)處理仍極大降低了煙粉虱的傳毒效率(圖3)，這與氟吡呋喃酮對MED煙粉虱傳播TYLCV效率影響結(jié)果一致(Liuetal., 2021)。顯然，溴氰蟲酰胺同氟吡呋喃酮一樣，在殘效期間也對TYLCV具有較好的控制潛力，為殺蟲劑交替使用、適當(dāng)延長用藥間隔等減量增效技術(shù)研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。本研究還存在一些不足之處，檢測煙粉虱侵染植物后傳毒效率的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該更多一些，并且需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)以驗(yàn)證溴氰蟲酰胺對本地TYLCV的控制效果。溴氰蟲酰胺作為木質(zhì)部系統(tǒng)活性成分殺蟲劑，如何影響取食韌皮部昆蟲刺吸式口器昆蟲行為，是今后一個(gè)有趣的研究方向。此外，還需對更多種類型的殺蟲劑抑制煙粉虱傳毒行為及傳毒效果進(jìn)行研究，并且研究殺蟲劑與提高植物免疫措施相結(jié)合的實(shí)用方法，以期形成以植物免疫激活為內(nèi)御，以殺蟲劑阻斷傳毒媒介為外阻的“內(nèi)御外阻”綜合防控方案，為有效解決煙粉虱及其傳播的雙生病毒病這一對外來入侵病蟲組合防治難題提供幫助。