喬風(fēng)嬌，邢龍生，李長(zhǎng)友，鄭桂玲，張 彬*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中澳農(nóng)業(yè)與環(huán)境健康聯(lián)合研究院，山東青島 266109；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)基因數(shù)據(jù)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院(深圳)農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120)

甜菜夜蛾Spodopteraexigua屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，可危害多種農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(Behmer, 2009)。二十世紀(jì)八十年代以前，該蟲在中國(guó)僅是一種偶發(fā)性害蟲，很少造成危害。自1986年以來(lái)，甜菜夜蛾在我國(guó)爆發(fā)成災(zāi)的報(bào)道頻發(fā)，目前已遍布全國(guó)大部分地區(qū)(文禮章等，2014)。多年來(lái)，一些地區(qū)不合理的農(nóng)藥施用致使甜菜夜蛾的抗性水平逐年提升，不但增加了防治成本，而且對(duì)環(huán)境造成了污染和破壞。國(guó)家倡導(dǎo)的農(nóng)業(yè)“雙減”政策和“綠色防控”措施對(duì)我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)和食品安全具有重要的戰(zhàn)略意義，其中以甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodopteraexiguamultiplenucleopolyhedrovirus, SeMNPV)為代表的生物防治在甜菜夜蛾的防治中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)降低了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染(Chenetal., 2019)。

SeMNPV對(duì)甜菜夜蛾的防治效果會(huì)受到多種外部因素的影響。除了溫濕度、光照等環(huán)境因素之外，昆蟲自身的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)也是重要的影響因素。研究表明，營(yíng)養(yǎng)是影響昆蟲自身免疫力的重要因素之一(Simpson and Raubenheimer, 2001; Leeetal., 2005)。特別是蛋白質(zhì)和碳水化合物的攝入對(duì)很多昆蟲的生理表現(xiàn)具有至關(guān)重要的作用，并且對(duì)昆蟲的新陳代謝及種群增長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響(Efeyanetal., 2015)。另有研究表明，蛋白質(zhì)是影響昆蟲對(duì)病原微生物敏感性的關(guān)鍵成分(Alauxetal., 2010)。在非選擇性實(shí)驗(yàn)中，感染后存活下來(lái)的蟲體比對(duì)照組和感染后死亡的蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量更高，表明幼蟲感染致死劑量的細(xì)菌后將會(huì)增加蛋白質(zhì)的攝入量(Leeetal., 2005; Poveyetal., 2009)。此外，通過自主選擇營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以顯著提高宿主昆蟲對(duì)于病原微生物的抵抗力(Raubenheimer and Simpson, 2009)。糖類作為昆蟲的主要能源物質(zhì)，不僅為昆蟲生命活動(dòng)提供了主要能量來(lái)源，也為昆蟲幾丁質(zhì)的合成和脂類的轉(zhuǎn)化提供原料和前體物質(zhì)(王延年，1984)。研究表明，只給岡比亞按蚊Anophelesgambiae喂食含糖量較低的血液時(shí)會(huì)顯著降低其黑化免疫反應(yīng)能力(Koellaetal., 2002; Schwartzetal., 2002)。

綜上所述，不同營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)對(duì)于昆蟲抵御病原物侵染的能力具有重要影響，而且病原物侵染后的宿主昆蟲的取食偏好性也會(huì)發(fā)生較大變化。不同地區(qū)的甜菜夜蛾田間種群營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)存在較大差異，不同營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的甜菜夜蛾對(duì)于核多角體病毒的敏感性存在明顯差異。研究表明，取食不同寄主的甜菜夜蛾在感染病毒后血淋巴中病毒增殖和血淋巴黑化率具明顯差異，說明了飼料影響宿主的黑化反應(yīng)從而導(dǎo)致病毒增殖量的不同(王金彥，2018)。通過觀察取食不同食物的甜菜夜蛾感染病毒后中腸組織的病理變化，表明不同食物對(duì)病毒感染中腸組織的影響存在明顯差異(郭玲等，2018)。然而，食物營(yíng)養(yǎng)影響病毒感染昆蟲體內(nèi)的免疫響應(yīng)機(jī)理尚不清楚，仍待進(jìn)一步研究取證。本研究通過觀察不同營(yíng)養(yǎng)品系甜菜夜蛾幼蟲對(duì)SeMNPV的敏感性，以及染毒前后甜菜夜蛾幼蟲對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)飼料的取食趨性，評(píng)價(jià)不同營(yíng)養(yǎng)條件下甜菜夜蛾應(yīng)對(duì)SeMNPV侵染的敏感性及其取食行為的影響，研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步研究農(nóng)田營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)對(duì)害蟲種群發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試病毒

