陳綺梨 常藕琴 張德峰 任燕 石存斌

摘要：【目的】明確引起佛山市三水某水產(chǎn)種苗有限公司育種基地加州鱸（Micropterus salmonoides）體表出血和潰爛的病原菌，并進行藥物敏感性分析，為該病的臨床診斷及科學(xué)防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)細菌分離方法從患病加州鱸的肝臟、脾臟和腎臟等組織中分離病原菌，經(jīng)革蘭氏染色和磷鎢酸負染后，使用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)及其染色特性;通過ATB Expression生化鑒定儀和Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)進行生理生化特性鑒定，基于16S rRNA序列和gyrB基因序列進行分子生物學(xué)鑒定，經(jīng)人工回歸感染試驗和組織病理學(xué)觀察進一步確定病原菌的致病性及其對組織細胞的損傷，同時以K-B紙片擴散法測定其藥敏特性?！窘Y(jié)果】從患病加州鱸肝臟中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（180803bj_jzl），為周鞭毛的革蘭氏陰性桿菌，Biolog微生物系統(tǒng)自動鑒定其為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）的可能性高達99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹均顯示，分離菌株180803bj_jzl與弗氏檸檬酸桿菌聚類為一支，與GenBank已公布弗氏檸檬酸桿菌參考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性則在91.00%以上。人工回歸感染7 d內(nèi)的累積死亡率達60%，臨床癥狀與自然發(fā)病加州鱸的癥狀基本相同;其肝臟組織中央靜脈和肝竇有紅細胞淤積，肝細胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡，呈散在變性壞死;脾臟的白髓與紅髓分界不清，脾竇和脾小血管內(nèi)有嗜鐵血紅素中心;鰓小片上皮細胞與毛細血管分離，呈球拍狀，部分上皮細胞壞死脫落，只殘存少量鰓小片骨架。分離菌株180803bj_jzl對氟羅沙星、氧氟沙星、大觀霉素、新霉素、慶大霉素、恩諾沙星和諾氟沙星等7種抗菌藥物敏感，對多西環(huán)素、四環(huán)素、乙酰螺旋霉素、羅紅霉素、頭孢氨芐和阿莫西林等15種抗菌藥物已產(chǎn)生耐藥性?！窘Y(jié)論】弗氏檸檬酸桿菌感染可引起加州鱸體表出血和潰瘍，且具有較強的毒力，致使肝臟、脾臟和鰓等組織病理損傷，實際生產(chǎn)中可選用新霉素和恩諾沙星等漁用抗菌藥物進行防治。

關(guān)鍵詞：? 加州鱸;弗氏檸檬酸桿菌;分離鑒定;耐藥性

中圖分類號： S943.211? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0465-10

Abstract： 【Objective】The California perch （Micropterus salmonoides） broke out with surface hemorrhage and ulceration at the breeding base of an aquatic seedling company in Sanshui， Foshan. The pathogenic bacteria and drug sensitivity were clarified， which provided scientific evidence for the clinical diagnosis and scientific prevention and control of the disease. 【Method】The pathogenic bacteria were isolated from the tissues of diseased M. salmonoides， such as the liver， spleen， kidney， by using conventional bacterial isolation methods. After Gram staining， phosphotungstic acid staining， observation of morphology and staining characteristics of bacteria using optical microscope and transmission electron microscope was conducted. ATB Expression biochemical identification instrument and Biolog Microbes Automatic Identification System were used to identify the physiological and biochemical characteristics， and molecular biology identification was conducted based on 16S rRNA sequence and gyrB gene sequence. The artificial regression test and histopathology analysis were applied to further determine the pathogenicity of the bacteria and tissue damage， and its antibiotic susceptibility was tested by Kirby-Bauer disc diffusion. 【Result】A dominant strain 180803 bj_jzl was isolated from the liver of diseased M. salmoides. It was gram-negative rod-shaped bacteria with periflagellum. The biochemical characteristics were identified as the same as Citrobacter freundii up to 99.4 % by the Biolog Microbes Automatic Identification System. Phylogenetic tree based on homology of 16S rRNA and gyrB gene sequences revealed that isolated strain 180803bj_jzl clustered with the same branch of C. freundii. The 16S rRNA sequence similarity with the reference strains of C. freundii published by GenBank was more than 99.00%， and the similarity of the gyrB gene sequence was more than 91.00%. The cumulative mortality rate within 7 d of artificial recurrent infection was 60%， and its symptoms were basically the same as those of naturally-occurring M. salmoides. There were the erythrocytes congestion in the central vein and hepatic sinusoids of liver tissue， and a large number of vacuoles in the hepatocyte cytoplasm. The degeneration and necrosis were scattered in liver tissue. The white pulp and red pulp had unclear boundaries. And there were ferritinophilic hemoglobin centers in the splenic sinusoids and splenic small vessels. The epithelial cells of the gill lamellae were separated from the capillaries in a racket-shaped manner， and some epithelial cells of the gill lamellae were necrotic and detached， and only a small amount of gill lamellae skeleton remained. The drug sensitivity tests showed that 180803bj_jzl isolate was? sensitive to 7 antimicrobial drugs such as fleroxacin， ofloxacin， macromycin， gentamicin， enrofloxacin and norfloxacin， and resistant to 15 antimicrobial drugs such as doxycycline， tetracycline， acetylcholine， roxithromycin， cefalexin and amoxicillin. 【Conclusion】C. freundii can cause the body surface ulceration of M. salmoides and the histopathological damage to the liver， spleen and gills， and it has strong toxicity. The fishery antibiotics， such as neomycin and enrofloxacin， can be used to prevent and treat the disease in actual production，.

