楊朔 劉少凱 趙少軒 朱宇辰 徐磊 李童云 劉曉光 安世恒 魏紀(jì)珍

摘要 ：棉鈴蟲Helicoverpa armigera是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，本文旨在研究小分子熱激蛋白在其生長發(fā)育過程、抵御高溫及Cry1Ac殺蟲蛋白中的功能。利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了棉鈴蟲sHSP22.0（small heat shock protein 22.0）基因，通過生物信息學(xué)軟件分析了棉鈴蟲sHSP22.0基因序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析了該基因在棉鈴蟲不同生長發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式;并分析了該基因受高溫及Cry1Ac全長蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng)。獲得了棉鈴蟲sHSP22.0（GenBank登錄號： XP_021196802.1） 761 bp cDNA片段，其開放閱讀框576 bp，編碼191個氨基酸，具有小分子熱激蛋白典型的α-晶體結(jié)構(gòu)域（α-crystallin domain，ACD）。sHSP22.0在棉鈴蟲4齡和5齡期特異性表達(dá)，尤其在5齡幼蟲的表皮、中腸和后腸內(nèi)特異性表達(dá)。該小分子熱激蛋白受溫度和Cry1Ac全長蛋白的誘導(dǎo)后顯著高表達(dá)。sHSP22.0不僅在暴食期及腸道內(nèi)特異性表達(dá)，而且響應(yīng)Cry1Ac全長蛋白的誘導(dǎo)，表明它在棉鈴蟲消化吸收及抵御外源物的活動中可能起到重要的作用。

關(guān)鍵詞 ：棉鈴蟲; 小分子熱激蛋白; sHSP22.0; 溫度; Cry1Ac全長蛋白

中圖分類號：

Q 966

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020009

Molecular cloning and expression profiling of small heat shock protein 22.0 in

Helicoverpa armigera （Lepidoptera： Noctuidae）

YANG Shuo， LIU Shaokai， ZHAO Shaoxuan， ZHU Yuchen， XU Lei， LI Tongyun，

LIU Xiaoguang， AN Shiheng， WEI Jizhen*

（State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science， College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

Helicoverpa armigera is an important agricultural pest. This study aims to explore the functions of small heat shock protein 22.0 gene （sHSP22.0） in the growth and development of cotton bollworm， and its role in suffering the high temperature and Cry1Ac protein. The full-length cDNA sequence of sHSP22.0 gene was cloned from H.armigera by using PCR and RACE （rapid amplification of cDNA ends） technology， and the sHSP22.0 gene was analyzed by bioinformatics related molecular software. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to assess the expression patterns of sHSP22.0 in different developmental stages and tissues of cotton bollworm. Meanwhile， the expression levels of sHSP22.0 were also checked in the larval after heat and full-length Cry1Ac protein treatments. The results showed that the full-length cDNA sequence of sHSP22.0 （GenBank accession no： XP_021196802.1） was 761 bp with an open reading frame （ORF） 576 bp in length， encoding 191 amino acids， and it had the typical α-crystallin domain （ACD）. The sHSP22.0 gene was specially expressed in 4th and 5th instar larvae， and especially expressed in midgut， hindgut and cuticle of 5th instar larvae. After the heat and full-length Cry1Ac protein treatments， sHSP22.0 showed special expression in 5th instar larvae. The sHSP22.0 gene specially expresses in the gluttony period and gut of H.armigera， and importantly， it is induced by full-length Cry1Ac protein. All the results indicate sHSP22.0 may participate in the activities of the digestion and absorption， and may have the function in defensing against exogenous substrates.

