劉國霞，李嬌嬌，張安盛*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，濟南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，濟南 250100)

近年來番茄褪綠病毒病(Tomatochlorosisvirus，ToCV)在番茄Lycopersiconesculentum產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，成為繼番茄黃化曲葉病毒病之外又一嚴重病害。發(fā)病植株表現(xiàn)葉脈間變黃，葉脈顏色加深，葉片增厚變脆，果實小、顏色偏白，產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響(劉永光等，2014)。番茄褪綠病毒在美國首次報道(Wisleretal.，1998)，隨后在歐洲(Accottoetal.，2001；Dovasetal.，2002)、地中海地區(qū)(Segevetal.，2004)以及我國臺灣地區(qū)(Tsaietal.，2004)相繼發(fā)現(xiàn)。我國最早于2012年在北京檢測到ToCV(Zhaoetal.，2013)，隨后在山東(Zhaoetal.，2014)、江蘇(Karwithaetal.，2014)等地迅速擴散，而且?guī)Ф韭食士焖僭鲩L趨勢(鄭慧新等，2016)，給番茄生產(chǎn)帶來巨大威脅。

煙粉虱Bemisiatabaci屬半翅目Hemiptera、粉虱科Aleyrodidae，是番茄褪綠病毒重要傳毒介體，研究表明Q型煙粉虱對ToCV的傳播擴散具有重要作用(Shietal.，2018)。病毒對媒介昆蟲的生物學和生理指標可能產(chǎn)生有利、中性或有害的影響(Stoutetal., 2006)，如攜帶番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)的B型煙粉虱存活率、產(chǎn)卵量、成蟲壽命和體長明顯降低或縮短，而攜帶該病毒的Q型煙粉虱相應指標未受影響，說明TYLCV對B型煙粉虱具有不利影響，而對Q型煙粉虱影響偏中性(Panetal., 2013)。研究發(fā)現(xiàn)在攜帶ToCV的番茄上取食的Q型煙粉虱產(chǎn)卵量增加，發(fā)育歷期縮短，存活率和壽命未受影響，而且?guī)Ф綫型煙粉虱更喜好取食健康番茄，有助于病毒擴增(Shietal.，2018)。而Li等(2018)研究結(jié)果顯示Q型煙粉虱在攜帶ToCV的番茄上取食，其產(chǎn)卵量、雌蟲壽命和產(chǎn)卵期顯著下降，而發(fā)育歷期增加(Lietal., 2018)。內(nèi)共生菌組成對Q型煙粉虱傳播ToCV也有重要影響(Belloetal., 2019)。

解毒酶和保護酶是昆蟲體內(nèi)重要的兩類酶系，對于抗逆和生理適應具有重要作用，是昆蟲生理適應性的重要指標(Lozinskayaetal., 2004)。煙粉虱取食感染TYLCV的番茄導致體內(nèi)三大保護酶系過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性持續(xù)升高，解毒酶羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性先提高后下降，保護酶、解毒酶活性的變化對于煙粉虱在帶毒番茄上的適應性有重要作用(曹增等，2015)。本文對攜帶ToCV的Q型煙粉虱在非病毒寄主植物棉花上的發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、成蟲壽命和體長進行研究，并測定了帶毒和無毒煙粉虱主要保護酶和解毒酶生物活性，以期明確ToCV對煙粉虱種群擴張的影響，為了解ToCV傳播擴散的流行病學機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與植物

供試蟲源：無毒煙粉虱采自山東省農(nóng)科院植保所實驗農(nóng)場棉花植株，接到日光溫室中健康番茄(奔六)苗上，在溫度26℃±1℃，相對濕度60%±5%，光周期L∶D=16 h∶8 h的條件下飼養(yǎng)。煙粉虱經(jīng)以mtCOI為基礎的CAPS方法鑒定為Q型(劉國霞等，2014)。

供試毒源：病毒植株采自壽光市稻田鎮(zhèn)西稻田村日光溫室，將病毒植株移栽到山東省農(nóng)科院植保所日光溫室盆栽種植，接入Q型煙粉虱成蟲，定期添加番茄帶毒植株和健康番茄苗，同時移出衰老死亡番茄植株，保證番茄植株持續(xù)帶毒。經(jīng)PCR檢測煙粉虱帶毒率超過90%。

