付 帥，陳仕朋，葉 煒，林玉玲，徐 涵，3，賴鐘雄*，葉開(kāi)溫，4*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002；2.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建三明365000；3.法國(guó)圖盧茲綜合科學(xué)研究所，法國(guó)圖盧茲31000；4.臺(tái)灣大學(xué)植物科學(xué)研究所，臺(tái)灣臺(tái)北10617）

MAD2（spindle check point protein MAD2）是一種紡錘體檢查點(diǎn)蛋白，首先在玉米中鑒定，它與有絲分裂細(xì)胞以及減數(shù)分裂I和II期間的著絲?！?jiǎng)恿?fù)合體相關(guān)[1]。MAD2是紡錘體檢查點(diǎn)的重要組成部分，在微管附著到動(dòng)粒完成的過(guò)程中該基因能阻斷分離酶的激活和姐妹染色單體的溶解[2]。對(duì)細(xì)胞分裂的過(guò)程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了在未與紡錘體連接的著絲點(diǎn)上MAD2蛋白的濃度較高，而在與紡錘絲連接的著絲點(diǎn)上則與之相反，這表明MAD2在未與紡錘體連接的著絲粒點(diǎn)上高濃度[3]。MAD2是維持染色體在分裂時(shí)向細(xì)胞兩級(jí)移動(dòng)的關(guān)鍵物質(zhì)，在探討染色體不分離問(wèn)題的分子機(jī)制中，該基因的研究顯得極為重要[4]。在nua突變體中發(fā)現(xiàn)NUA和MAD2可能在植物的分生細(xì)胞分裂中發(fā)揮作用[5]。已有的研究表明，在文心蘭不可育品種‘檸檬綠’中，On MAD2的表達(dá)量低于可育品種‘巧克力’，因此推測(cè)MAD2是影響文心蘭‘檸檬綠’花粉活力低的關(guān)鍵基因之一[6]。

該試驗(yàn)通過(guò)At MAD2基因的擬南芥突變體mad2（SALK_136419）的鑒定與表型分析，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)At MAD2基因在擬南芥花苞中表達(dá)量增高時(shí)會(huì)影響植物的生殖生長(zhǎng)，如抽花梗時(shí)間提早、花粉活力和結(jié)果莢率下降。表明了MAD2在擬南芥中表達(dá)量高會(huì)導(dǎo)致育性下降，這與MAD2在文心蘭中的表達(dá)結(jié)果相反。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidops is thaliana）mad2（S A L K_136419）突變體購(gòu)自擬南芥突變體中（Ara Share），通過(guò)T AIR（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）查詢T-D N A插入位點(diǎn)的邊緣序列（Flanking sequence），經(jīng)三引物法篩選鑒定后用于本次試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 播種方法與種植環(huán)境。將種子從4℃冰箱取出，之后在超凈臺(tái)使用84消毒液∶水（1∶5）進(jìn)行清洗2次，每次5 min，消毒后用高壓滅菌水進(jìn)行清洗5～6次，每次1 min。均勻播種在1/2 M S培養(yǎng)基平板上。4℃黑暗環(huán)境下存放2 d后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22℃，相對(duì)濕度60%～70%，14 h/10 h的光暗周期。大約7 d后，移栽到培養(yǎng)土中（土∶蛭石=2∶1）。放置在人工氣候箱，光照條件和溫度同上。

1.2.2 突變體鑒定。幼苗生長(zhǎng)3周，剪取葉片采用C T AB法提取基因組總D N A，以總D N A為模板進(jìn)行PC R擴(kuò)增。PC R所用引物L(fēng) P、R P的序列根據(jù)插入位點(diǎn)的位置自行設(shè)計(jì)，T-D N A通用引物B P通過(guò)http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html設(shè)計(jì)，進(jìn)行PC R擴(kuò)增(表1)，驗(yàn)證m y b106突變體是否為純合體。反應(yīng)體系共20μL：模板1μL，引物各1μL，10μL 2×Taq PCR Master Mix(上海生物工程有限公司)，加ddH2O至20μL，充分混勻后進(jìn)行PC R擴(kuò)增。PC R反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)。PC R產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于凝膠成像系統(tǒng)成像。

表1 PCR引物序列

1.2.3 擬南芥總R N A的提取。采用T ri z ol u p R N A試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司）提取擬南芥未開(kāi)放時(shí)期花苞的總R N A，利用超微量分光光度計(jì)（Thermo Electron Corp）檢測(cè)R N A樣品濃度（O D260/O D280值介于1.8～2.1），并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)花器官總R N A的質(zhì)量和純度。cDNA經(jīng) SMART TM RACEA cDNA Amplification Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成，用于后續(xù)目的基因AtMAD2表達(dá)量的檢測(cè)。

具體操作方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 植株的表型觀測(cè)。使用手機(jī)拍攝記錄播種30和60 d的生長(zhǎng)情況。隨機(jī)選取16株擬南芥野生型和mad2突變體的植株。

1.2.5 擬南芥花藥和花粉粒的亞歷山大染色。取擬南芥野生型和mad2突變體的盛開(kāi)期的花朵，參考Alexander[7]的方法，將花粉置于載玻片上，滴少量亞歷山大染色液，可育花粉呈深紅色，花粉活力弱呈淺紅色，敗育花粉呈無(wú)色。置于普通光學(xué)顯微鏡（B X-50）下觀察染色花粉粒的數(shù)量和形狀。并統(tǒng)計(jì)3個(gè)最佳視野下花粉粒的總數(shù)和著色花粉粒數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和分析方法。使用軟件Excel 2010進(jìn)行student t-test顯著性分析，P<0.05為顯著差異（*），P<0.01為極顯著差異（**）。