Key words

Helicoverpa armigera; small heat shock protein; sHSP220; temperature; full-length Cry1Ac protein

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物體內(nèi)廣泛存在，以應(yīng)激蛋白和分子伴侶的方式響應(yīng)外界生物和非生物因子的壓力，參與蛋白質(zhì)的裝配、折疊和跨膜傳導(dǎo)等眾多的生物過程[12]。按照序列的同源性及分子量的大小，熱激蛋白常被分為4類：HSP90（85～90 kDa）、HSP70（68～73 kDa）、HSP60和小分子量sHSP家族[3]。在自然界中，昆蟲個體較小又是變溫動物，由于長期適應(yīng)環(huán)境的變化，昆蟲體內(nèi)進(jìn)化出了種類繁多的熱激蛋白[4]。其中小分子熱激蛋白（sHSP）的數(shù)目尤為繁多，它們具有保守的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域，但相對于大分子的熱激蛋白，其序列不保守且功能復(fù)雜。小分子熱激蛋白的發(fā)現(xiàn)也較晚，1974年科學(xué)家才從黑腹果蠅Drosophila melanogaster中發(fā)現(xiàn)了小分子熱激蛋白[5]，對小分子熱激蛋白的研究較少。后隨著測序技術(shù)的發(fā)展，更多的小分子熱激蛋白被鑒定出來，例如在家蠶Bombyx mori中發(fā)現(xiàn)了16種sHSP，小菜蛾P(guān)lutella xylostella中鑒定出15種sHSP，另外棉鈴蟲Helicoverpa armigera中也發(fā)現(xiàn)了8種sHSP[68]。研究發(fā)現(xiàn)這些小分子熱激蛋白在生物體內(nèi)表達(dá)模式多種多樣，推測它們可能在昆蟲的發(fā)育過程和各種生理活動中具有重要的功能，例如調(diào)節(jié)昆蟲的生長發(fā)育和繁殖[912]、抵御溫度變化[1315]、參與昆蟲的滯育[1617]和抵御農(nóng)藥的危害等[18]。

棉鈴蟲是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，為害棉花、玉米、花生等幾百種農(nóng)作物[1920]。近20多年來，人們主要通過種植轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）殺蟲蛋白基因的作物來防治棉鈴蟲。然而，棉鈴蟲的發(fā)生隨著我國農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整產(chǎn)生了明顯的變化，玉米、花生、蔬菜等非Bt作物種植面積增加，棉鈴蟲寄主植物發(fā)生了轉(zhuǎn)變，從而致使其種群密度不斷增加，為害加重[21]。因此對棉鈴蟲的研究和防治仍然任重而道遠(yuǎn)。

在棉鈴蟲中，不同分子量的熱激蛋白逐漸被鑒定出來，但是具體每種熱激蛋白的功能研究還處于初級階段。棉鈴蟲熱激蛋白HSP70和HSP21.4基因在棉鈴蟲滯育蛹的腦中高表達(dá)[2223]，隨后研究發(fā)現(xiàn)熱效應(yīng)因子HSF1（heat shock factor 1）在棉鈴蟲滯育階段調(diào)控Hsp70的上調(diào)表達(dá)，參與了棉鈴蟲滯育[24]。棉鈴蟲熱激蛋白Hsp19.5、Hsp19.7、Hsp22.0、Hsp272、Hsp60、HSC70、Hsp200、Hsp20.7、Hsp20.8、Hsp21.4、HSC90基因響應(yīng)光脅迫，這些熱激蛋白以不同的方式協(xié)調(diào)保護(hù)昆蟲免受紫外線的傷害[8]。經(jīng)37℃到42℃熱激處理后，棉鈴蟲幼蟲唾液腺中，Hsp70和Hsp64高豐度表達(dá)，但在幼蟲的馬氏管、睪丸和脂肪體中Hsp70幾乎不表達(dá)而Hsp64高水平表達(dá)[25]，這預(yù)示著不同的熱激蛋白在不同的組織中可能發(fā)揮不同的功能。棉鈴蟲Hsp70和Hsp90在溫度高于38℃時(shí)表達(dá)量會隨溫度的升高逐漸升高，這可能與環(huán)境溫度適應(yīng)相關(guān)[26]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，棉鈴蟲HSP70可與Cry1Ac蛋白結(jié)合[27]，Cry1Ac殺蟲蛋白處理后，棉鈴蟲幼蟲HSP70基因的表達(dá)量降低[28]。

