李銘楊，何佳琦，邱爽，于海偉，鄔長(zhǎng)樂，張軍，翟瑩

大豆轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)及干旱脅迫表達(dá)分析

李銘楊1，何佳琦1，邱爽1，于海偉1，鄔長(zhǎng)樂1，張軍2，翟瑩1

（1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

利用生物信息學(xué)的方法對(duì)大豆轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)在干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。位于大豆基因組7號(hào)染色體上，mRNA編碼序列全長(zhǎng)1434bp，編碼含有477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量53.12kDa，等電點(diǎn)5.87，其蛋白序列中含有一個(gè)VOZ-domain。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmVOZ1蛋白是親水性蛋白，無信號(hào)肽，定位在細(xì)胞核內(nèi)。蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，GmVOZ1與苜蓿MtVOZ和擬南芥AtVOZ1親緣關(guān)系較近。啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件和逆境響應(yīng)相關(guān)元件。干旱脅迫處理后，的表達(dá)量升高，最高值約為對(duì)照組的15倍。上述結(jié)果為在大豆抗旱領(lǐng)域的研究提供理論依據(jù)。

大豆；轉(zhuǎn)錄因子；VOZ；干旱脅迫；表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子又名反式作用因子，存在于所有真核生物中。作為一種DNA結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)錄因子能夠與增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等順式作用元件相互作用，實(shí)現(xiàn)激活和抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的功能[1]。調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是提高農(nóng)作物抗性的一種有效方式。維管植物鋅指蛋白（Vascular plant one-zinc finger protein, VOZ）是NAC家族中NAM亞族成員。VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族為高等植物特有，最早被克隆的是擬南芥中的兩個(gè)成員和。在韌皮部特異性表達(dá)，在根部的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，它們都與花粉發(fā)育相關(guān)[2]。后續(xù)研究表明，VOZ轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生物及非生脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。的過量表達(dá)提高了擬南芥植株對(duì)真菌脅迫的抗性，但降低了擬南芥植株對(duì)冰凍和干旱脅迫的抗性[3]。而擬南芥雙突變體的抗寒性則得到增強(qiáng)[4]。菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族同樣以負(fù)調(diào)控的方式參與菠蘿對(duì)高鹽、干旱和低溫脅迫的應(yīng)答[5]。

大豆是全世界廣泛種植的高蛋白作物之一，中國(guó)目前正處于大豆供求失衡的困境之中[6]。干旱作為影響大豆產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素之一，不僅限制了大豆的種植范圍，更嚴(yán)重地影響到了大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前已有大量轉(zhuǎn)錄因子作為抗旱候選基因的報(bào)道。但大豆VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族基因在干旱脅迫方面的研究尚未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)的方法對(duì)大豆進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其在干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，為今后在大豆抗旱領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

大豆“北豆9號(hào)”種子來源于齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室。

1.2 生物信息學(xué)分析

登陸PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載大豆轉(zhuǎn)錄因子的基因序列和蛋白序列。在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)GmVOZ1蛋白的相對(duì)分子量和等電點(diǎn)；在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/）分析GmVOZ1蛋白的疏水性；在線網(wǎng)站SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)GmVOZ1蛋白是否存在信號(hào)肽；在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)GmVOZ1蛋白的亞細(xì)胞定位；在線網(wǎng)站NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下載植物VOZ蛋白序列；MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；在線網(wǎng)站PlantGDB（http://www.plantgdb.org/GmGDB/）中搜索并下載啟動(dòng)子序列；在線網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子中順式作用元件。

1.3 大豆幼苗干旱脅迫處理

選擇飽滿的大豆種子種植在草炭土∶沙土=1∶1的混合物中，待種子萌發(fā)后用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培。至幼苗的第一片三出復(fù)葉葉片全部展開，將其換至含有20% PEG8000的營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行干旱處理。在處理的第0, 1, 2, 5, 10, 24h各取0.1g上述植株的第一片三出復(fù)葉，迅速置于呈有液氮的容器內(nèi)并轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

使用RNAiso Plus（Takara公司）提取樣本總RNA，總RNA經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Novoprotein公司）合成第一鏈cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Primer 5軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)，其中，上游引物5′-TGTGCCTTGTACCGATTGGAACTG-3′，下游引物5′-GTGGAAACTCAGCAGAGAGCCTTC-3′。內(nèi)參選擇大豆的基因（GenBank登錄號(hào)：GMU12286），上游引物5′-GGAAGGCT TTCTTGCATTGGTA-3′；下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′。使用SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（近岸蛋白質(zhì)科技公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，參數(shù)設(shè)置和體系參照張軍等[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的差異顯著性分析采用Student's檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GmVOZ1基因及蛋白序列分析

