劉振國，宋紅玉，郗學鵬，姚玉風，胥保華

(山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018)

昆蟲種類繁多、形態(tài)各異，是地球上數(shù)量最多的動物群體，而受精囊的出現(xiàn)在昆蟲進化中是“質(zhì)的飛躍”。受精囊是由雌性昆蟲外胚層發(fā)育而來，不同昆蟲的受精囊在數(shù)量、形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異(Pascini and Martins, 2017)。已有研究報道表明，受精囊及其附屬腺體結(jié)構(gòu)已在直翅目中國寬翅曲背蝗Pararcypteramicropterameridionalis(Keetal., 2016)、半翅目地長蝽科Rhyparochromidae(王俊茹, 2016)、鱗翅目螟蛾科香梨優(yōu)斑螟EuzopherapyriellaYang(阿依古麗·買買提等, 2019)，雙翅目蠓科Ceratopogonidae(蔣曉紅等, 2018)、大蚊科Tipulidae(趙晴等, 2019)、果蠅科Drosophilidae(Mayhew and Merritt, 2013)，網(wǎng)翅目白蟻科Termitidae(Khan, 2019)，膜翅目蟻科Formicidae(Wheeler and Krutzsch, 1994)、金小蜂科Pteromalidae(劉霞和吳偉堅, 2018)、蜜蜂科Apidae(吳黎明等, 2007)等多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)，在維持精子可育性方面發(fā)揮作用(何建平和奚耕思, 2003)。

蜜蜂是重要的傳粉昆蟲，被譽為“農(nóng)業(yè)之翼”。意大利蜂Apismelliferaligustica在全世界范圍內(nèi)分布廣泛，其蜂王每年約產(chǎn)20萬個受精卵，并且能夠保持這樣的產(chǎn)卵力達2～4年，因此需要大量的精子參與受精(Winston, 1991)。健康的蜂王是維持蜂群群勢的基礎(chǔ)(Pettisetal., 2016)，而受精囊內(nèi)精子的可育性是蜂群發(fā)展的重要保障。通常情況下，蜂王產(chǎn)卵后不再婚飛交尾，蜂王長達數(shù)年的受精卵生產(chǎn)過程中，所需的精子均源于受精囊，而蜂王產(chǎn)卵力下降則會導致蜂群分蜂或者新老更替，因此，受精囊是蜂王維系產(chǎn)卵功能和群內(nèi)地位的重要器官。在存儲過程中，受精囊及附屬腺體分泌物可保持精子在相當長時間內(nèi)保持可育性，貯存時間遠高于雄蜂的壽命(Stürupetal., 2013)。這種特殊的器官構(gòu)造對蜂王有很大的幫助。其作用可歸納為：(1)減少天敵在蜜蜂婚飛中對蜂王的威脅和婚飛的耗能。正常情況下，蜂王在一次婚飛中可與12頭左右的雄蜂依次交尾(Simone-Finstrom and Tarpy, 2018)，可獲得足夠的精子，專心產(chǎn)卵，不必反復尋偶、交尾，而增加暴露在天敵前的風險，耗費時間和精力。(2)蜂王“多雄授精”機制可有效防止近交衰退。(3)蜂王對后代性別比例的控制與受精囊密不可分。有研究發(fā)現(xiàn)，受精囊開口的肌肉受大腦控制，蜂王可以根據(jù)季節(jié)、蜂群狀況和巢房大小對其腹部的反饋來決定產(chǎn)受精卵(雌性、二倍體)還是未受精卵(雄性、單倍體)。

1 蜂王受精囊結(jié)構(gòu)與蜜蜂生殖生理

1.1 蜂王受精囊結(jié)構(gòu)

蜜蜂受精囊呈球形結(jié)構(gòu)，直徑約為1.1 mm，由1層上皮細胞組成的膈膜組成，內(nèi)部低氧環(huán)境(Paynter, 2015)；表面粗糙，外圍包裹著密集的氣管網(wǎng)。受精囊內(nèi)腔中充滿了透明的液體，與1對管狀腺體相連(吳黎明等, 2008)，其結(jié)構(gòu)詳見圖1。

圖1 蜜蜂婚飛(A)、蜂王與雄蜂交配結(jié)構(gòu)(B)及受精囊形態(tài)示意圖(C)(改編Koning, 1994)