SeMNPV美國(guó)株(SeMNPV-US1)由美國(guó)康奈爾大學(xué)Wang Ping博士提供。

1.1.2供試?yán)ハx

甜菜夜蛾試驗(yàn)蟲源采自青島市城陽(yáng)區(qū)上馬鎮(zhèn)大蔥田(地理位置120.17°E，41.67°N)。在甜菜夜蛾人工飼料配方的基礎(chǔ)上(肖偉等，2005)，分別建立了高蛋白低糖(簡(jiǎn)稱高蛋白)、中蛋白中糖(簡(jiǎn)稱中蛋白)和低蛋白高糖(簡(jiǎn)稱低蛋白)3個(gè)營(yíng)養(yǎng)品系，并連續(xù)飼養(yǎng)多代作為本研究的供試?yán)ハx。人工飼養(yǎng)條件為溫度28℃±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期為L(zhǎng)14∶D10。

1.1.3供試藥品

酵母粉(賽默飛世爾科技有限公司)，葡萄糖(天津博迪化工有限公司)，瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司)，山梨酸鉀(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，對(duì)羥基苯甲酸甲酯(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，維生素C(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，維生素B(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，肌醇(天津市光夏精細(xì)化工廠)，膽固醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1人工飼料配制

本實(shí)驗(yàn)所用人工飼料配制方法基于前期相關(guān)研究(肖偉等，2005)，通過改變飼料中酵母粉(P)和葡萄糖(C)的比例，設(shè)定配制了3種不同營(yíng)養(yǎng)含量的人工飼料，用于建立3種營(yíng)養(yǎng)品系的甜菜夜蛾：高蛋白(P∶C=7∶1)，中蛋白(P∶C=1∶1)，低蛋白(P∶C=1∶7)(表1)。

表1 不同營(yíng)養(yǎng)飼料配制方法

1.2.2甜菜夜蛾初孵幼蟲敏感性測(cè)定

參照文獻(xiàn)中的生測(cè)方法(Hughesetal., 1986)，在病毒懸液中加入藻藍(lán)食用色素使最終濃度為0.5 mg/mL，測(cè)定甜菜夜蛾初孵幼蟲對(duì)SeMNPV的敏感性。取SeMNPV-US1美國(guó)株多角體病毒，采用10倍梯度稀釋，設(shè)8×102、8×103、8×104、8×105、8×106PIB/mL 5個(gè)處理組，以無(wú)菌水加入等量藻藍(lán)食用色素作對(duì)照；每個(gè)濃度處理設(shè)置3重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭幼蟲。

1.2.3染毒前后甜菜夜蛾幼蟲取食趨性測(cè)定

用中蛋白中糖品系的甜菜夜蛾各齡期幼蟲進(jìn)行6 h饑餓后，分別設(shè)2組處理。一是在觀察盒(直徑6 cm高5.5 cm)內(nèi)，兩側(cè)放置1 cm的高P低C、低P高C正方形飼料塊，觀察取食2種飼料蟲數(shù)；二是將200 μL的8×106PIB/mL病毒懸液與16 g營(yíng)養(yǎng)飼料混勻，得到病毒含量1×105PIB/g的飼料，用此飼料飼喂甜菜夜蛾幼蟲6 h。然后將感染后的幼蟲轉(zhuǎn)入放置了高蛋白和低蛋白飼料的觀察盒內(nèi)，觀察取食2種飼料的蟲數(shù)。每個(gè)齡期處理設(shè)3個(gè)養(yǎng)蟲盒，每盒10頭幼蟲，每天早晚各記錄1次，未染毒與染毒幼蟲趨性測(cè)定分別共進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)品系甜菜夜蛾初孵幼蟲對(duì)SeMNPV的敏感性差異分析

