殷先元，蒲宇辰，黃 穎，黃 斌，侯有明*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2.福建省昆蟲(chóng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；4.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000)

黃曲條跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)隸屬于鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是專(zhuān)門(mén)為害十字花科蔬菜的寡食性害蟲(chóng)(Beranetal., 2011)，也是十字花科蔬菜上危害最為嚴(yán)重的世界性害蟲(chóng)之一(Andersenetal., 2006)，在我國(guó)分布范圍廣泛，尤其在我國(guó)廣東和福建兩地危害嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了蔬菜生產(chǎn)(賀華良等, 2012a)。黃曲條跳甲成蟲(chóng)壽命長(zhǎng)，繁殖力強(qiáng)，為害狀嚴(yán)重(賀華良等, 2012b)，并對(duì)多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性難以防治，急需尋找新的替代防治方法(Fengetal., 2000; Yanetal., 2013)。

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Berliner)(簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有高效殺蟲(chóng)活性，廣泛用于防治農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)(Rohetal., 2007)，是重要的生防菌(Groveetal., 2001)。Bt制劑澆淋土壤可以減少黃曲條跳甲產(chǎn)卵量和幼蟲(chóng)數(shù)量，對(duì)成蟲(chóng)的防效可達(dá)67.56%(胡珍娣等，2012)。楊建云等(2013)研究表明Bt工程菌施用后72 h可造成黃曲條跳甲幼蟲(chóng)的校正死亡率為41.67%，并抑制黃曲條跳甲卵的孵化。同時(shí)，研究表明，蘇云金芽胞桿菌能夠影響昆蟲(chóng)成蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育(Yamaguchietal., 2008, 2013; Zhangetal., 2013; Wangetal., 2016)。西方玉米根蟲(chóng)Diabroticavirgifera(LeConte)成蟲(chóng)取食表達(dá)Cry3Bb1蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米葉片后，雄蟲(chóng)的存活率減少，雌蟲(chóng)的體重和產(chǎn)卵量均下降(Meissleetal., 2011)。Qi等(2011)研究表明BtZQ-89菌株對(duì)云斑天牛Batocerahorsfieldi(Hope)成蟲(chóng)的校正死亡率可達(dá)55.33%，同時(shí)使成蟲(chóng)的體重和卵孵化率分別減少2.22%和19.62%。

蘇云金芽胞桿菌是否能直接用于防治黃曲條跳甲成蟲(chóng)？本研究基于蘇云金芽胞桿菌HA和HD這兩個(gè)菌株，其中蘇云金芽胞桿菌HA對(duì)紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus(Olivier)2齡幼蟲(chóng)具有較好的殺蟲(chóng)活性(Puetal., 2017)，而蘇云金芽胞桿菌HD對(duì)黃曲條跳甲幼蟲(chóng)也表現(xiàn)出殺蟲(chóng)活性(吉亮等, 2016)。本文通過(guò)測(cè)定蘇云金芽胞桿菌HA和HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的毒力，分析不同Bt菌株對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響，并利用透射電鏡觀察對(duì)比HA和HD對(duì)黃曲條跳甲中腸的影響，最終綜合判斷HA和HD兩株蘇云金芽胞桿菌用于防治黃曲條跳甲成蟲(chóng)的價(jià)值，并分析其在黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：蘇云金芽胞桿菌HA和HD(記為菌株Bt-HA和Bt-HD)，來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫明教授課題組。

供試蔬菜：上海青(福州金銘種業(yè)有限公司)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化種植，整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)不噴施任何殺蟲(chóng)劑。

供試?yán)ハx(chóng)：黃曲條跳甲成蟲(chóng)分別于采集于福建省建甌市西大街外的菜地。經(jīng)室內(nèi)用上海青飼喂48 h后備用。

供試藥劑：Bradford法蛋白定量試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1毒力測(cè)定