上述對棉鈴蟲熱激蛋白的鑒定和功能研究在一定程度上豐富了熱激蛋白的研究。但是隨著氣溫的變化及轉(zhuǎn)cry1Ac基因的棉花在我國的全面推廣等，來自外界的環(huán)境壓力迫使棉鈴蟲快速適應(yīng)環(huán)境變化，而熱激蛋白在棉鈴蟲抵御環(huán)境壓力中的功能還急需研究，這對棉鈴蟲的種群控制具有重要的意義。在本研究中，我們通過分子生物學(xué)手段，克隆了棉鈴蟲的一個小分子熱激蛋白sHSP22.0基因，分析了它在棉鈴蟲不同發(fā)育歷期和組織中的表達(dá)譜，并比較了其在受到高溫和Cry1Ac全長蛋白誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)情況，為豐富棉鈴蟲熱激蛋白的研究及棉鈴蟲的防控提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試棉鈴蟲及Bt殺蟲蛋白

本研究中供試棉鈴蟲為未接觸任何生物殺蟲劑或化學(xué)殺蟲劑的棉鈴蟲敏感種群LF品系（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲組梁革梅研究員贈予），幼蟲取食棉鈴蟲人工飼料，成蟲取食10%的糖水，于室內(nèi)相對濕度（75±10）%，溫度（27±2）℃和光周期L∥D=14 h∥10 h條件下連續(xù)飼養(yǎng)15年[29]。

Cry1Ac全長蛋白購于北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 樣品準(zhǔn)備

1.2.1 棉鈴蟲各發(fā)育階段和組織樣品的準(zhǔn)備

飼養(yǎng)棉鈴蟲，分別收集1齡（20頭）、2齡（10頭）、3齡（5頭）、4齡（3頭）、5齡（3頭）、蛹（3頭）和成蟲（3頭），為1個生物學(xué)重復(fù)，用于研究sHSP22.0基因在棉鈴蟲各發(fā)育階段的表達(dá)模式。取5齡第2天棉鈴蟲10頭，在冰上解剖棉鈴蟲的前腸、中腸、后腸、馬氏管和表皮。解剖后，前腸、中腸和后腸用4℃預(yù)冷的0.7% NaCl溶液洗去內(nèi)含物，用濾紙吸干水分后保存?zhèn)溆?，用于比較不同組織中sHSP22.0基因的表達(dá)差異。上述樣品一經(jīng)處理后，立即放入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)放到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 高溫處理樣品的準(zhǔn)備

取27℃正常飼養(yǎng)的5齡棉鈴蟲，放入40℃培養(yǎng)箱，處理1 h和2 h后，立即放入液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)存到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯尤∩L狀況一致的棉鈴蟲，于27℃分別處理1 h和2 h為對照。每個處理包括4次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)取樣3頭。

1.2.3 Cry1Ac處理樣品的準(zhǔn)備

飼養(yǎng)棉鈴蟲，取5齡第1天棉鈴蟲，饑餓24 h后，轉(zhuǎn)到含30 μg/mL Cry1Ac全長蛋白（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，該濃度是處理5齡棉鈴蟲幼蟲7 d后LC30的劑量）或不含Cry1Ac全長蛋白的人工飼料上，飼喂1 h和2 h后，立即轉(zhuǎn)移到冰上解剖取中腸，步驟同1.2.1。每個處理包括4次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)取樣10頭。

1.3 總RNA的提取和cDNA合成

以上各備用樣品總RNA的提取采用TRIzol法，按Invitrogen的操作說明提取。RACE擴(kuò)增所用的cDNA模板的合成參考SMART-RACE cDNA Amplification Kit 說明書操作，樣品為棉鈴蟲5齡幼蟲的中腸組織。熒光定量qRT-PCR所用cDNA模板依照SuperReal PreMix（Probe）說明書合成。