供試植物：取5～7葉期棉花(魯棉研37)用于生物學實驗。

1.2 煙粉虱攜帶ToCV病毒檢測

采集被ToCV感染的番茄植株上煙粉虱成蟲及初羽化成蟲各10頭，參照李嬌嬌等(2018)單頭蟲體采用Trizol方法提取RNA，利用RT-PCR檢測煙粉虱攜帶ToCV情況。煙粉虱在棉花上產(chǎn)卵24 h后，收集蟲體利用同樣方法提取RNA，檢測煙粉虱帶毒情況。

1.3 ToCV對煙粉虱生物學指標的影響

1.3.1發(fā)育歷期和后代體長的測定

用內(nèi)徑2 cm、高0.5 cm的有機玻璃管和120目防蟲網(wǎng)自制微蟲籠，取10對帶毒和無毒煙粉虱分別置于微蟲籠中，固定在棉花(6～7葉期)葉片背面，放于人工氣候箱中(溫度26℃，相對濕度60%，光周期L∶D=14 h∶10 h)，24 h后除去煙粉虱和微蟲籠，在葉片上做好標記，解剖鏡(Nikon, C-DSS230)下統(tǒng)計產(chǎn)卵數(shù)量。每天檢查由卵發(fā)育到1齡、2齡、3齡、4齡和成蟲的數(shù)量(羅晨等，2006)。初羽化成蟲在解剖鏡下區(qū)分雌雄，用測微尺測量蟲體體長。實驗設10個重復。

1.3.2產(chǎn)卵量和成蟲壽命

取帶毒和無毒煙粉虱初羽化成蟲1對，分別接于1%瓊脂保濕的棉花葉片的玻璃管中，倒置放于人工氣候箱中(溫度26℃，相對濕度60%，光周期L∶D=14 h∶10 h)，每3 d記錄產(chǎn)卵量，成蟲轉(zhuǎn)移至新葉片。每天觀察成蟲存活情況，若雄蟲死亡則補充，直至雌蟲死亡。重復30次。

1.4 ToCV對煙粉虱重要保護酶和解毒酶活力的影響

1.4.1煙粉虱體內(nèi)保護酶活力測定

分別取100頭帶毒和無毒煙粉虱雌蟲，加500 μL生理鹽水冰浴勻漿，8 000 rpm離心20 min取上清液備用。采用考馬斯亮藍G250法測定酶源樣品的蛋白含量。

采用過氧化物酶(POD)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒和過氧化氫酶(CAT)測試盒(均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn))按照試劑盒操作要求測定帶毒煙粉虱和無毒煙粉虱體內(nèi)POD、SOD和CAT活力?；钚詥挝痪捎迷噭┖幸?guī)定的單位每毫克蛋白(U/mgprot)。每個處理重復3次。

1.4.2煙粉虱體內(nèi)解毒酶活力測定

分別取100頭帶毒和無毒煙粉虱雌蟲，按照羧酸酯酶(CarE)測試劑盒要求制備樣品，用于測定谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)測試盒和乙酰膽堿酯酶(AChE)的樣品制備方法同1.3.1。按試劑盒(均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn))說明書測定帶毒煙粉虱和無毒煙粉虱體內(nèi)CarE、GST和AChE活力?；钚詥挝痪捎迷噭┖幸?guī)定的單位/每克蛋白(U/mgprot)。每個處理重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中獨立樣本t檢驗進行處理間實驗數(shù)據(jù)的差異性分析。重復數(shù)據(jù)計算其平均值和標準差(SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱攜帶ToCV病毒情況

采集生物學實驗中帶毒煙粉虱同一片葉子上的煙粉虱成蟲，檢測帶毒率發(fā)現(xiàn)，除1頭雌成蟲未擴增到特異條帶外，其余7頭雌蟲和1頭雄蟲均能擴增到ToCV病毒特異條帶(圖1-A)，帶毒率為88.89%，說明帶毒煙粉虱可用于隨后的生物學實驗和酶活性分析。帶毒煙粉虱在棉花上取食產(chǎn)卵24 h后，取24頭煙粉虱檢測帶毒情況，發(fā)現(xiàn)有62.5%的煙粉虱攜帶ToCV(圖1-B)。說明煙粉虱在棉花上取食24 h期間，大部分依然帶毒。