1.2 蜜蜂生殖生理

蜂群通常由1頭產(chǎn)卵蜂王、上萬頭雌性工蜂和幾百頭季節(jié)性出現(xiàn)的雄蜂組成(Rangeletal., 2019)。蜜蜂最重要的生殖特征是一雌多雄交配，并且蜂王產(chǎn)卵后，終生不再交配。蜂王交配后將數(shù)百萬個精子貯存于受精囊中長達數(shù)年之久，并仍能保持活力，貯存時間遠高于雄蜂的壽命。

蜜蜂性別受到染色體倍數(shù)控制(Haplodiploid sex determination system)(Charlesworth, 2004)，其生殖方式包括孤雌產(chǎn)雄(Arrhenotokous parthenogenesis)(Heimpel and de Boer, 2008)和卵式生殖兩者，其中雄蜂是由未受精卵發(fā)育而來，它的遺傳信息代表了母群的性狀。傳統(tǒng)蜜蜂飼養(yǎng)觀點認為，雄蜂不采蜜，除了和蜂王交尾以外，基本不參與巢內(nèi)勞作(Galiziaetal., 2012)，但也有研究發(fā)現(xiàn)雄蜂具有刺激工蜂出巢采集行為作用(曾志將, 2020)。養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，雄蜂對食料的消耗量大，還會引起分蜂熱，對生產(chǎn)不利。因此，從經(jīng)濟學的角度來看，培育種用雄蜂的成本較高。蜂群培育雄蜂具有較強的季節(jié)性特征，在蜜粉充足的分蜂季節(jié)，強群會培育數(shù)量較多的雄蜂，其壽命在繁殖季節(jié)約40 d，特殊情況下，越冬雄蜂的壽命也只有8個月左右(葛鳳晨和薛運波, 2002)，這給蜜蜂育種、保種等方面帶來了很大的困難。

交尾后精子在蜂王體貯存內(nèi)過程在前人研究中有詳細描述(吳黎明等, 2008)。進入受精囊后的精子處于靜止還是運動狀態(tài)？Toflski等利用熒光染色技術(shù)研究了蜜蜂受精囊中精子的運動性，發(fā)現(xiàn)在授精后的前8 h精子處于靜止狀態(tài)，隨后在受精囊壁附近呈現(xiàn)圓周運動(Tofilskietal., 2018)。大阪舉腹蟻C.osakensis的精子包裹在精囊中，在交配時轉(zhuǎn)移至交配囊的過程中，精子的活動性受到限制，能有效的阻止氧化呼吸作用產(chǎn)生活性氧(ROS)帶來的損失(Gotoh and Furukawa, 2018)。精子進入受精囊后貯存起來，直到給卵子進行授精(Haberl and Tautz, 1998)。在受精過程中也體現(xiàn)出蜜蜂對于精子的高效利用率(Hunter and Birkhead, 2002)。

2 精子活力影響因素

精子活力是評價精液品質(zhì)和推測蜂王產(chǎn)卵性能的重要指標，可以參考Rzymski等的測定方法(Rzymskietal., 2012)。具體方法是通過流式細胞儀對蜜蜂儲精囊中的精子進行活性檢測，通過SYBR-14、碘化丙啶(Propidium iodide)染色，分別在綠色(FL-1)和紅色(FL-3)熒光通道，通過對比密度點圖區(qū)分有活性和死亡的精子細胞，并計算存活率，有效地測定蜜蜂精子的質(zhì)量。

2.1 溫度

研究發(fā)現(xiàn)，酷熱能損害昆蟲精子活力，而且這種損傷能夠跨代遺傳(Salesetal., 2018)。Bienkowska發(fā)現(xiàn)置于40℃高溫或9～10℃低溫環(huán)境的雄蜂鮮精液中死精子比例高達40%，因此高溫和低溫均會影響精液品質(zhì)，通過人工授精發(fā)現(xiàn)受精囊內(nèi)的死亡精子比例分別為17%(9～10℃低溫環(huán)境)和21%(40℃高溫環(huán)境)(Bienkowskaetal., 2011)。McAfee研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂通過激活受精囊內(nèi)ATP依賴的HSP消除熱應(yīng)激(McAfeeetal., 2020)。

