張麗娜，鄧炎春，侯春生*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

隨著國際貿(mào)易日益頻繁與種蜂王的交換，蜜蜂感染病原的種類不斷增加，新發(fā)或再發(fā)性病害嚴(yán)重影響蜜蜂的健康。其中，蜂箱奇露尾甲Aethinatumida(鞘翅目：露尾甲科)是一種新的入侵性害蟲，能導(dǎo)致蜜蜂群勢下降，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)蜂以及野生蜂種群均構(gòu)成嚴(yán)重的生存威脅(Neumannetal., 2016)。蜂箱奇露尾甲最早在南非被發(fā)現(xiàn)，目前已擴(kuò)散到北美洲、歐洲和亞洲(Neumannetal., 2016)。2017年在我國首次發(fā)現(xiàn)蜂箱奇露尾甲入侵我國蜂群，并造成嚴(yán)重的影響，不僅危害蜂群個(gè)體與蜂產(chǎn)品(趙紅霞等, 2018)，而且攜帶了多種蜜蜂病毒，包括蜜蜂殘翅病毒(Deformedwingvirus, DWV)(趙紅霞等, 2019)。

DWV是危害全球蜜蜂種群發(fā)展最重要的病毒之一，為正義單鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒Picornaviruses家族的傳染性軟腐病毒科Iflaviridae。DWV主要的結(jié)構(gòu)蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種蛋白組成；非結(jié)構(gòu)蛋白包括解旋酶、3C-蛋白酶(3C-pro)和RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)(Berényietal., 2007)。目前已經(jīng)確定了三種主要的病毒毒株類型：A型(Eugeneetal., 2014)、B型(Julietteetal., 2004)和C型(Mordecaietal., 2016)。

為明確我國中蜂群寄生的蜂箱奇露尾甲是否攜帶DWV及其進(jìn)化關(guān)系，本文以同一蜂場不同蜂群的中華蜜蜂Apiscerana和蜂箱奇露尾甲Aethinatumida為樣本，通過RT-RCR技術(shù)對(duì)蜜蜂常見病毒進(jìn)行檢測。由于只檢測到了DWV-A，本文將就DWV-A作進(jìn)一步分析。同時(shí)對(duì)DWV-A的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)dRp、Lp基因分別進(jìn)行擴(kuò)增與測序，探討DWV-A在同一蜂群同時(shí)感染蜂箱奇露尾甲和中蜂時(shí)的差異與進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

實(shí)驗(yàn)所用中華蜜蜂和蜂箱奇露尾甲采集于2019年12月5日，采樣地點(diǎn)位于四川省普威鎮(zhèn)龍?zhí)洞宸鋱觯诜鋱鲋须S機(jī)選擇3個(gè)蜂箱進(jìn)行采樣，其中一號(hào)和三號(hào)蜂箱蜜蜂和蜂箱奇露尾甲均可采集到，二號(hào)蜂箱僅采集到蜜蜂，未采集到蜂箱奇露尾甲。一號(hào)、二號(hào)和三號(hào)蜂箱分別采集蜜蜂50頭、一號(hào)和三號(hào)蜂箱分別采集蜂箱奇露尾甲15頭。將采集的蜜蜂和蜂箱奇露尾甲分別置于密封袋內(nèi)帶回，液氮速凍后置于-80℃冰箱長期保存直至用于檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Goscript reverse transcription system購自普洛麥格公司(Promega, Madison, WI, USA)，聚合酶2×Es Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技公司(CW Biotech)，DNA純化回收試劑盒購自全式金公司(TransGen Biotech)，DNA maker(DL-2029)購于北京美德華生檢測技術(shù)有限公司，測序及引物合成在上海生工(Sangon, Shanghai)完成，其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