在ToCV感染的番茄上，初羽化煙粉虱7頭雌蟲和3頭雄蟲均擴增到ToCV病毒特異條帶(圖1-A)，1頭雄蟲擴增帶較弱，說明初羽化成蟲攜帶病毒率為100%。說明在ToCV感染的番茄上初羽化煙粉虱可用于測定產(chǎn)率量和雌蟲壽命試驗。

圖1 煙粉虱攜帶ToCV病毒RT-PCR檢測

在健康番茄上取食的煙粉虱未檢測到ToCV。

2.2 ToCV對煙粉虱生物學指標的影響

帶毒和無毒煙粉虱在棉花上各齡期的發(fā)育歷期見表1。由表1可知，卵和4齡若蟲發(fā)育期最長，為6.35 d左右，其次為1齡，為3.5～3.9 d，卵到成蟲整個發(fā)育歷期為21 d左右。帶毒煙粉虱在1齡若蟲歷期較無毒煙粉虱長，但差異不顯著，其它齡期歷期及整個發(fā)育歷期與無毒煙粉虱相比未表現(xiàn)出差異。

表1 帶毒和無毒煙粉虱的發(fā)育歷期

利用解剖鏡測量了帶毒和無毒煙粉虱在棉花上產(chǎn)卵羽化的后代體長，雌蟲約0.8 mm，雄蟲約0.74 mm。帶毒煙粉虱雌蟲長度比無毒雌蟲短(P<0.05)，雄蟲體長無差異。單雌產(chǎn)卵量約80粒，壽命約18 d，帶毒和無毒煙粉虱在棉花上的單雌產(chǎn)卵量和壽命無明顯差異。

2.3 ToCV對煙粉虱重要解毒酶和保護酶活性的影響

采用考馬斯亮藍蛋白定量方法制定標準曲線，對提取的帶毒和無毒樣品蛋白含量進行測定，樣品濃度在0.25～0.30 mg/mL。

攜帶ToCV的煙粉虱和無毒煙粉虱體內(nèi)保護酶和解毒酶含量見表3。帶毒煙粉虱體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性高于無毒煙粉虱，但差異不顯著(P>0.05)。帶毒煙粉虱過氧化氫酶(CAT)活性是無毒煙粉虱的3.36倍，差異極顯著(P<0.01)。帶毒煙粉虱過氧化物酶(POD)活性降低，差異不顯著。

表2 帶毒和無毒煙粉虱成蟲體長、產(chǎn)卵量和雌蟲壽命

表3 帶毒和無毒煙粉虱體內(nèi)保護酶和解毒酶活力

解毒酶中，帶毒煙粉虱羧酸酯酶(CarE)活力降低，為無毒煙粉虱的54%，差異顯著(P<0.05)。帶毒煙粉虱谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活力帶毒煙粉虱略低于無毒煙粉虱，差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