Key words： Micropterus salmoides; Citrobacter freundii; isolation and identification; drug resistance

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD0900102）; 948 Program of Ministry of Agriculture（2016-X57）; Guangzhou Science and Technology Project（201904020004）

0 引言

【研究意義】加州鱸（Micropterus salmonoides）隸屬于鱸形目（Perciformes）太陽魚科（Lepomis）黑鱸屬（Micropterus），是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。據(jù)統(tǒng)計，我國加州鱸養(yǎng)殖總產(chǎn)量已超過37萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，2017）。隨著市場需求量的增加，加州鱸養(yǎng)殖密度不斷加大，其病害也呈逐年增加趨勢。已有研究證實，多種細菌均可感染加州鱸致病，其中鰤諾卡氏菌（Nocardia seriolea）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（A. veronii）和殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）等病原菌可引起加州鱸內(nèi)臟類結(jié)節(jié)、體表出血或潰爛等癥狀，給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟損失（蔣依依等，2012;龍波等，2016;陳榮盛等，2018;葉偉東等，2018）。因此，加強加州鱸病原菌分離鑒定、藥敏試驗及病理組織學(xué)分析，可為其病原學(xué)和病害防治提供理論依據(jù)，同時對保障加州鱸養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）隸屬于腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter），為兼性厭氧菌，廣泛分布于水、土壤和食物等自然界及人類和動物（哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類）的腸道內(nèi)，易引起人類和動物腹瀉、食物中毒及繼發(fā)感染（Trinidade et al.，2010;周加利，2011），是一種典型的人—畜—魚共患條件性致病菌（薛巧等，2015;林威等，2019）。弗氏檸檬酸桿菌可引起紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）（沈錦玉等，2005）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）（Lü et al.，2011）、大鯢（Andrias davidianus）（高正勇等，2012）、中華鱉（Trionyx sinensis）（田飛焱等，2013;蘇英等，2019）、花鰻鱺（Anguilla marmorata）（楊方園等，2013）、鱘（Acipenser）（楊移斌等，2013）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）（胡秀彩等，2014;石征宇等，2018）、烏翅真鯊（Carcharhinus melanopterus）（盧君輝等，2015）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）（張冬星等，2016）、克氏原螯蝦（肖寧等，2016）、巴西龜（Trachemys scripta elegans）（白杰等，2019）及中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（黃曉東等，2019）等水生動物體表局部充血、出血或鰓組織充血等癥狀，且近年來呈危害動物種類增多、危害程度逐年加重的變化趨勢。此外，弗氏檸檬酸桿菌對抗生素的敏感性因感染動物來源不同而存在明顯差異（蘇英等，2019），紅螯螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌對復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素及氯霉素等敏感，對強力霉素、青霉素G、四環(huán)素和紅霉素已產(chǎn)生耐藥性（沈錦玉等，2005）;團頭魴源弗氏檸檬酸桿菌對頭孢噻肟較敏感，對恩諾沙星、卡那霉素及氨芐西林等抗菌藥物存在不同程度的耐藥性（張冬星等，2016）;中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌對新霉素、慶大霉素、鏈霉素、氧氟沙星及恩諾沙星等抗菌藥物高度敏感，對氨芐西林、羧芐青霉素和萬古霉素已產(chǎn)生耐藥性（黃曉東等，2019）。因此，在養(yǎng)殖過程中若發(fā)生細菌性病害應(yīng)及時進行病原菌分離鑒定和藥敏試驗，篩選出敏感藥物有針對性地進行防治?！颈狙芯壳腥朦c】2018年6月廣東省佛山市三水某水產(chǎn)種苗有限公司育種基地大量加州鱸的體表出血和潰爛，發(fā)病死亡率高達50%，經(jīng)濟損失嚴重，亟需明確其病因并采取有效的防治措施。【擬解決的關(guān)鍵問題】對患病加州鱸進行病原菌分離鑒定，并開展人工回歸感染試驗和組織病理學(xué)分析，采用藥敏紙片法檢測病原菌的藥物敏感性，以期為該病的臨床診斷及科學(xué)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病加州鱸采自佛山市三水某水產(chǎn)種苗有限公司育種基地，平均體質(zhì)量約100.0 g，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為體表局部充血、出血和潰爛，鰓組織充血，肝臟充血腫脹，脾臟腫大。健康加州鱸與自然發(fā)病加州鱸為同一苗場的相同品系，平均體質(zhì)量約100.0 g，25 ℃暫養(yǎng)觀察1周，無任何異常癥狀，用于人工回歸感染試驗。