分別用含0.1%吐溫-80的無(wú)菌水將Bt-HA粉劑稀釋成1.51×108、3.03×108、6.05×108、1.21×109、2.42×109CFU/mL，Bt-HD粉劑稀釋成7.46×107、1.49×108、2.99×108、5.97×108、1.19×109CFU/mL 5種等比濃度。以含0.1%吐溫-80的無(wú)菌水溶液為空白對(duì)照組。以新鮮洗凈的上海青葉片，剪成正方形(3×3 cm)，將葉片分別浸漬于Bt-HA、Bt-HD菌懸液和對(duì)照組溶液中，25 min后取出葉片，在濾紙上自然晾干。將葉片放入墊有濕潤(rùn)濾紙的塑料培養(yǎng)皿中(D=70 mm)，每皿放入5片葉片，罩上塑料瓶。在溫度28℃±1℃，相對(duì)濕度75%±5%,光周期L∶D=14∶10的環(huán)境條件下，接入饑餓處理24 h的黃曲條跳甲成蟲(chóng)約30頭，每2 d更換一次葉片，連續(xù)喂毒14 d，每天檢查成蟲(chóng)的死亡數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)4次。采用Abbott公式計(jì)算校正死亡率(Abbott, 1987)。

1.2.2GST酶活性測(cè)定

試蟲(chóng)準(zhǔn)備：同1.2.1。設(shè)Bt-HA、Bt-HD和空白對(duì)照3個(gè)處理，Bt-HA和Bt-HD菌懸液濃度為4.01×108CFU/mL，黃曲條跳甲成蟲(chóng)饑餓處理24 h后接入，每天更換對(duì)應(yīng)處理的葉片，每一處理分別于接蟲(chóng)后1、4、7和14 d取30頭黃曲條跳甲成蟲(chóng)，共12個(gè)樣。樣本放入-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活性測(cè)定：從-80℃冰箱中取出試蟲(chóng)，每個(gè)樣5頭，裝入1.5 mL EP管中，每管加入 500 μL 0.02 M PBS(pH 7.4)緩沖液，并放入3顆鋯珠進(jìn)行組織研磨(65 Hz，60 s)。研磨后于4℃下10 000 rpm離心10 min，取上清液作為酶源。每個(gè)樣重復(fù)3次，采用Bradford法測(cè)定酶源蛋白含量，GST酶活性測(cè)定按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3中腸組織病理學(xué)觀察

黃曲條跳甲成蟲(chóng)的處理方法同1.2.2。分別于取食葉片4 d和14 d時(shí)取樣，3種處理各取5頭黃曲條跳甲成蟲(chóng)。成蟲(chóng)用冰麻醉后解剖，截取小段中腸，用0.15 M NaCl洗凈后，放入2.5%戊二醛溶液中，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。菌株Bt-HA和Bt-HD毒力與GST酶活性數(shù)據(jù)采用ANOVA分析，Turkey HSD進(jìn)行多重比較；Probit機(jī)率值法計(jì)算致死中濃度LC50和線(xiàn)性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Bt-HA和Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的毒力測(cè)定

Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的毒力強(qiáng)于Bt-HA，LC50分別為1.17×108CFU/mL和4.01×108CFU/mL(表1)。

表1 菌株Bt-HA和Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的致死中濃度

2.2 菌株Bt-HA和Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲GST酶活性影響

在1～14 d內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組體內(nèi)的GST酶活性呈顯著性下降(F3,8=16.652,P=0.001)；Bt-HA處理組的黃曲條跳甲GST酶在第4天時(shí)與對(duì)照組并沒(méi)有顯著差異，第7天活性顯著上升達(dá)到峰值，后顯著性降低(F3,8=6.066,P=0.019)，而B(niǎo)t-HD處理的黃曲條跳甲GST酶在第4天活性達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)(F3,8=2.732,P=0.114)(圖1)。

圖1 不同處理的黃曲條跳甲體內(nèi)GST酶活性的時(shí)間變化動(dòng)態(tài)

同時(shí)，Bt-HD處理組的黃曲條跳甲體內(nèi)GST酶活性始終高于取食菌株Bt-HA處理組和對(duì)照組葉片的黃曲條跳甲體內(nèi)GST酶活性。