1.4 棉鈴蟲sHSP22.0全長基因克隆

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室得到的棉鈴蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[30]，獲得sHSP22.0的部分序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性5′RACE引物sHSP22.0-RACE-5′（表1），以敏感棉鈴蟲cDNA為模板，擴(kuò)增其5′端序列。PCR的反應(yīng)體系為25 μL：1 μL cDNA，2.5 μL 10×Buffer， 0.25 μL LATaq，0.5 μL sHSP22.0-RACE-5′引物（10 mmol/L），2.5 μL UPM，18.25 μL無菌水。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，72℃ 延伸3 min， 循環(huán)5次;94℃變性30 s，70℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環(huán)5次;94℃變性30 s，68℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切割目的條帶，送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序成功后拼接序列，設(shè)計(jì)特異性引物sHSP22.0-ORF-F和sHSP22.0-ORF-R（表1），以棉鈴蟲中腸cDNA為模板，擴(kuò)增其開放閱讀框，PCR的反應(yīng)體系為25 μL： 1 μL cDNA， 0.5 μL sHSP22.0-ORF-F引物（10 mmo/L）和0.5 μL sHSP22.0-ORF-R引物（10 mmo/L），1 μL dNTPs，2.5 μL 10×EasyTaq Buffer，0.25 μL EasyTaq E，19.25 μL無菌水。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，如上述方法檢測并測序。

1.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用基因探索者軟件分析sHSP22.0基因，預(yù)測其開放閱讀框長度，并對閱讀框進(jìn)行翻譯;利用在線軟件（https：∥web.expasy.org/compute pi/）和SWISS-MODEL分析該小分子熱激蛋白的相對分子量、等電點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域;再在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp 同源序列分析，選取同源性較高的不同昆蟲的小分子熱激蛋白，利用MEGA 7（7014）軟件，選用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，利用最大相似法（maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析。

1.6 熒光定量RT-PCR分析

根據(jù)上述擴(kuò)增得到的棉鈴蟲sHSP22.0的cDNA序列，送Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成Taqman探針sHSP22.0-RTPCR-P（5′端用FAM標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記）及熒光定量RT-PCR的特異性引物sHSP22.0-RTPCR-F和sHSP22.0-RTPCR-R（表1）。熒光定量采用雙內(nèi)參法，內(nèi)參基因分別為棉鈴蟲Actin基因（GenBank 登錄號：X97615.1） 和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH基因）（GenBank 登錄號 JF417983.1）。20 μL RT-PCR反應(yīng)體系包括正向和反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，MaximaR Probe/ROX qPCR Master Mix（2×）10 μL，cDNA2 μL和無菌水6.4 μL。于7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min;95℃變性3 s，60℃退火/延伸30 s，循環(huán)40次。qRT-PCR進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析使用相對定量分析方法，計(jì)算公式采用2-ΔΔCt法[31]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用DPS7.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其中不同發(fā)育階段，不同組織，溫度或Cry1Ac全長蛋白不同處理時(shí)間之間的方差分析采用單因素Tukey法，在P<0.05水平進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲sHSP22.0基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化位置

從棉鈴蟲中腸組織cDNA中擴(kuò)增得到一條761 bp的基因序列，開放閱讀框?yàn)?76 bp，編碼191個氨基酸，GenBank登錄號為XP_021196802.1。在線軟件預(yù)測其蛋白分子量為22.0 kDa，等電點(diǎn)為6.54。同時(shí)對該基因結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析表明它具有可變的N-末端區(qū)域（氨基酸殘基1—49），小分子熱激蛋白保守的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基 50—159），以及C-末端區(qū)域（氨基酸殘基160—191）（圖1），屬于典型的小分子熱激蛋白，我們將其命名為sHSP22.0。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp 同源序列分析，棉鈴蟲sHSP22.0的氨基酸序列與其他18種昆蟲的序列同源性較高，與小分子熱激蛋白具有類似的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域（圖2）。但是，棉鈴蟲sHSP22.0與不同昆蟲的sHSPs比較，N端差異顯著（圖2）;同時(shí)，sHSP22.0與不同分子量的熱激蛋白間C-端也存在較大差異（圖2）。通過比對分析，棉鈴蟲sHSP22.0的氨基酸序列與斜紋夜蛾Spodoptera litura l（2）efl（protein lethal（2）essential for life-like，l（2）efl，同屬小分子的熱激蛋白家族基因）氨基酸序列同源性在90%以上;與其他被比較的鱗翅目夜蛾科昆蟲的氨基酸同源性在70%以上（圖2）。