分別取5～7頭蜜蜂和3頭蜂箱奇露尾甲于研缽中加液氮研磨成粉末后取約0.05 g加入含1 mL Trizol溶液的1.5 mL離心管中提取總RNA，所得總RNA用微量核酸蛋白測定儀測定A268/280比值在2.0以上后濃度定量到100 μg/μL，取2 μL用Goscript reverse transcription system反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，所有實(shí)驗(yàn)步驟均按說明書要求進(jìn)行操作。

1.4 RT-PCR檢測

反轉(zhuǎn)錄所得cDNA取2 μL作為模板進(jìn)行PCR鑒定以確定其是否感染，所用引物序列及擴(kuò)增條件分別見表1和表2。

表1 檢測DWV-A、B和C型的引物

表2 PCR擴(kuò)增條件

1.5 核苷酸測序與分析

所得cDNA取2 μL作為模板使用高保真酶進(jìn)行PCR，所用引物序列及擴(kuò)增條件分別見表3和表4，將其送生工測序，將獲得的序列結(jié)果使用NCBI(National Centre for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)與GenBank中的序列進(jìn)行比較分析。

表3 擴(kuò)增Lp、RdRp和VP3片段的引物

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

選擇中華蜜蜂以及其他物種的DWV基因核苷酸序列使用MEGA7.0與ClustalW構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以Tamura-Nei模型(Tamura and Nei, 1993)為基礎(chǔ)，采用最大似然法(Maximum Likelihood)對(duì)其演化過程進(jìn)行推斷，利用最大復(fù)合似然法(Maximum Composite Likelihood, MCL)估計(jì)的兩兩距離矩陣，通過鄰域連接和BioNJ算法自動(dòng)獲得啟發(fā)式搜索的初始樹，然后選擇具有較優(yōu)對(duì)數(shù)似然值的拓?fù)?，分析涉?0多個(gè)核苷酸序列，選擇的序列及其具體信息如表5所示，所有包含空白和缺失數(shù)據(jù)的位置都被消除(Kumaretal., 2016)。通過對(duì)蜂箱奇露尾甲和中華蜜蜂DWV RdRp、Lp和VP3的克隆與測序，共獲得了6條基因序列并提交到NCBI，分別命名為Aethinatumida-RdRp(MT885269)，Aethinatumida-Lp(MT890634)，Aethinatumida-VP3(MT899248)，Apiscerana-RdRp(MT885270)，Apiscerana-Lp(MT890635)，Apiscerana-VP3(MT899249)。

表5 本研究中使用的DWV序列

2 結(jié)果與分析

2.1 DWV陽性率及感染情況

利用RT-PCR檢測分別檢測中華蜜蜂樣品3份，蜂箱奇露尾甲樣品2份，結(jié)果見圖1。其中1份中華蜜蜂樣品中檢測到DWV-A，中華蜜蜂樣品陽性檢測率為33.3%；2份蜂箱奇露尾甲樣品中均檢測到DWV-A，蜂箱奇露尾甲樣品陽性檢測率為100%。中華蜜蜂檢測出感染DW-A的蜂群是未采集到蜂箱奇露尾甲的二號(hào)蜂群，同時(shí)采集到蜜蜂和蜂箱奇露尾甲的一號(hào)和三號(hào)蜂群中，檢測到蜂箱奇露尾甲感染DWV-A，在中華蜜蜂中未檢測到。

圖1 DWV檢測膠圖

2.2 DWV系統(tǒng)發(fā)育樹分析

不同基因片段的進(jìn)化分析所得到的親緣關(guān)系與進(jìn)化特點(diǎn)是不同的?；赗dRp和Lp兩個(gè)基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖2)表明，來源于蜂箱奇露尾甲和中華蜜蜂的DWV親緣關(guān)系高達(dá)96%，均與胡蜂攜帶的DWV關(guān)系最為密切。而基于VP3基因的核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化表明來源于蜂箱奇露尾甲和中華蜜蜂的DWV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，它們分別與無刺蜂和狄斯瓦螨的DWV株更為緊密。