1. 2 病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

無菌操作下采集患病加州鱸的肝臟、脾臟和腎臟，組織取樣接種于血平板培養(yǎng)基和BHI瓊脂培養(yǎng)基上。28 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取優(yōu)勢菌落進行純化，結(jié)果從發(fā)病瀕死加州鱸肝臟中分離獲得編號為180803bj_jzl的純化菌株，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以滅菌生理鹽水將純化菌株制成菌懸液，經(jīng)革蘭氏染色和磷鎢酸負染后，分別用Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡和HT7700型Hitachi透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)及其染色特性。

1. 3 病原菌生理生化特性鑒定

取200 μL菌懸液（1.5×108 CFU/mL），加入7 mL硫酸銨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，取樣加至Bio Mereux ID 32 GN革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒的鑒定試劑條孔中，28 ℃培養(yǎng)24 h，采用ATB Expression生化鑒定儀判讀結(jié)果。同時取Biolog微生物自動鑒定標準試劑盒IF-A接種液，移入Biolog濁度儀中，調(diào)整其讀數(shù)為100%T（期望值）;用無菌棉簽蘸取適量單菌落接種至接種液中，使?jié)岫葍x讀數(shù)維持在92%T～98%T（期望值），每孔100 μL，移至GENⅢ鑒定板，28 ℃培養(yǎng)24 h，Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)讀取鑒定結(jié)果。

1. 4 16S rRNA和gyrB基因擴增測序及系統(tǒng)發(fā)育進化分析

采用細菌基因組提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，以通用引物（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增16S rRNA序列，并以引物[F：5'-GAAGTCATCAT GACCGTTCTGCA（C/T）GC（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）AA（A/G）TT（C/T）GA-3'和R：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC（A/G）TC（A/G/C/T）AC（A/G）TC（A/G/C/T）GC（A/G）TC（A/G/C/T）GTCAT-3']擴增gyrB基因（龍波等，2016）。PCR反應(yīng)體系50.0 ?L：DNA模板1.0 ?L，上、下游引物各1.0 ?L，Master Mix 45.0 ?L，滅菌去離子水補足至50.0 ?L。擴增程序：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行35個循環(huán)，72 ℃延伸40 s。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果通過GenBank檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm1nih.gov/Blast.cgi/）中的BLAST進行序列同源比對分析，并以MEGA 6.0中的鄰接法（Neighobor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 5 人工回歸感染試驗及病理組織學(xué)觀察