2.2 殺蟲劑

有機磷類、新煙堿類殺蟲劑廣泛使用給蜜蜂健康帶來嚴重威脅。Chaimanee等研究結(jié)果表明，亞致死劑量(0.02 ppm)吡蟲啉處理7 d后雄蜂精子存活率降至50%，而高劑量(100 ppm)的蠅毒磷脅迫下，蜂王受精囊內(nèi)精子存活率下降33%(Chaimaneeetal., 2016)。Gajger發(fā)現(xiàn)噻蟲嗪處理后的蜂王受精囊內(nèi)精子數(shù)量下降20%(Gajgeretal., 2017)。因此，殺蟲劑脅迫會減低蜜蜂繁殖力(Kairoetal., 2016)。在發(fā)育過程中受到新煙堿類殺蟲劑(噻蟲嗪和噻蟲胺)脅迫會影響與蜂王交尾的雄蜂數(shù)量，從而降低了遺傳多樣性(Forfertetal., 2017)。受精囊內(nèi)精子活力在殺蟲劑作用下有所降低，因此可以作為害蟲防治的潛在靶點。

2.3 季節(jié)因素

Tarpy等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，新產(chǎn)卵蜂王存儲的精子活力最高。隨后通過對蜂王受精囊內(nèi)精子活力的檢測發(fā)現(xiàn)，5月份的活力最高，達到90.3%，隨后的5個月份逐月降低，到10月份時降為81.3%(Tarpy and Olivarez, 2014)。這可能與蜜蜂的營養(yǎng)水平受季節(jié)因素的影響(崔學沛等, 2014)。另外，在分蜂季節(jié)，蜂群會培育大量的雄蜂參與交尾，體格健壯的雄蜂有更大的機會通過與處女王交尾將自己的遺傳物質(zhì)保留下來，花粉等飼料為雄蜂發(fā)育提供必要的營養(yǎng)，也影響精液量、精子活力、精子數(shù)量(Rangel and Fisher, 2019)。

2.4 pH和離子環(huán)境

蜂王受精囊中pH值高達到8.6(Paynteretal., 2017)，并有大量Zn2+存在(Weirichetal., 2002)。精子細胞膜上的精子特異性鈣通道CATsper調(diào)節(jié)Ca內(nèi)流使精子超活化(Quilletal., 2001)，從而影響精子運動活性、頂體反應(yīng)及受精能力(Renetal., 2001)。研究發(fā)現(xiàn)，Zn通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)精子運動性；精子細胞內(nèi)Zn濃度受ZIPT-7.1調(diào)節(jié)，后者將胞Zn內(nèi)釋放到細胞質(zhì)中，激發(fā)信號轉(zhuǎn)導通路使精子獲能(Chu, 2018)。硒在消除ROS損傷、維持細胞膜完整性方面發(fā)揮重要作用，額外添加硒(2 μg/mL)能顯著提高精細胞運動性、活性和線粒體膜電位(Ghafarizadehetal., 2017)。精子與透明帶結(jié)合是受精過程的關(guān)鍵步驟，為了揭示微量元素在這一過程的作用，Anchordoquy研究發(fā)現(xiàn)，在體外受精培養(yǎng)基中加入銅(0.4 μg/mL Cu)、錳(5 ng/mL Mn)、硒(100 ng/mL Se)、鋅(0.8 μg/mL Zn)和上述混合物(Cu+Mn+Se+Zn)，與不添加微量元素的對照組相比，Cu、Se和Zn單一添加處理組的精子-透明帶結(jié)合數(shù)量明顯增多，添加Zn 1 h處理組頂體完整率顯著上升，添加Cu或Cu+Mn+Se+Zn處理組的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)顯著上升；添加上述微量元素使精子總抗氧化能力下降(Anchordoquyetal., 2019)。

