靳雯怡，佟 巖，孟 茜，陳新中，方分分，秦啟聯(lián)，張繼紅，舒銳豪，張 寰*

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3.河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，河南濟(jì)源 454652)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)發(fā)布警告的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，主要取食危害玉米、小麥等204種植物(https://www.cabi.org/ISC/datasheet/29810)，是一種繁殖力極強(qiáng)、危害巨大的害蟲。自2019年入侵我國(guó)后，快速入侵大部分省區(qū)，并在南部省區(qū)定殖，可能成為常發(fā)和暴發(fā)性兼具的農(nóng)業(yè)害蟲(崔志斌等, 2020)。由于草地貪夜蛾在原產(chǎn)地美洲已經(jīng)對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生很高的抗藥性，加之新近入侵，我國(guó)缺乏生物和生態(tài)的自然控制因子，其危害潛力巨大，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可能造成極大的破壞。通過二代測(cè)序和相關(guān)抗性基因掃描檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)入侵我國(guó)的草地貪夜蛾種群對(duì)有機(jī)磷類、有機(jī)氯類和擬除蟲菊酯類等傳統(tǒng)農(nóng)藥具有較高的抗性基因變異頻率(崔志斌等, 2020)。而生物農(nóng)藥包括核型多角體病毒Nucleopolyhedrovirus(NPV)等綠色防控措施，不僅安全有效，且能夠顯著減緩草地貪夜蛾抗藥性的產(chǎn)生。

核型多角體病毒(NPVs)是桿狀病毒Baculovirus中發(fā)現(xiàn)較早、應(yīng)用最廣泛的昆蟲病毒，主要用于防治鱗翅目害蟲。世界上已有數(shù)十種桿狀病毒成功用于防治農(nóng)林害蟲。我國(guó)已登記注冊(cè)的病毒殺蟲劑有10余種，應(yīng)用最廣泛的有棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleopoly-hedrovirus，HearNPV)、甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodopteraexiguamultiplenucleopolyhedrovirus，SeMNPV)、斜紋夜蛾核型多角體病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus，SpltNPV)等。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是一種宿主范圍較廣的α-桿狀病毒，可感染10科33種鱗翅目幼蟲(王成燕, 2012)。研究表明，草地貪夜蛾幼蟲對(duì)AcMNPV口服感染有較強(qiáng)的抗性(Haas-Stapletonetal., 2005)，但草地貪夜蛾細(xì)胞系Sf 21及其克隆株Sf 9對(duì)AcMNPV出芽型病毒(Budded virus，BV)非常敏感。究其原因可能是AcMNPV的包涵體缺乏與草地貪夜蛾中腸柱狀細(xì)胞特異性結(jié)合或融合的能力。野生型AcMNPV存在顯著的基因型變異(Lee and Miller, 1978; Smith and Summers, 1978)，此外，AcMNPV的基因型變異可能在包括毒力在內(nèi)的表型特征上產(chǎn)生差異(KolodnyHirsch and VanBeek, 1997)。

選擇毒力增強(qiáng)的變異體是提高桿狀病毒毒力，并應(yīng)用于生物農(nóng)藥的新方向。連續(xù)傳代可以從一個(gè)異質(zhì)性的野生型種群中挑選出更強(qiáng)毒力的同質(zhì)分離株(Kolodny-Hirschetal., 1997)。已有在同源或異源宿主連續(xù)傳代后篩選得到毒力增強(qiáng)病毒的報(bào)道(Kolodny-Hirschetal., 1997)。如果要將AcMNPV開發(fā)成商品用于防治草地貪夜蛾，那么必須對(duì)其進(jìn)行毒株篩選和優(yōu)化，提高AcMNPV對(duì)草地貪夜蛾的口服感染能力，使其毒力達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的水平。毒力和傳播力之間博弈一直都是病毒進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)因子。從害蟲防控的角度來看，對(duì)病毒生物農(nóng)藥毒力的要求應(yīng)高于對(duì)其傳播力和產(chǎn)量的要求；反過來，從病毒生物農(nóng)藥生產(chǎn)的角度，還要考慮病毒接種量和產(chǎn)量等因素。本研究報(bào)道了在宿主草地貪夜蛾中連續(xù)壓力篩選前后AcMNPV的生物學(xué)活性和基因發(fā)生的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲、細(xì)胞和病毒來源

甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、草地貪夜蛾云南種群，購(gòu)買自河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，后在室內(nèi)25℃±1℃條件下使用人工飼料飼養(yǎng)。

Sf 9細(xì)胞系在27℃±1℃條件下使用含有10%胎牛血清的Insect-XPRESSTM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液加入雙抗(青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)。

AcMNPV野生毒株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 AcMNPV毒株在草地貪夜蛾中連續(xù)傳代