將分離菌株180803bj_jzl接種至BHI液體培養(yǎng)液中，28 ℃搖瓶（200 r/min）振蕩培養(yǎng)18 h，3000×g離心20 min，收集菌體，采用McFarland比濁法結(jié)合平板菌落計數(shù)法測定細菌濃度，并稀釋成1×109 CFU/mL的菌懸液。取10倍稀釋的菌懸液（1×108 CFU/mL）浸泡感染10尾健康加州鱸，以等體積PBS浸泡的10尾加州鱸為對照。感染組和對照組的健康加州鱸均浸泡30 min，然后置于28 ℃水族箱繼續(xù)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄加州鱸的死亡情況。取臨床癥狀明顯的發(fā)病加州鱸再次進行病原菌分離，剖檢觀察內(nèi)臟病變，采集肝臟、脾臟和鰓組織，4 ℃下以4%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，RM-2145型Leica輪轉(zhuǎn)式切片機連續(xù)切片（厚度3～5 μm），HE染色，顯微鏡觀察并攝影。

1. 6 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，將培養(yǎng)獲得的分離菌株180803bj_jzl制成1×108 CFU/mL菌懸液，取1 mL均勻涂抹在MH瓊脂培養(yǎng)基上，然后用無菌鑷子將25種抗菌藥物的藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）貼于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，28 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h后測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會（NCCLS）標準判定分離菌株180803bj_jzl對藥物的敏感性（Wayne，2016）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

分離菌株180803bj_jzl在BHI瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形、中間隆起、邊緣整齊、表面光滑。革蘭氏染色陰性，短桿狀，兩邊鈍圓（圖1）。透射電子顯微鏡觀察到分離菌株180803bj_jzl呈短桿狀、兩端鈍圓，菌體大小約1.5 μm×2.7 μm，周鞭毛，無菌毛（圖2）。

2. 2 病原菌的生理生化特性鑒定結(jié)果

ATB Expression生化鑒定儀鑒定結(jié)果（表1）顯示，分離菌株180803bj_jzl利用葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、枸櫞酸鹽、尿素酶、D-山梨醇、酚紅、帕拉金糖及α-半乳酸苷酶等呈陽性，而對葡萄糖苷酶、麥芽糖、賴氨酸脫羧酶、肌醇、尿素及水楊酸等的利用呈陰性，鑒定百分率為99.9%，100%T（期望值）為0.88，無不符試驗，即Bio Mereux ID 32 GN革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒鑒定結(jié)果良好。

Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)的3個重要參數(shù)為可能性（PROB）、相似性（SIM）和位距（DIST）。其中，SIM和DIST表示測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)的匹配程度。當SIM<5.0，DIST>0.75為良好的匹配;SIM越接近于1.0，即鑒定結(jié)果的可靠性越高。本研究的Biolog微生物自動鑒定參數(shù)為：PROB=0.994，SIM=0.760，DIST=4.259，即分離菌株180803bj_jzl為弗氏檸檬酸桿菌的可能性高達99.4%。具體的反應(yīng)項目及鑒定結(jié)果見圖3。

2. 3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以分離菌株180803bj_jzl的DNA為模板，進行16S rRNA序列和gyrB基因PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到1500和1100 bp左右的清晰目的條帶（圖4）。將擴增獲得的16S rRNA序列和gyrB基因在GenBank中進行BLAST同源搜索，分別選取11和10條相似性較高的菌種序列，采用MEGA 6.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹?；?6S rRNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，分離菌株180803bj_jzl與弗氏檸檬酸桿菌和楊氏檸檬酸桿菌（C. youngae）聚類為一支（圖5）;基于gyrB基因序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，分離菌株180803bj_jzl與弗氏檸檬酸桿菌聚類為一支（圖6）。分離菌株180803bj_jzl與GenBank已公布弗氏檸檬酸桿菌參考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性則在91.00%以上（表2）。