利用MEGA 7（7. 0.14）軟件，采用最大似然法進(jìn)一步分析了棉鈴蟲sHSP 22.0基因的進(jìn)化關(guān)系，我們以白符跳Folsomia candida為外群，將棉鈴蟲sHSP22.0氨基酸序列與18種昆蟲的相近基因的氨基酸序列進(jìn)行了進(jìn)化樹分析（圖3）。結(jié)果表明，棉鈴蟲sHSP22.0與鱗翅目昆蟲的sHSP聚在了同一進(jìn)化支上，其中與已經(jīng)鑒定的斜紋夜蛾S.litura l（2）efl的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是煙草天蛾M.sexta l（2）efl（圖3）。這與上述氨基酸序列同源性分析結(jié)果一致。

2.2 sHSP22.0在棉鈴蟲不同發(fā)育期和組織中的表達(dá)

通過qRT-PCR分析，sHSP22.0的表達(dá)主要在幼蟲4齡和5齡階段，在幼蟲的低齡期、蛹和成蟲中均未檢測到sHSP22.0的表達(dá)（圖4a）。進(jìn)一步分析sHSP22.0基因在棉鈴蟲5齡幼蟲各組織中表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)該基因在中腸、后腸和表皮中均有表達(dá)，后腸中表達(dá)量最高，其次是表皮和中腸中，但是在前腸和馬氏管中沒有檢測到其表達(dá)（圖4b）。

2.3 sHSP22.0在棉鈴蟲受高溫和Cry1Ac全長蛋白誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)差異

40℃處理后，sHSP22.0基因的表達(dá)顯著上調(diào)，特別是在處理1 h時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)6 240.28倍（F=365.16， P=0.000 1）（圖5a）。除此之外，sHSP22.0基因的表達(dá)還受到Cry1Ac全長蛋白的誘導(dǎo)，棉鈴蟲在取食Cry1Ac全長蛋白后1 h和2 h，該基因均顯著上調(diào)表達(dá)（F=22.185，P=0.000 3），最高在1 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)20.53倍（圖5b）。

3 討論

通過分析棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0的基因序列，發(fā)現(xiàn)其是典型的小分子熱激蛋白家族的基因，也具有α-晶狀體結(jié)構(gòu)域。小分子熱激蛋白的N端多變[3]，同源序列分析表明不同熱激蛋白分子間的N端差異也較大。本研究中棉鈴蟲sHSP22.0與其他被比較的小分子量熱激蛋白間C-端也存在較大差異，這可能是由于被鑒定的小分子熱激蛋白數(shù)量有限，sHSP22.0與被比較的其他鱗翅目昆蟲的sHSP之間在分子量上存在差異，也可能是由于小分子熱激蛋白的多樣性造成的[4]。盡管被比較的小分子熱激蛋白存在一定的差異，但是棉鈴蟲sHSP22.0與其他鱗翅目昆蟲的小分子熱激蛋白仍具有較高的同源性，并聚為一支。