3 蜂王受精囊微環(huán)境的生理功能

雄蜂精液和受精囊內(nèi)容物共同構(gòu)成了交尾蜂王受精囊的微環(huán)境。Baer等鑒定了蜜蜂精液中57個表達豐度最高的蛋白質(zhì)，包括酶、調(diào)控因子和結(jié)構(gòu)蛋白，起到維持精子活力、抗菌等功能；盡管幾種主要的糖蛋白在精液中被鑒定到，但精子中沒有檢測到任何糖蛋白成分；與果蠅(包括附性腺蛋白)和人類精液蛋白質(zhì)相比，在蜜蜂精液中新發(fā)現(xiàn)了一些蛋白，并且與人類的更為接近，為開展昆蟲精液的比較蛋白質(zhì)組學研究提供可靠數(shù)據(jù)(Baeretal., 2009)。Zareie等(2013)對蜜蜂精子蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，所鑒定出336個蛋白，與人、果蠅共有的蛋白116個，大多數(shù)與酶的調(diào)控或核酸結(jié)合和處理有關(guān)。Baer等從意蜂受精囊液中鑒定出100余種蛋白質(zhì)，其凝膠圖譜與受精囊腺分泌物相似，推斷受精囊腺分泌物是受精囊液中蛋白質(zhì)的主要來源，并以能量代謝和抗氧化相關(guān)酶最為富集(Baeretal., 2009)。

3.1 免疫識別與抗菌活性

雄性昆蟲的精液在多雄交配時可以保護和提高自身精子的生存率。雄性蜜蜂或南美切葉蟻的精液可以在15 min內(nèi)殺死對手50%的精子；而蜂王和南美切葉蟻后同時也會選擇合適的時機分泌出一種液體，保護最強壯的精子不受傷害。表明精液中具有識別“自身”和“非自身”的成分(den Boeretal., 2010)。從蜂王的角度分析，交尾后獲得的精子屬于“非自身”的成分，那蜂王如何能夠使得非自身細胞在其體內(nèi)長期儲存并保持活力，是值得深入探討的科學問題。

Pearcy在螞蟻C.savignyi中發(fā)現(xiàn)：多雄交配中來自同一父本的精子形成精子束(平均73個精子形成一束)，比單雄交配的單個精子游行的速度平均快上兩倍，以盡快在受精囊中占據(jù)一席之地，對其在受精囊中長期存儲并保存實力具有非常大的幫助(Pearcyetal., 2014)。但在蟻后的受精囊中未發(fā)現(xiàn)任何精子束，推測精子束在到達目的地之后散開了。Chapman等通過對果蠅精液貯存機制的研究發(fā)現(xiàn)，來自雄性果蠅附性腺分泌的Acp36DE蛋白在精子轉(zhuǎn)運到受精囊的過程中發(fā)揮著重要作用，另一種蛋白酶抑制劑Acp62F蛋白是維持精子長期保存的“精液防腐劑”(Chapman, 2001)。

蜜蜂、螞蟻等膜翅目昆蟲婚飛交配的特性(過程中)使精子易受到細菌侵染，導致可育性降低，因此受精囊抗菌能力是其長期維持精子可育性的關(guān)鍵。研究表明，螞蟻的附睪和受精囊內(nèi)容物抗菌活性截然不同，前者能促進細菌生長，而后者對細菌生長有強烈的抑制能力，蜂王的免疫系統(tǒng)在交尾過程中增強，但在交尾后抑菌能力顯著下降，由此推測，蜂王交尾時免疫系統(tǒng)快速應(yīng)答有助于將接納的精子進行無菌化處理(Dávilaetal., 2018)。

3.2 能量代謝與抗氧化作用

受精囊內(nèi)環(huán)境氧含量低，存儲精子主要以糖酵解方式進行能量代謝(Paynter, 2015)。研究發(fā)現(xiàn)精液中有精氨酸、賴氨酸和谷氨酸3種重要的氨基酸組分，有利于精子的體外存活和長期保存。

Paynter等(2017)測定了蜜蜂精子能量代謝，發(fā)現(xiàn)磷酸甘油醛(GA3P)是精子存活的關(guān)鍵底物和能量代謝產(chǎn)物。雖然精子在受精囊內(nèi)存儲依賴于無氧能量代謝，但作者也發(fā)現(xiàn)了少量氧氣的存在；相比新獲得的精子，存儲精子中磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)顯著上調(diào)表達，在獲取糖酵解中ATP產(chǎn)生過程中也避免了活性氧(ROS)所致的氧化損傷。作者認為，精子在進入受精囊前進行有氧代謝，從而可以盡快的進入受精囊，而在受精囊中存儲過程時轉(zhuǎn)而進行無氧代謝，以避免氧化損傷，這種能量代謝策略的轉(zhuǎn)變能最大程度地增加自身競爭優(yōu)勢和降低損傷，糖酵解酶(Glycolytic enzyme)、三磷酸肌醇異構(gòu)酶(Trisphosphate isomerase)參與其中；研究發(fā)現(xiàn)高濃度K+、高pH能降低受精囊內(nèi)儲存精子的代謝率(Klenketal., 2004)。