2. 4 人工回歸感染試驗及病理組織學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)1×108 CFU/mL菌懸液浸泡感染的加州鱸在浸泡16 h后出現(xiàn)死亡，浸泡第2 d出現(xiàn)的死亡數(shù)量明顯增加，連續(xù)觀察7 d發(fā)現(xiàn)其累積死亡率達60%。死亡加州鱸的癥狀與自然發(fā)病加州鱸的癥狀基本相同（圖7），且從人工感染發(fā)病加州鱸的體內(nèi)再次分離獲得相同的分離菌株。對照組加州鱸在整個試驗期間無任何癥狀，也未發(fā)生死亡現(xiàn)象。

人工回歸感染發(fā)病加州鱸的肝臟中央靜脈和肝竇有紅細胞淤積;肝板排列紊亂，肝細胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡，界限不清晰，有些肝細胞核溶解，呈散在變性壞死;狄氏間隙增寬，細胞萎縮、排列疏松，空隙明顯增大（圖8）。脾臟的白髓與紅髓分界不清，脾索增厚，脾索中免疫細胞增多;脾竇和脾小血管內(nèi)嗜鐵血細胞聚集成嗜鐵血紅素中心;脾竇內(nèi)皮細胞受損，血管壁水腫，通透性增強（圖9）。鰓小片上皮細胞與毛細血管分離，其間充滿水腫液，呈球拍狀，部分上皮細胞壞死脫落;嚴重者整個鰓小片細胞壞死、脫落，只殘存少量鰓小片骨架（圖10）。

2. 5 病原菌的藥敏試驗結(jié)果

由表3可看出，分離菌株180803bj_jzl對氟羅沙星（Fleroxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、大觀霉素（Spectinomycin）、新霉素（Neomycin）、慶大霉素（Gentamicin）、恩諾沙星（Enrofloxacin）和諾氟沙星（Norfloxacin）等7種抗菌藥物敏感;對多西環(huán)素（Doxycycline）、四環(huán)素（Tetracyclines）、乙酰螺旋霉素（Acetylspiramycin）、羅紅霉素（Roxithromycin）、頭孢氨芐（Cefalexin）、阿莫西林（Amoxicillin）、青霉素（Benzylpenicillin）、氨芐西林（Ampicillin）、萬古霉素（Vancomycin）、復(fù)方新諾明（Cotrimoxazole）、磺胺異噁唑（Sulfisoxazole）、氯霉素（Chloroamphenicol）、氟苯尼考（Florfenicol）、利福平（Rifampin）和林可霉素（Lincomycin）等15種抗菌藥物已產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

本研究從發(fā)病瀕死加州鱸肝臟中分離獲得1株純化細菌（180803bj_jzl），其細菌形態(tài)學(xué)觀察為周鞭毛的革蘭氏陰性桿菌;ATB Expression生化鑒定儀結(jié)果顯示為弗氏檸檬酸桿菌，鑒定百分率為99.9%，100%T（期望值）為0.88，無不符試驗，鑒定結(jié)果良好;Biolog微生物自動鑒定參數(shù)為：PROB=0.994，SIM=0.760，DIST=4.259，即分離菌株180803bj_jzl為弗氏檸檬酸桿菌的可能性高達99.4%;再分別基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示分離菌株180803bj_jzl與弗氏檸檬酸桿菌聚類在同一分支上，與GenBank已公布弗氏檸檬酸桿菌參考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性則在91.00%以上。綜合分離菌株180803bj_jzl的形態(tài)學(xué)、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可確定該分離菌株為弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌是人類和動物（哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類）腸道內(nèi)的正常菌群，起初認為是腸道條件致病菌，但近年來發(fā)現(xiàn)其強毒菌株可穿過腸道黏膜向全身擴散，引起動物敗血癥或急性死亡（薛巧等，2015）。本研究通過人工回歸感染試驗，發(fā)現(xiàn)分離菌株180803bj_jzl可致使加州鱸體表局部出血、潰爛，鰓組織充血，肝臟充血、脾臟腫大，與自然發(fā)病的臨床癥狀相似，且可再次分離出相同的菌株，說明分離菌株180803bj_jzl具有較強的致病作用。病理組織學(xué)觀察也顯示，分離菌株180803bj_jzl可致機體組織細胞發(fā)生明顯的病理變化，造成肝臟中央靜脈和肝竇擴張淤血，提示淤血區(qū)局部血液流動緩慢、缺氧，氧合血紅蛋白減少，致使氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，肝細胞物質(zhì)代謝與交換受阻，故肝細胞變性壞死，進而造成肝臟代謝紊亂及其解毒功能降低，致使機體代謝障礙，加速魚體死亡。鰓小片上皮細胞與毛細血管分離，呈球拍狀，可能是弗氏檸檬酸桿菌破壞了鰓組織內(nèi)的磷酸基轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)，鰓細胞的生物能穩(wěn)態(tài)被破壞，細胞自身生理代謝紊亂，鰓小片上細胞脫離血管網(wǎng)（Baldissera et al.，2018）。球拍狀的鰓小片促使上皮細胞與微血管剝離，血液交換功能受阻，上皮細胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致部分上皮細胞變性，嚴重者整個鰓小片細胞壞死、脫落，僅殘存少量鰓小片骨架鰓，致使呼吸功能和排泄功能受阻，其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)損壞造成魚體病變逐漸加重，加速魚體死亡。