在棉鈴蟲1齡、2齡和3齡幼蟲，蛹和成蟲，以及在5齡期的馬氏管和前腸均沒有檢測到sHSP22.0基因的表達(dá)。這種小分子熱激蛋白基因在某些發(fā)育階段或組織中不表達(dá)的現(xiàn)象在小菜蛾中也有報(bào)道，其中sHSP18.8在小菜蛾幼蟲3齡和4齡階段不表達(dá)，sHSP19.23和sHSP23.4在卵中不表達(dá)[32]。熱激蛋白在一些發(fā)育階段不表達(dá)可能預(yù)示著它們沒有參與這個階段的生理生化活動。sHSP22.0基因在棉鈴蟲幼蟲4齡和5齡期特異性表達(dá)，這種小分子熱激蛋白在特定的幼蟲期表達(dá)的現(xiàn)象在其他昆蟲中也普遍存在。例如，地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata的2個hsp23基因在幼蟲階段高表達(dá)[33]。組織特異性分析發(fā)現(xiàn)sHSP22.0基因在5齡棉鈴蟲中腸和后腸中特異性表達(dá)，這種組織特異性表達(dá)同樣也有報(bào)道，例如家蠶的sHSP20.4在中腸內(nèi)特異性高表達(dá)[17]，小菜蛾的4個小分子熱激蛋白基因sHSP19.5、sHSP20.1、sHSP21.6和sHSP21.8在腸道內(nèi)的表達(dá)高于其他組織[32]?；虻碾A段性或組織特異性表達(dá)往往預(yù)示著它可能參與到了該階段或組織中的生命活動。棉鈴蟲作為重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要危害階段是幼蟲期，尤其4齡和5齡是棉鈴蟲的暴食階段，也是棉鈴蟲重要營養(yǎng)階段。棉鈴蟲sHSP22.0基因在這個階段的特異性表達(dá)，尤其在腸道內(nèi)的相對高表達(dá)，表明sHSP22.0基因在棉鈴蟲消化吸收以及抵御外源物等活動中可能起到重要的作用。sHSP22.0基因除了在腸道內(nèi)特異性表達(dá)外，還在棉鈴蟲表皮中表達(dá)。小分子熱激蛋白在表皮中特異性表達(dá)的現(xiàn)象在小菜蛾中也有報(bào)道，Chen 等[32]在小菜蛾中鑒定到了5種小分子熱激蛋白在表皮中超表達(dá)。表皮是昆蟲抵御外界侵入的重要保護(hù)屏障，sHSP22.0基因在表皮中的特異性表達(dá)，再次表明它可能參與昆蟲抵御外源物過程。根據(jù)熱激蛋白的功能研究，推測它可能通過維持昆蟲正常的器官功能或作為蛋白質(zhì)的重要分子伴侶保護(hù)蛋白質(zhì)的正常功能的方式抵御外界侵害[35]。

熱激蛋白分子受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的反應(yīng)是昆蟲適應(yīng)溫度變化的重要保護(hù)機(jī)制。熱激蛋白的表達(dá)受溫度的誘導(dǎo)，但是表達(dá)一般具有瞬時(shí)性，短則幾分鐘就可以檢測到昆蟲體內(nèi)熱激蛋白表達(dá)量增加，長則在1～2 h時(shí)積累量會達(dá)到高峰，隨后會顯著下降[36]。棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0具有熱激蛋白分子典型的小分子結(jié)構(gòu)[3738]，而且我們發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在受溫度誘導(dǎo)1 h后顯著上調(diào)6 240.28倍。高溫可以誘導(dǎo)小分子熱激蛋白的表達(dá)，這種現(xiàn)象在其他昆蟲中也較為常見，例如高溫可以顯著誘導(dǎo)小菜蛾12種小分子熱激蛋白基因表達(dá)[32]，腰腹長體繭蜂Macrocentrus cingulum的Hsp23.8和柞蠶Antheraea pernyi的Hsp21經(jīng)熱激后也可迅速上調(diào)表達(dá)[3940]。自然界中，溫度在調(diào)控生物的生理生化過程中起著重要的作用，尤其對于昆蟲這種變溫動物。棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0快速顯著地響應(yīng)溫度的誘導(dǎo)，表明它在幫助棉鈴蟲適應(yīng)不利條件，保護(hù)自身正常生理活動中起到非常重要的作用。

本研究中棉鈴蟲sHSP22.0也響應(yīng)Cry1Ac全長蛋白的誘導(dǎo)，1 h時(shí)表達(dá)可上調(diào)20.53倍。據(jù)報(bào)道云杉夜蛾Choristoneura fumiferana取食亞致死劑量的Cry1Ab全長蛋白后，HSP90的表達(dá)量顯著上調(diào)[41]。這表明棉鈴蟲sHSP22.0在抵御Cry1Ac全長蛋白的作用過程中可能起到重要的作用。然而，另有研究報(bào)道棉鈴蟲取食Cry1Ac全長蛋白后，HSP70的表達(dá)量降低[28]。這顯示小分子熱激蛋白與大分子熱激蛋白的功能可能存在差異，對于棉鈴蟲sHSP220具體在棉鈴蟲抵御高溫和Cry1Ac全長蛋白中如何發(fā)揮功能還需要進(jìn)一步的深入研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）