將用粉紋夜蛾Trichoplusisni幼蟲擴(kuò)增的AcMNPV，經(jīng)甜菜夜蛾、棉鈴蟲交替感染擴(kuò)增后，再次感染甜菜夜蛾，收取BVs接種Sf 9細(xì)胞，收獲的多角體命名為P0；挑取空斑單克隆，將此BVs注射入草地貪夜蛾3齡幼蟲，獲得死亡幼蟲，命名為P1；提取OBs，繼續(xù)接種草地貪夜蛾，收獲最早死亡的蟲尸，連續(xù)接種收獲20代，分別命名為P2～P20。連續(xù)傳代采用50%致死濃度(LC50)接種。

1.3 病毒DNA的提取

取適量差速離心法純化后的多角體，加入350 μL堿裂解液后混合均勻，37℃裂解30 min。然后加入約350 μL HCl(0.1 mol/L)，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0。加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和40 μL SDS(10%)，混勻后置入65℃水浴中保持2 h后，分別使用適量Tris飽和苯酚，等量的飽和苯酚∶氯仿(1∶1)混合液，等量的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，各提取一次，取出上層水相加入2倍體積無水乙醇混勻獲得DNA沉淀，再用70%乙醇洗滌沉淀，后在室溫下干燥；加入TE緩沖液100 μL溶解DNA，用分光光度法測(cè)定試樣DNA濃度，保存于-20℃。

1.4 全基因組測(cè)序

選取P3與P10代AcMNPV進(jìn)行illumina Hi-seq X PE 150測(cè)序(北京奧維森科技有限公司)。

1.5 PCR和電泳

采用PCR及Sanger測(cè)序?qū)Χ鷾y(cè)序的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。使用TIANSeq高保真PCR反應(yīng)預(yù)混液(天根生化科技有限公司，貨號(hào)：NG219)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見表1，引物序列見表2。反應(yīng)產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將電泳呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序。

表1 PCR反應(yīng)條件

表2 PCR實(shí)驗(yàn)引物序列

1.6 生物測(cè)定

選取P3，P6，P10，P15，P20代AcMNPV進(jìn)行生物測(cè)定，將病毒進(jìn)行濃度梯度稀釋，稀釋濃度為2×105、4×105、8×105、1.6×106、3.2×106、6.4×106OBs/mL。添加等量無菌去離子水作為空白對(duì)照。

飼料平板的制備：取草地貪夜蛾飼料與適量蒸餾水放于鍋中加熱融化，趁熱倒入15孔板養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每孔加入量以剛好鋪滿孔板底部為準(zhǔn)，冷卻凝固備用。

處理方法：飼料平板加入100 μL稀釋好的病毒液，空白對(duì)照加等量蒸餾水，涂布均勻，再用已消毒的毛筆或鑷子將草地貪夜蛾2齡幼蟲轉(zhuǎn)移至已加入病毒的飼料平板內(nèi)。每個(gè)濃度30頭。然后轉(zhuǎn)移至溫度25℃±1℃下繼續(xù)培養(yǎng)。觀察并記錄飼料及幼蟲感染死亡情況。

1.7 毒力計(jì)算

根據(jù)生物測(cè)定的結(jié)果，用SPSS 22.0對(duì)死亡率與濃度基于Probit回歸模型進(jìn)行回歸分析，計(jì)算LC50，并以此為指標(biāo)進(jìn)行毒力分級(jí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物測(cè)定以及毒力分析

將收集的蟲尸純化后得到OBs，計(jì)數(shù)后將病毒分別稀釋至不同濃度，喂食30頭草地貪夜蛾2齡幼蟲，另以喂食等量去離子水作為空白對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)10 d內(nèi)幼蟲死亡率(圖1)。第3代死亡率為0。第6代，隨著接種濃度增加，死亡率增加，但死亡率仍然很低，使用1.6～6.4×106OBs/mL，僅有1頭死亡。但是，隨著P10代以上，矯正死亡率顯著提升。通過生物測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算半致死濃度(LC50)，經(jīng)計(jì)算得P10、P15、P20代的LC50分別為4.845×107，2.665×107，2.925×107OBs/mL，由于感染P3和P6代AcMNPV的幼蟲死亡率過低，故無法計(jì)算二者的LC50。該結(jié)果表明不同毒株毒力從高到低依次為P15，P10，P20，P6，P3。