弗氏檸檬酸桿菌的藥敏特性隨用藥時間的推移而發(fā)生變化，也因宿主不同而異（沈錦玉等，2005;田飛焱等，2013;盧君輝等，2015;蘇英等，2019），對氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物敏感，對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類抗生素和青霉素類等抗菌藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性。本研究的藥敏感試驗結(jié)果顯示，分離菌株180803bj_jzl對慶大霉素、諾氟沙星和氧氟沙星敏感，與楊移斌等（2013）、盧君輝等（2015）、肖寧等（2016）的研究報道一致，但對氟苯尼考和磺胺甲惡唑等抗菌藥物的敏感性與楊方園等（2013）、張冬星等（2016）、白杰等（2019）的研究結(jié)果存在差異，可能與各地的養(yǎng)殖環(huán)境、細菌寄主及所處地域的用藥習(xí)慣不同有關(guān)（石征宇等，2018）。因此，在養(yǎng)殖過程中若發(fā)生細菌性病害應(yīng)及時進行病原分離鑒定和藥敏試驗，篩選出敏感藥物，為準確有效地進行科學(xué)防治提供科學(xué)依據(jù)。

弗氏檸檬酸桿菌對氟苯尼考和磺胺甲惡唑等抗菌藥物呈逐步向耐藥轉(zhuǎn)化的變化趨勢（張冬星等，2016;白杰等，2019），且已出現(xiàn)多重耐藥性（毛爍君等，2015;肖寧等，2016;石征宇等，2018）。致病菌進化是其自身基因變異與自然環(huán)境選擇相互作用的結(jié)果，耐藥株的出現(xiàn)是在抗生素選擇壓力下發(fā)生多位點突變所致（Roumagnac et al.，2006）。當前的養(yǎng)殖過程中僅考慮疾病治愈效果，尚缺乏用藥科學(xué)依據(jù)而濫用抗菌藥物，為細菌耐藥性變異提供了生態(tài)環(huán)境的選擇壓力（楊瑞馥，2009）。也有研究發(fā)現(xiàn)，細菌可先進化出休眠能力（耐受性），通過進入暫時休眠而免受抗菌藥物的抑菌作用;且細菌獲得休眠的能力可快速進化獲得耐藥性突變，從而抵制抗菌藥物的抑菌作用（Levin-Reisman et al.，2017）。養(yǎng)殖過程中長期頻繁使用或濫用抗菌藥物，致使病原菌長期暴露于含抗菌藥物的生長環(huán)境下，而促進細菌快速進化（de Lencastre et al.，2007;Baldissera et al.，2018），故推測這類細菌的耐藥性還會繼續(xù)增強。因此，在實際生產(chǎn)中需保持水體環(huán)境穩(wěn)定，減少魚體應(yīng)激，同時大力發(fā)展綠色養(yǎng)殖模式并加速研制抗菌藥物替代物，以確保水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

4 結(jié)論

弗氏檸檬酸桿菌感染可引起加州鱸體表出血和潰瘍，且具有較強的毒力，致使肝臟、脾臟和鰓等組織病理損傷，實際生產(chǎn)中可選用新霉素、恩諾沙星等漁用抗菌藥物進行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）