2.3 菌株Bt-HA和Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸組織形態(tài)的影響

電鏡觀察結(jié)果表明，取食處理葉片4 d后，Bt-HD處理組的黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸微絨毛開(kāi)始疏松脫落(圖2-C)，對(duì)照組和菌株Bt-HA處理組的中腸微絨毛致密且排列整齊，形態(tài)未見(jiàn)變化(圖2-A和2-B)；取食處理葉片14 d后，菌株Bt-HD處理組的黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸柱狀細(xì)胞的底膜變形脫落(圖3-C)，菌株Bt-HA處理組的中腸微絨毛開(kāi)始腫脹脫落(圖4-B)，但底膜與基質(zhì)結(jié)合緊密且形態(tài)完整(圖3-B)，對(duì)照組中腸底膜和微絨毛形態(tài)完整，未見(jiàn)明顯變化(圖3-A和圖4-A)。這表明Bt-HA和Bt-HD皆能損傷黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸的微絨毛，并且Bt-HD能使中腸的底膜變形脫落，對(duì)中腸的損傷更為明顯。

圖2 取食3種不同處理葉片4 d后黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸微絨毛的形態(tài)變化

圖3 取食3種不同處理葉片14 d后黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸柱狀細(xì)胞底膜的形態(tài)變化

圖4 取食菌株Bt-HA處理的葉片14 d后黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸微絨毛的形態(tài)變化

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蘇云金芽胞桿菌Bt-HA和Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)都具有殺蟲(chóng)活性，且Bt-HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的毒力比Bt-HA強(qiáng)。用Bt-HA或Bt-HD處理黃曲條跳甲成蟲(chóng)時(shí)都會(huì)觸發(fā)黃曲條跳甲的解毒機(jī)制，引起GST酶表達(dá)量上升。昆蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶包括羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等，能夠代謝大量的外源毒素(任羽等, 2016)。小地老虎AgrotisypsilonRottemberg幼蟲(chóng)在遇到相同劑量的BtCry2Ab和Cry1Ac毒蛋白時(shí)，毒性更高的Cry2Ab引起小地老虎幼蟲(chóng)體內(nèi)GST酶活性顯著升高，而Cry1Ac對(duì)GST酶活性的影響不明顯(陸瓊等，2009)，所以昆蟲(chóng)體內(nèi)GST酶活性與底物的毒性相關(guān)。譚樹(shù)乾等(2013)發(fā)現(xiàn)在華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita幼蟲(chóng)中GST酶活性與毒蛋白Cry8Ga1的濃度呈正相關(guān)。本文研究結(jié)果表明，毒性更高的Bt-HD會(huì)引起黃曲條跳甲強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，體內(nèi)GST酶活性顯著上升，并且高于Bt-HA處理組。

昆蟲(chóng)攝取Bt毒蛋白后，Bt毒蛋白與中腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，進(jìn)而穿孔，引起細(xì)胞滲透壓改變，導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡(Vachonetal., 2012)。在組織病理學(xué)上表現(xiàn)為Bt毒蛋白造成昆蟲(chóng)中腸微絨毛的腫脹脫落、中腸上皮細(xì)胞的腫脹和空泡化、腸腔空泡化、細(xì)胞內(nèi)容物外泄等(Endo and Nishiitsutsuji-Uwo, 1980; 李芳芳等, 2007; Bowlingetal., 2017)。本研究表明，蘇云金芽胞桿菌對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)造成毒性的機(jī)制之一是Bt毒蛋白會(huì)對(duì)其中腸的組織形態(tài)造成損傷。蘇云金芽胞桿菌Bt-HA和Bt-HD皆能造成黃曲條跳甲成蟲(chóng)中腸微絨毛脫落，其中Bt-HD作用速度更快并能使中腸柱狀細(xì)胞底膜變形脫落，這與Bt-HD毒性更強(qiáng)相一致。

綜上所述，蘇云金芽胞桿菌HD具有用于田間防治黃曲條跳甲成蟲(chóng)的應(yīng)用前景，有關(guān)蘇云金芽胞桿菌HD對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用機(jī)理還需進(jìn)一步探索。