2.1.1SeMNPV對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)品系甜菜夜蛾初孵幼蟲的LC50

為了明確病毒濃度對(duì)于初孵幼蟲死亡率的影響，分別統(tǒng)計(jì)了不同病毒濃度條件下3種營(yíng)養(yǎng)品系幼蟲的累計(jì)校正死亡率。結(jié)果顯示，隨著病毒濃度的升高，3種品系幼蟲的死亡率逐漸增大(圖1)。當(dāng)病毒濃度為8×105PIB/mL時(shí)，高蛋白、中蛋白質(zhì)、低蛋白品系幼蟲的累計(jì)校正死亡率依次為96.29%、79.02%、96.38%。此外，通過計(jì)算得到高蛋白、中蛋白、和低蛋白3種營(yíng)養(yǎng)品系的LC50值依次為1.76×105、2.85×105、2.10×104PIB/mL(表2)。其中，中蛋白品系的LC50顯著高于低蛋白品系(F=7.292，df=2,6，P=0.025<0.05)，高蛋白與中蛋白、低蛋白品系均無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果表明，中蛋白品系對(duì)SeMNPV的敏感性最低。

表2 不同營(yíng)養(yǎng)條件下SeMNPV感染甜菜夜蛾初孵幼蟲的LC50

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)條件下病毒濃度與甜菜夜蛾初孵幼蟲的累計(jì)校正死亡率之間的關(guān)系

2.1.2SeMNPV對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)品系甜菜夜蛾初孵幼蟲的LT50

3種營(yíng)養(yǎng)品系幼蟲第1～9天的累計(jì)校正死亡率隨著感染病毒時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸增大(圖2)。以濃度為8×105PIB/mL的病毒感染甜菜夜蛾幼蟲時(shí)，高蛋白、中蛋白、低蛋白品系幼蟲第9天的累計(jì)校正死亡率分別為96.29%、61.49%、96.42%。此外，通過計(jì)算得到3種營(yíng)養(yǎng)品系的LT50值依次為6.07、6.85、5.20 d(表3)。統(tǒng)計(jì)分析表明，中蛋白品系的LT50顯著高于低蛋白品系(F=8.927，df=2,6，P= 0.016 < 0.05)，高蛋白品系的LT50同中蛋白品系以及低蛋白品系相比均無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果表明，中蛋白品系的甜菜夜蛾幼蟲感染SeMNPV后存活時(shí)間最長(zhǎng)。

圖2 3種營(yíng)養(yǎng)品系甜菜夜蛾幼蟲病毒侵染后的累計(jì)校正死亡率曲線

表3 不同營(yíng)養(yǎng)條件下SeMNPV感染甜菜夜蛾初孵幼蟲的LT50

2.2 甜菜夜蛾幼蟲期取食趨性

2.2.1未感染SeMNPV幼蟲的取食趨性

通過選擇性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未感染病毒的幼蟲在1～3齡幼蟲取食高蛋白飼料顯著多于取食低蛋白飼料的蟲數(shù)(F=0.000，df=40.000，P<0.05)，進(jìn)入3齡末期之后，這種現(xiàn)象發(fā)生了顯著變化，更多的幼蟲偏向于取食低蛋白的飼料(F=0.000，df=28.000，P< 0.05)(圖3)。

圖3 未感染SeMNPV甜菜夜蛾幼蟲對(duì)高蛋白和低蛋白飼料的選擇

2.2.2感染SeMNPV幼蟲的取食趨性

通過選擇性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染病毒之后的1～5齡幼蟲均偏向于高蛋白的飼料。統(tǒng)計(jì)分析顯示，各齡期幼蟲取食高蛋白的飼料蟲數(shù)顯著多于取食低蛋白飼料的蟲數(shù)(F=0.0000，df=70.000，P<0.05)(圖4)。