圖1 不同濃度病毒對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲致死率

2.2 測(cè)序結(jié)果及分析

選取P3和P10代AcMNPV進(jìn)行二代測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果拼接獲得全基因組序列，與NCBI中序列(Accession number : NC_001623)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)部分基因存在核苷酸突變和氨基酸突變。該結(jié)果表明7個(gè)編碼基因ac34、fgf、lef12、lef2、lef9、arif1以及ac112基因發(fā)生了核苷酸突變，其中4個(gè)基因ac34、fgf、lef12和lef2發(fā)生了氨基酸突變。經(jīng)進(jìn)一步PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)fgf基因?yàn)闇y(cè)序錯(cuò)誤(結(jié)果未展示)。將這3個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果翻譯后進(jìn)行BLAST比對(duì)(圖2)。

圖2 Ac34、LEF12、LEF2在P3和P10的氨基酸突變

圖中可以看出Ac34的3個(gè)氨基酸突變均發(fā)生在第10代，LEF12的3個(gè)氨基酸突變發(fā)生在第3代和第10代，LEF2的4個(gè)氨基酸突變只發(fā)生在第3代，而第10代與NCBI序列相同，依據(jù)氨基酸結(jié)果以及核苷酸測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)第10代出現(xiàn)了突變回復(fù)現(xiàn)象(圖3)。生物測(cè)定結(jié)果表明，第10代病毒的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第3代。這可能是由于連續(xù)傳代中宿主的選擇性壓力導(dǎo)致相同基因位點(diǎn)多次突變，將適宜宿主的突變保留，而與宿主適應(yīng)性無關(guān)的突變被淘汰。

圖3 lef2在P3和P10的核苷酸突變

3 結(jié)論與討論

草地貪夜蛾入侵我國(guó)并將長(zhǎng)期定殖，對(duì)其防控將成為長(zhǎng)久的戰(zhàn)役。病毒等微生物農(nóng)藥，可使害蟲種群在田間形成流行病，是抑制其常在性危害的重要措施之一。體內(nèi)連續(xù)傳代過程中病毒活性增強(qiáng)的現(xiàn)象已有很多報(bào)道，并認(rèn)為連續(xù)傳代是從異質(zhì)性的野生型群體中選擇毒力更強(qiáng)的病毒全體(Kolodny-Hirsch and van Beek, 1997)。AcMNPV在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Linnaeus)幼蟲中連續(xù)傳代后病毒毒力增強(qiáng)是由于基因型發(fā)生了變異(KolodnyHirsch and VanBeek, 1997)。病毒跨宿主連續(xù)傳代，NPV往往對(duì)傳代宿主毒力顯著升高，并且與傳代次數(shù)有關(guān)(王成燕, 2012)。

毒力和傳播力的博弈一直都是病毒進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)因素之一。病毒毒力和傳播能力之間往往存在進(jìn)化上的權(quán)衡。病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制是促進(jìn)病毒在各個(gè)宿主間傳播的必要條件。根據(jù)傳播毒力權(quán)衡假說，高毒力病毒具有較高的傳播率(病毒復(fù)制與毒力呈正相關(guān))和較快的傳播速度(更快地殺死宿主)。較快的殺蟲速度可能會(huì)增加病毒的適應(yīng)度，導(dǎo)致感染昆蟲體內(nèi)的OBs能迅速釋放到宿主血液中，使傳播周期和病毒擴(kuò)增增加。一項(xiàng)對(duì)舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantriadisparnucleopolyhedrovirus，LdNPV)的研究表明，短期感染的毒力高于長(zhǎng)期感染的毒力，這是因?yàn)樗拗魉劳雎蚀蟮拇鷥r(jià)是病毒傳播的減少(Cooperetal., 2002)。昆蟲中腸是病毒入侵過程中基因型選擇的主要場(chǎng)所。目前的研究表明，該過程也是病毒的遺傳瓶頸，可能嚴(yán)重影響宿主初始基因型的多樣性。該過程有助于基因型選擇，只有復(fù)制最有效的基因型才能建立有效的感染。

本研究使用的AcMNPV野生株宿主為棉鈴蟲或甜菜夜蛾，經(jīng)交叉世代感染獲得，對(duì)兩種宿主均有較高的毒力。然而，該毒株對(duì)草地貪夜蛾毒力較低，與Haas-Stapleton(2005)報(bào)道的結(jié)果一致(Haas-Stapletonetal., 2005)。本研究的壓力篩選方法是選擇將最先死亡的蟲尸中收獲的病毒多角體用于下一代接種，從而逐代縮短殺蟲速度。雖然傳代過程中LC50有所波動(dòng)，但通過連續(xù)傳代獲得的AcMNPV毒株對(duì)宿主草地貪夜蛾的毒力有所增強(qiáng)。測(cè)定了幾個(gè)世代AcMNPV毒力，毒力從高到底依次為P15、P10、P20、P6、P3。在前幾代中，病毒的毒力與傳代數(shù)呈正相關(guān)，該結(jié)果表明，隨著傳代次數(shù)增加，病毒對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的敏感性增強(qiáng)，對(duì)草地貪夜蛾的宿主適應(yīng)性增強(qiáng)。在P20代，AcMNPV毒力下降，這可能是由于病毒中存在不同的突變亞株所致。在收集子代病毒時(shí)，優(yōu)先選擇致死時(shí)間較短的毒株，而不是致死效果最強(qiáng)的毒株，這可能導(dǎo)致了致死時(shí)間短的亞株成為子代的優(yōu)勢(shì)種，導(dǎo)致幼蟲死亡率降低。