ToCV是韌皮部限制性病毒，自然條件下只能依靠媒介昆蟲粉虱傳播(王富等，2016)，B型煙粉虱和紋翅粉虱Bemisiastriata傳毒效率較高(Wintermantel and Wisler，2006)。近年來研究發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱也可有效傳播ToCV(李嬌嬌等，2018)，番茄ToCV發(fā)病率隨Q型煙粉虱種群數(shù)量增加和取食時間延長而升高(代惠潔等，2016)。因此推測ToCV的廣泛傳播與Q型煙粉虱的發(fā)生危害有密切關(guān)系。病毒對寄主的影響分為直接影響和間接影響，Li等(2018)研究了ToCV對Q型煙粉虱的間接影響，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱在感染ToCV的番茄上產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵天數(shù)和雌蟲體長顯著降低，認為ToCV侵染對Q型煙粉虱有不利影響，可能跟ToCV侵染促使番茄釋放更多的萜類化合物有關(guān)(Fereresetal., 2016)。本試驗研究了ToCV對Q型煙粉虱的直接影響，發(fā)現(xiàn)在ToCV的非寄主植物棉花上，帶毒煙粉虱在發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、雌蟲壽命方面和無毒煙粉虱無顯著差異，僅后代雌蟲體長明顯短于無毒煙粉虱，說明ToCV對Q型煙粉虱生長發(fā)育和種群增長的直接影響較小。攜帶TYLCV的Q型煙粉虱在非寄主植物棉花上的各項生物學指標影響不大(Panetal., 2013)，跟本研究ToCV對Q型煙粉虱生物學的影響結(jié)果一致。棉花和番茄都是煙粉虱的適宜寄主(張永軍等，2003)，在棉花上帶毒煙粉虱隨著時間延長體內(nèi)ToCV病毒逐漸消失，研究發(fā)現(xiàn)雌蟲最長持毒時間為7 d(Weietal., 2019)，因此在本實驗中煙粉虱生物學參數(shù)基本沒有受到病毒的影響，雌蟲體長的減小可能對于Q型煙粉虱種群增長有一定影響。

保護酶是清除自由基的重要物質(zhì)，SOD、CAT和POD是昆蟲體內(nèi)主要的保護酶系，其中SOD將部分自由基催化成H2O2，CAT和POD可催化分解H2O2成為H2O和O2，從而使細胞內(nèi)自由基維持在低水平，保護機體免受傷害(Krishn and Kodrik，2006)。研究證實保護酶活性跟煙粉虱寄主適應性相關(guān)(周奮啟等，2011)。攜帶ToCV的Q型煙粉虱SOD和POD活性與無毒煙粉虱無顯著差異，CAT活性是對照的3.36倍，差異達到極顯著水平，說明取食ToCV侵染的番茄使機體產(chǎn)生了大量的H2O2，Q型煙粉虱通過提高CAT活性而提高分解H2O2的能力，從而保護機體免受自由基毒害。本研究結(jié)果與曹增等(2015)、陳晨等(2016)研究結(jié)果一致，B型煙粉虱在TYLCV感病番茄上取食3種保護酶(SOD、CAT和POD)活性持續(xù)升高，而Q型煙粉虱取食72 h后SOD和POD活性升高，取食30 d后CAT和POD活性比對照顯著升高(曹增等，2015)，白背飛虱Sogatellafurcifera(Horváth)取食南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)后這3種保護酶活性顯著提高(陳晨等，2016)。

CarE是煙粉虱體內(nèi)對殺蟲劑進行解毒代謝的重要解毒酶，田間抗性品系CarE活性明顯高于敏感品系(何玉仙等，2007)。AChE是昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿的分解酶，同時也是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的靶標酶(冷欣夫等，1996)，GST可催化內(nèi)源性谷光甘肽與化學殺蟲劑中具有毒理作用的親電基團結(jié)合而排出體外(周奮啟等，2011)，對于煙粉虱抗性也有重要作用(楊秀清等，2001)。本研究中，帶毒煙粉虱體內(nèi)CarE活性明顯低于無毒煙粉虱，GST和AChE活性也有所降低，但差異不顯著，這跟煙粉虱取食感染TYLCV的番茄和感染TYLCCNV的煙草NicotianatabacumL.后解毒酶活性降低的研究結(jié)果一致(Luanetal., 2013；曹增等，2015)。煙粉虱取食TYLCV侵染的番茄后解毒酶活性被誘導，但30 d后CarE和GST活性降低(曹增等，2015)，推斷煙粉虱可能通過降低解毒酶活性減少能量消耗而增加在寄主植物上的適合度(Luanetal., 2013)。煙粉虱CarE和GST活性隨寄主嗜好性而改變，在嗜好寄主上酶活性降低，在非嗜好寄主上升高，CarE和GST活性在一定程度上可作為煙粉虱對寄主適應性的參考指標(周福才等，2010)，因此本研究中帶毒Q型煙粉虱CarE活性降低說明Q型煙粉虱對ToCV侵染的番茄適應性較好。