圖4 感染SeMNPV甜菜夜蛾幼蟲對(duì)高蛋白與低蛋白飼料的選擇

3 結(jié)論與討論

本研究通過比較不同營(yíng)養(yǎng)條件下甜菜夜蛾初孵幼蟲對(duì)核型多角體病毒侵染的敏感性差異，探究不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)昆蟲抵御病原物侵染能力的影響。結(jié)果表明，中蛋白營(yíng)養(yǎng)條件下幼蟲對(duì)SeMNPV表現(xiàn)出較低的敏感性，說明適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)和碳水化合物的比例對(duì)于甜菜夜蛾整個(gè)幼蟲期對(duì)SeMNPV的抵抗力具有積極作用。相關(guān)研究表明，不同種類昆蟲的最佳蛋白質(zhì)和碳水化合物的比例存在差別，而且合適的蛋白質(zhì)和碳水化合物的比例是提高昆蟲免疫力的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，飼料中合適蛋白質(zhì)與碳水化合物的比例有助于甜菜夜蛾抵御病毒侵染，這一發(fā)現(xiàn)得到了前期相關(guān)研究結(jié)果的佐證。例如，東亞飛蝗Locustamigratoria喂食最佳配比的蛋白質(zhì)與碳水化合物飲食后，在較高濃度的單寧酸下，昆蟲的死亡率較低(Simpson and Raubenheimer, 2001)。另外，研究表明蛋白質(zhì)與碳水化合物兩種營(yíng)養(yǎng)素會(huì)極大影響棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)對(duì)于毒素侵染的敏感性。同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲抵御病原物時(shí)自行選擇P∶C飲食比為1.3∶1的食物(Tessnoweetal., 2017)。

通過對(duì)染毒前后的甜菜夜蛾幼蟲對(duì)高P∶C比和低P∶C比兩種人工飼料取食趨性的觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，未染毒情況下，甜菜夜蛾各齡期對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求表現(xiàn)出明顯的齡期間的差異，基本表現(xiàn)為3齡之前偏向于取食高P∶C比的食料，3齡之后則偏向于取食低P∶C比的食料。這與前人報(bào)道一致(Chenetal., 2008)，且符合以甜菜夜蛾為代表的鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲，低齡幼蟲趨向取食蛋白質(zhì)含量較高的植物幼嫩部位，而在高齡幼蟲則可取食植物的成葉和老葉這些碳水化合物含量較高的部位的特征。但是，染毒后的甜菜夜蛾幼蟲的取食偏好發(fā)生了顯著變化。研究結(jié)果顯示，染毒后甜菜夜蛾的低齡和高齡幼蟲，都開始偏向于取食高P∶C比的飼料。前期研究報(bào)道指出，同低P∶C比飼料的甜菜夜蛾幼蟲相比，高P∶C比飲食的甜菜夜蛾幼蟲對(duì)SeMNPV的敏感性顯著更低，表明攝取高蛋白的飼料更有利于增強(qiáng)宿主對(duì)SeMNPV侵染的抵抗力(Leeetal., 2005)。另有研究報(bào)道，蛋白質(zhì)為昆蟲免疫途徑提供了必需的氨基酸，用于合成多種抗菌肽(Grimble, 2001; Schmid and Paul, 2005)，表明當(dāng)昆蟲遭受病毒侵染時(shí)蛋白質(zhì)是生物體調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

綜上所述，本研究結(jié)果明確了營(yíng)養(yǎng)在甜菜夜蛾應(yīng)對(duì)SeMNPV侵染過程中的重要作用，同時(shí)揭示了感染病毒前后各齡期幼蟲取食偏好的差異性，為今后深入探討營(yíng)養(yǎng)調(diào)控甜菜夜蛾體內(nèi)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，提供了翔實(shí)可靠的分析結(jié)果和研究結(jié)論，也將有助于指導(dǎo)不同營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)條件下的核多角體病毒的田間用藥策略。