本研究的數(shù)據(jù)表明，AcMNPV在跨物種復(fù)制增殖過程中基因型發(fā)生了變異。本研究對(duì)AcMNPV第3代與第10代毒株進(jìn)行了二代測(cè)序和序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了多處SNP突變，包括一些編碼氨基酸的基因突變。發(fā)現(xiàn)該病毒的7個(gè)編碼基因存在單核苷酸多態(tài)性，這7個(gè)編碼基因參與病毒入核、多角體產(chǎn)量、加速中腸初始感染、抑制凋亡等功能。其中4個(gè)編碼基因發(fā)生同義突變可能是由于不同宿主的密碼子偏好不同，對(duì)產(chǎn)生蛋白的影響不大；錯(cuò)義突變的基因由于氨基酸組成的改變對(duì)蛋白質(zhì)的影響較大。編碼錯(cuò)譯突變的基因分別為ac34、lef12和lef2。

Ac34是一種促進(jìn)晚期基因表達(dá)的激活蛋白，對(duì)病毒的致病性至關(guān)重要(Caietal., 2012)。Ac34序列高度保守，其C端保守性更強(qiáng)，序列中存在非保守的核定位信號(hào)，也存在潛在的轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)(Qiuetal., 2017)。Ac34存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，由于桿狀病毒在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，Ac34的核定位可能對(duì)其促進(jìn)病毒復(fù)制的功能至關(guān)重要(Zhangetal., 2019)。Ac34刺激病毒晚期基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)BVs的產(chǎn)生，缺失ac34后產(chǎn)生無傳染性BVs，但細(xì)胞核內(nèi)可觀察到包被的核衣殼(Qiuetal., 2017)。缺失ac34不影響DNA復(fù)制以及病毒組裝，而延遲晚期基因表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，晚期轉(zhuǎn)錄不需要Ac34，但晚期基因表達(dá)的擴(kuò)增需要Ac34(Qiuetal., 2017)。

lef12是一種晚期表達(dá)基因，與病毒復(fù)制無關(guān)(Yuanetal., 2014)，但在晚期轉(zhuǎn)錄中起直接作用。然而lef12缺失的重組病毒產(chǎn)量下降了5倍(Qiuetal., 2017)。lef12不是病毒基因組復(fù)制所必需的基因，但其缺失將導(dǎo)致宿主細(xì)胞的感病時(shí)間延遲，也顯著降低病毒晚期和極晚期基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致晚期和極晚期蛋白水平減少(Guarinoetal., 2002)。

LEF1為引物酶，而LEF2作為引物酶輔助因子，將LEF1納入病毒DNA上組裝的復(fù)制復(fù)合物中，LEF1與LEF2結(jié)合，同時(shí)與單鏈DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并可能與其它DNA復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制(Mikhailov and Rohrmann, 2002)。最近的研究表明，LEF2不是影響DNA復(fù)制的必要因素，而只是提高DNA復(fù)制效率的影響因子(Wuetal., 2010)。lef2的啟動(dòng)子序列包含兩個(gè)晚期啟動(dòng)子共識(shí)基序(TAAG)，因此lef2可能在感染晚期轉(zhuǎn)錄(Passarelli and Miller, 1993)。由于LEF2作為DNA復(fù)制的重要影響因素，DNA復(fù)制又是晚期和極晚期基因表達(dá)的必要因素，故lef2突變會(huì)抑制晚期和極晚期基因表達(dá)(Merringtonetal., 1996)。綜上所述，LEF2影響病毒的方式有兩種：直接作用于晚期和極晚期基因表達(dá)，或作用于病毒DNA復(fù)制，間接影響病毒增殖(Sriram and Gopinathan, 1998)。

上述3種基因以不同的方式影響病毒產(chǎn)生以及病毒毒力。在本研究中，lef12的基因突變?cè)诘?代和第10代均有發(fā)生，lef2的基因突變僅在第3代發(fā)生，ac34的基因突變僅出現(xiàn)在第10代毒株中，提示Ac34在提高AcMNPV對(duì)草地貪夜蛾致病性中的重要性。這3個(gè)編碼基因特別是ac34的突變，可能是促進(jìn)AcMNPV在草地貪夜蛾幼蟲中連續(xù)傳代毒力增強(qiáng)的原因，具體的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。