陳琴，邱家紅，王曉英，金錢榮*

（1.云南森林自然中心，云南 昆明 650224；2.三岔河鎮(zhèn)林業(yè)和草原服務(wù)中心，云南 大姚，675413；3.金碧鎮(zhèn)林業(yè)和草原服務(wù)中心，云南 大姚 675400）

蘑菇屬（Agaricus L.）也稱傘菌屬,隸屬于真菌界（Fungi）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）。蘑菇屬是一類廣泛分布于世界各地，營腐生生活的重要經(jīng)濟(jì)真菌。生長在森林、草原、田間、地頭、路邊、庭院等地。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)統(tǒng)計，近年來人們采集到和鑒定過的已知的蘑菇屬的種有200～250 種[1]，但是,隨著研究的不斷深入,更多新的物種也將不斷被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)蘑菇屬真菌具有食用、藥用或保健價值,開發(fā)價值較高，是理想的天然食品。本研究則是對泰國清邁蘑菇屬真菌進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)初步研究，這將對該屬真菌的馴化、育種，增加食用菌的品種，蘑菇產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

本研究以泰國清邁蘑菇屬標(biāo)本為主，供試標(biāo)本為干燥標(biāo)本，共計8份。標(biāo)本詳情見表1。

表1 蘑菇屬真菌標(biāo)本來源表

1.1.2 方法來源

DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增所用混合液、rDNA ITS分析物、BM2000 DNA Marker，DM0101(Biomed)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用品

用具及儀器：A4繪圖紙、鉛筆、橡皮、小刀、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、電子顯微鏡、高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50-SII)、無菌操作臺(AIR TECH)、酒精燈、打火機(jī)、移液槍(含槍頭)、PCR 擴(kuò)增儀(My-CyclerTMthermal cycler，BIO-RAD)、瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-Ⅲ-6B)、紫外成像儀、臺式離心機(jī)(eppendorf，Centrifuge 5 417R)、小型離心機(jī)、臺式恒溫振蕩 器(AUTO SCIENCE，SWB-2 000 Horizontal Shaking Bath)、制冰機(jī)(SIM-F140，SANYO)。

試劑：75 %酒精、95 %酒精、5 %KOH、無水乙醇、TAE、去離子水、蒸餾水、瓊脂糖凝膠等試劑。

1.3 工作程序

1.3.1 DNA的提取

PCR 擴(kuò)增→PCR 反應(yīng)體系→PCR 反應(yīng)程序→PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→ITS 序列測定。

1.3.2 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

1.3.2.1 序列的訂正

首先在BioEdit 軟件中通過Graph對每條ITS序列的測定結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢：分別將每個標(biāo)本菌株的ITS4和ITS5測定的序列進(jìn)行復(fù)檢，經(jīng)過人工校正排除程序誤讀，最后將ITS4 和ITS5 序列拼接為一條ITS序列。

此外，通過美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，簡稱NCBI）的網(wǎng)站對所有序列進(jìn)行Blast，檢查是否所有序列都屬于蘑菇屬真菌，以防測得的序列為非目的屬序列。

1.3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank 上下載參考菌株的DNA 序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列以及本研究得到的標(biāo)本序列構(gòu)成數(shù)據(jù)庫，在BioEdit 軟件中通過ClustalX 程序進(jìn)行初步校對(Alignment)和序列長度處理。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫T-COFFEE 進(jìn)行數(shù)據(jù)的比對，之后再人工進(jìn)行調(diào)整校對。用ClustalX進(jìn)行相關(guān)格式轉(zhuǎn)換。系統(tǒng)發(fā)育分析中，運(yùn)用PAUP4.0（Phylogenetic Analysis Using Parsimony4.0）中的最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進(jìn)行1 000次bootstrap自舉法進(jìn)行檢測，得到系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取結(jié)果

本研究成功提取到25份標(biāo)本的DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增

提出DNA的25份標(biāo)本中有18份能夠完成PCR擴(kuò)增，電泳條帶較為明亮，另外7 份樣品（zrl-131、zrl-132、zrl-134、zrl-144、zrl-185、zrl-245、zrl-247）經(jīng)重復(fù)后電泳效果仍不理想，無法測序。

2.3 序列測定

本實(shí)驗(yàn)送檢測序樣品共計18 個,通過設(shè)計的引物，有8個樣品（zrl-188、zrl-193、zrl-219、zrl-221、zrl-229、zrl-235、zrl-273、zrl-276）ITS為“-”，無正常的序列，有2 個樣品(zrl-189、zrl-218)測序出現(xiàn)大面積套峰，無法完全讀出。因此測序正常的序列共8 個，其中有一個樣品無序列號（zrl-4049），則正常的序列共7 個，ITS 全區(qū)段（ITS1-5.8 s rDNA-ITS2）序列長度在651～664 bp，其中5.8 s 序列是保守序列，基本沒有變化；ITS1 和ITS2 為內(nèi)含子序列，變化較大。首先，經(jīng)過NCBI 中的BLAST 程序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)全部7 個樣品全部屬于蘑菇屬真菌。最終將本實(shí)驗(yàn)測得的7 條序列與GenBank 下載的124 條蘑菇屬真菌及4條外類群真菌的ITS 序列構(gòu)成系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)（詳見表2）。

表2 構(gòu)成數(shù)據(jù)庫的序列情況

續(xù) 表

續(xù) 表

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

利用網(wǎng)站http://www.phylogeny.fr/對全部135 條序列進(jìn)行分析，分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1。

由圖1 可以看出，標(biāo)本zrl-258 屬于Xanthodermatei 組；標(biāo) 本zrl-160 屬 于Sanguinolent 組；標(biāo)本zrl-133 屬于TRⅠ組；標(biāo)本zrl-265 屬于Arvense 組；有3 個標(biāo)本屬于Minores，分別是zrl-147、zrl-287、zrl-149，其中標(biāo)本zrl-147與zrl-287屬于同一個種，堿基位點(diǎn)完全相同。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

一是與ITS結(jié)合能夠較科學(xué)的解決蘑菇屬真菌分類鑒定的問題，避免單靠蘑菇屬真菌形態(tài)分類引起的分歧問題。

二是從分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果看，本次研究的25份標(biāo)本，有7份標(biāo)本具備了分子研究結(jié)果并參與到系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)成對比結(jié)果當(dāng)中，分別屬于Xanthodermatei、Sanguinolent、TRⅠ、Arvense和Minores五個組，其中Arvense組的蘑菇均可食用，經(jīng)濟(jì)價值較高，由此可后期進(jìn)行該方面的引種及開發(fā)研究。

三是研究對分子數(shù)據(jù)解決Minores 組真菌的系統(tǒng)發(fā)育問題進(jìn)行了初探，為進(jìn)一步深入測定其他區(qū)段的序列以解決Minores 組真菌的系統(tǒng)發(fā)育問題打下了基礎(chǔ)。