先前有報道稱精子在受精囊內(nèi)轉(zhuǎn)錄沉默，其自身的功能受到限制，依賴于受精囊的能量供應(yīng)和氣體交換，以維持自身活性需要。由此可見，蜂王為精子存活提供了重要的保障(Baeretal., 2009)。精子在受精囊內(nèi)儲存時仍然會進行呼吸作用，抗氧化酶系在降低ROS損失中發(fā)揮作用。除此之外，抗氧化酶在受精囊長期維持精子活性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Weirich等發(fā)現(xiàn)交尾蜂王的受精囊比處女王的受精囊具有更高的過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性(Weirichetal., 2002)，超氧化物歧化酶(SOD)活性在組織間差異不顯著，該結(jié)果在轉(zhuǎn)錄水平上也得到了驗證。Gotoh等(2017)通過對蟻后受精囊轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)與抗氧化酶、蛋白酶相關(guān)基因，通過比較交尾1周和1年的受精囊，發(fā)現(xiàn)前者抗氧化相關(guān)基因表達量高于后者。

酚氧化酶原(prophenoloxidase, proPO)系統(tǒng)是昆蟲天然免疫的主要組成部分，通過產(chǎn)生酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)清除異質(zhì)物，對于受精囊存儲精子帶來極大挑戰(zhàn)。Dávila等在螞蟻除受精囊以外的組織中檢測到PO的存在，推測受精囊的進化適應(yīng)性為儲存精子提供了有利條件(Dávilaetal., 2015)。Collins等(2004)測定了蜜蜂生殖系統(tǒng)中過氧化氫酶(Catalase)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase, GST)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD1)，結(jié)果表明，過氧化氫酶和GST的基因表達量在產(chǎn)卵蜂王受精囊中比處女王高10～20倍，SOD1表達量在兩者中都高表達；雄蜂生殖系統(tǒng)和體組織中三者都高表達，并且性成熟雄蜂比青年雄蜂表達量升高，盡管并不局限于生殖系統(tǒng)，在成熟的雄蜂精液中能檢測到抗氧化酶mRNA，表明抗氧化酶在生殖生理過程中發(fā)揮抗氧化保護作用。

4 總結(jié)與展望

蜂王受精囊維持精子活力和繁殖性能方面取得了顯著的研究進展，也展示出廣闊的應(yīng)用前景。通過對蜂王受精囊構(gòu)造、微環(huán)境(包括pH、離子、抗氧化酶等)、能量代謝系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等生理過程的研究，論述受精囊維持精子可育性的生理基礎(chǔ)，有助于研發(fā)精子保護劑和激活劑，開展蜜蜂精子冷凍保存與復蘇(Wegeneretal., 2014)，促進蜜蜂良種種質(zhì)資源推廣和保護(薛運波, 2016)，與人工授精相結(jié)合，在蜜蜂繁育中發(fā)揮重要作用(Pieplowetal., 2017)，由此延伸出來的單雄受精技術(shù)為基因相關(guān)研究提供了系譜清晰的種群和近交系(Liuetal., 2013)。也為尋找與蜂王產(chǎn)卵量等性狀提供相關(guān)分子標記，長遠看來可用于分子輔助選擇。

多雄受精現(xiàn)象在動物界中廣泛存，其進化意義尚不明確。來自于不同父本的精子在進入受精囊后存在競爭關(guān)系，那么雌性個體各自為了取得生殖效益最大化，在交配后競爭中，受精囊如何對特定父本來源的精子加以保護，或者雄性精液如何在競爭中保護自身精子不被破壞的機制為揭示昆蟲生殖進化提供良好研究素材，為進一步了解生殖生理與性比調(diào)控提供依據(jù)。

受精囊及其附屬腺體結(jié)構(gòu)存在于多種昆蟲中，通過研究受精囊生理功能影響因素，找到新型農(nóng)藥作用靶點，進一步培育敏感型昆蟲品系，從源頭上控制昆蟲的繁殖速率，為有關(guān)害蟲防治領(lǐng)域提供借鑒。