2 結(jié)果分析

2.1 T-DNA插入位點(diǎn)與鑒定結(jié)果

從圖1可見(jiàn)，mad2（At3g25980）由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，mad2（S A L K_136419）突變體的T-D N A插入位點(diǎn)位于5′U T R端前約2 100 b p左右。

圖1 mad2突變體的T-DNA插入位點(diǎn)分析及鑒定結(jié)果

用mad2基因的特異性引物L(fēng) P與R P進(jìn)行PC R擴(kuò)增，野生型中擴(kuò)增出1條帶，條帶位置與目的基因（1 059 bp）大小一致。而與此對(duì)應(yīng)的mad2突變體中未擴(kuò)增出條帶，而用T-D N A特異性引物B P和R P進(jìn)行擴(kuò)增，mad2突變體中擴(kuò)增出1條特異條帶，條帶大小為500～750 b p，與引物的預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致，而野生型中未能擴(kuò)增出此條帶，證明本試驗(yàn)所使用MAD2的T-D N A插入體是純合的突變體。

2.2 AtMAD2的表達(dá)量分析

熒光定量PC R的結(jié)果表明在mad2突變體中，OnMAD2的表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型，大約是野生型的9倍（圖2）。

圖2 AtMAD2在突變體中的表達(dá)量分析

2.3 突變體的表型分析

將野生型擬南芥和mad2突變體進(jìn)行表型比較分析。結(jié)果如下：播種后30 d時(shí)mad2突變體已經(jīng)抽梗，而野生型還未抽梗（圖3A）。播種60 d后，可以看出mad2突變體植株的植株大小與野生型有明顯差異，說(shuō)明MAD2基因的T-D N A插入抑制了植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，除此之外，野生型的果莢數(shù)量較多，而mad2突變體的結(jié)莢數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于野生型株，并且可以看出野生型的莖相比于mad2更加粗壯（圖3B）。

圖3 擬南芥野生型和myb106突變體的表型分析

對(duì)野生型擬南芥和mad2突變體植株的結(jié)果莢情況進(jìn)行分析可知，W T的果莢長(zhǎng)度約為1.07 cm，單個(gè)果莢內(nèi)種子數(shù)量約為19粒。與其同樣環(huán)境下種植的mad2突變體的都小于W T的果莢長(zhǎng)度和種子數(shù)量。其中mad2的果莢長(zhǎng)度和單果莢種子數(shù)量均約為0.79 cm、7粒，與野生型植株呈現(xiàn)極顯著差異。這表明T-D N A對(duì)MAD2基因高表達(dá)的影響，直觀的影響到了植株的繁育能力，顯著影響了果莢的發(fā)育和種子形成的過(guò)程（表2）。

表2 野生型擬南芥和mad2突變體植物的果莢分析

2.4 突變體花粉粒的亞歷山大染色

對(duì)擬南芥花朵開(kāi)放期成熟花粉粒的亞歷山大染色，可以看出擬南芥野生型的單個(gè)花粉粒獨(dú)立分散，并且花粉粒形態(tài)飽滿，形狀近乎圓形，僅有少數(shù)花粉粒未被著色（圖4A-C）。對(duì)花粉粒的花粉活力進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，可以看出野生型的被染色的花粉粒高達(dá)94%（圖5）。mad2突變體的花粉粒在染色后，有較多的花粉粒未著色，這表明mad2突變體有較多的花粉粒是沒(méi)有活力的。從更細(xì)節(jié)的圖片中可以看出，mad2的花粉粒形狀異常。之后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，得到mad2突變體的花粉活力染色率僅為69%（圖5），與野生型呈現(xiàn)極顯著差異（圖4D-F）。

圖4 擬南芥開(kāi)放期花藥和花粉粒的亞歷山大染色

3 討論

在已有的研究結(jié)果中，不乏有高表達(dá)導(dǎo)致植物不育的基因，如擬南芥中過(guò)表達(dá)miR167導(dǎo)致雄性不育[8]；同樣在擬南芥中過(guò)表達(dá)At1g74450的O R F后會(huì)讓植物的株高和育性都下降[9]；在擬南芥中過(guò)表達(dá)miR159能夠延遲開(kāi)花，因?yàn)閙iR159可以調(diào)節(jié)編碼M Y B轉(zhuǎn)錄因子的基因與花藥發(fā)育有著非常廣泛的關(guān)聯(lián)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)mi R159的植株中，由于抑制了MYB103基因的合成，導(dǎo)致絨氈層提前降解，最終造成花粉敗育[10]。就表型來(lái)看，AtMAD2就是屬于這一類(lèi)的基因。AtMAD2表達(dá)量增加提早了擬南芥抽花梗的時(shí)期，讓其提早抽花梗大約4 d左右，對(duì)于后續(xù)發(fā)育時(shí)期的生殖生長(zhǎng)，MAD2基因也起到了關(guān)鍵作用，mad2的突變體花粉活力嚴(yán)重下降，最后導(dǎo)致了單株果莢數(shù)、果莢長(zhǎng)度和種子數(shù)量均嚴(yán)重降低。但關(guān)于AtMAD2表達(dá)量增高造成植物育性下降的內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。結(jié)合已有的研究可以得出，MAD2確實(shí)是影響花粉發(fā)育的關(guān)鍵基因，但在文心蘭不可育品種‘檸檬綠’中表達(dá)量低于可育品種，而在擬南芥中則相反，其表達(dá)量在野生型中低于育性低的株系。

圖5 花粉活力染色率