圖2 對(duì)來源于不同寄主的DWV分離株進(jìn)化分析

3 結(jié)論與討論

本研究采用四川同一蜂場不同蜂群的中華蜜蜂和蜂箱奇露尾甲作為樣本，利用RT-RCR檢測其是否感染DWV，結(jié)果表明中華蜜蜂和蜂箱奇露尾甲均感染DWV-A，其中中華蜜蜂樣品陽性檢測率為33.3%，蜂箱奇露尾甲樣品陽性檢測率為100%。由于本研究的樣本量有限，該感染率并不能代表整個(gè)蜂群的感染情況。

DWV在全球的蜂群及寄生螨-狄斯瓦螨中具有較高的流行率。為了更深入理解DWV在不同寄主的傳播與進(jìn)化特點(diǎn)，本研究對(duì)DWV-A毒株的結(jié)構(gòu)蛋白VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)dRp和L-protein進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明不同基因的序列進(jìn)化樹之間有聯(lián)系也有區(qū)別：RdRp和L-protein在進(jìn)化上與寄主并無太大關(guān)系，而VP3片段體現(xiàn)較強(qiáng)的寄主差異性。RdRp對(duì)于病毒基因組的復(fù)制以及表觀遺傳控制和細(xì)胞基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄是必不可少的(Ngetal., 2008)，它在病毒進(jìn)化中具有高度保守性(Elena and Sanjuan, 2005)，病毒種群中該區(qū)域突變率的提高可以使宿主根據(jù)防御機(jī)制和其它環(huán)境因素選擇性突變(Crottyetal., 2001)。根據(jù)本研究的RdRp系統(tǒng)發(fā)育分析，感染蜂箱奇露尾甲的DWV并沒有形成獨(dú)立的分支。基于Lp的進(jìn)化結(jié)果與RdRp的相類似，這表明，DWV可能并不依賴于寄主的變化而變化。但是基于VP3基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明中蜂和蜂箱奇露尾甲的分支并不在同一簇，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其結(jié)果顯示來源于蜂箱奇露尾甲的DWV與狄斯瓦螨的更接近；來源于中蜂的DWV與其它已報(bào)道的感染中蜂的DWV更相近。由此推斷，蜂箱奇露尾甲的DWV可能來源于狄斯瓦螨，而不是蜜蜂，是否具有較強(qiáng)的致病性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，表明DWV的VP3可能對(duì)病毒宿主的選擇具有重要的作用，以便更好地適應(yīng)宿主環(huán)境。這些推斷，仍需對(duì)這3個(gè)基因的全長作進(jìn)一步分析才能確定，因?yàn)楸狙芯恐贿x擇了VP3，L-protein，RdRp 3個(gè)基因的部分片段進(jìn)行的進(jìn)化分析，可能會(huì)導(dǎo)致信息不全面。

DWV在中國以至全球范圍內(nèi)都是非常常見的蜜蜂病毒，且受狄斯瓦螨的影響較大(Wilfertetal., 2016)。在本次檢測中DWV-B和DWV-C基因型均未出現(xiàn)，可能是本研究選擇的樣本量較少。也有可能是該蜂場并未感染DWV-B和DWV-C，因?yàn)橹腥A蜜蜂本身感染螨的機(jī)率小，即使感染了通過自身的清理行為能有效的清除，使狄斯瓦螨對(duì)中蜂并不構(gòu)成威脅。本研究雖然在蜂箱奇露尾甲中鑒定到DWV，并發(fā)現(xiàn)VP3片段在該寄生與中蜂上進(jìn)化差異，但是VP3的精準(zhǔn)致病作用及其特點(diǎn)仍需進(jìn)一步證實(shí)。另外，感染DWV后的蜂箱奇露尾甲是否對(duì)中蜂有更大的危害也需進(jìn)一步鑒定，因?yàn)樾氯肭中晕锓N對(duì)本地物種的生態(tài)及病原傳播都可能產(chǎn)生重要的影響(趙紫華等, 2019)。