基因（GenBank登錄號(hào)：XM003529308）位于大豆基因組7號(hào)染色體上，含有3個(gè)內(nèi)含子。序列分析顯示如圖1所示，mRNA編碼序列全長(zhǎng)1434 bp，編碼含有477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量為53.12 kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.87。GmVOZ1蛋白序列中含有一個(gè)VOZ-domain（201-417），此結(jié)構(gòu)域既是VOZ轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也具有蛋白二聚化體的功能，由此證明基因?yàn)閂OZ家族成員[2]。對(duì)GmVOZ1蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果如圖2所示，在該蛋白中，親水性氨基酸所占比例為64.3%，疏水性氨基酸所占比例為35.7%，故該蛋白屬于親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmVOZ1蛋白不含有信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmVOZ1蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)的概率為70.6%，與轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能相符[8]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtVOZ2是受到光的調(diào)控由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中從而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能[9-10]。

圖1 GmVOZ1的核苷酸及氨基酸序列陰影部分代表VOZ-domain；*代表終止密碼子

2.2 VOZ蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

將GmVOZ1蛋白與11個(gè)植物VOZ蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果如圖3所示，大豆GmVOZ1與苜蓿MtVOZ和擬南芥AtVOZ1的親緣關(guān)系最近，與油菜BnVOZ、蘿卜RsVOZ和擬南芥AtVOZ2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此推測(cè)大豆可能與苜蓿和擬南芥的功能存在相似性，而之前的研究已表明與擬南芥的非生物脅迫抗性相關(guān)[4]。

圖2 GmVOZ1蛋白親/疏水性分析

圖3 VOZ蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 GmVOZ1啟動(dòng)子序列分析

對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果見表1。啟動(dòng)子序列中存在3種光響應(yīng)元件（Box 4、G-Box和GT1-motif）、6種激素響應(yīng)相關(guān)元件（ABRE、CGTCA-motif、P-Box、TATC-box、TGACG-motif和TCA-element）和2種逆境響應(yīng)相關(guān)元件（ARE和LTR）。激素響應(yīng)相關(guān)元件和逆境響應(yīng)相關(guān)元件的存在意味著可能作為轉(zhuǎn)錄因子在大豆逆境應(yīng)答中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。此外，通過啟動(dòng)子中光響應(yīng)元件的存在推測(cè)在大豆光調(diào)控應(yīng)答過程中也可能發(fā)揮作用。

表1 GmVOZ1啟動(dòng)子序列順式作用元件預(yù)測(cè)

2.4 GmVOZ1在干旱脅迫下的表達(dá)

以PEG模擬干旱處理0h的大豆幼苗作為對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)基因干旱脅迫下的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，干旱脅迫處理后，基因的表達(dá)量與對(duì)照組（0h）相比顯著升高。在處理2h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高值，約為對(duì)照組的15倍。之后表達(dá)量呈現(xiàn)出下降、升高再下降的趨勢(shì)，且表達(dá)量均高于對(duì)照組。此結(jié)果與經(jīng)干旱處理的水稻葉片中基因的表達(dá)模式相近[11]，但與菠蘿和在干旱脅迫下表達(dá)量下降的結(jié)果不同[5]，表明不同的VOZ基因應(yīng)對(duì)干旱脅迫的機(jī)制存在不同。

圖4 GmVOZ1在干旱脅迫下的表達(dá)

**代表差異達(dá)到極顯著水平（p小于0.01）

3 結(jié)論

基因編碼含有477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量53.12kDa，等電點(diǎn)5.87。GmVOZ1蛋白屬于親水性蛋白，不含信號(hào)肽，定位于細(xì)胞核內(nèi)。GmVOZ1與苜蓿MtVOZ蛋白和擬南芥AtVOZ1親緣關(guān)系較近。啟動(dòng)子中含有多個(gè)光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件和逆境響應(yīng)相關(guān)元件。干旱脅迫處理后，的表達(dá)量升高，能夠響應(yīng)干旱脅迫。

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Bioinformatics and drought stress expression analysis of the soybean transcription factor

LI Ming-yang1，HE Jia-qi1，QIU Shuang1，YU Hai-wei1，WU Chang-le1，ZHANG Jun2，ZHAI Ying1

(1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006, China; 2.Branch of Animal Husbandry and Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Qiqihar 161005, China)

In this study, the soybean transcription factorwas analyzed by bioinformatics, and the expression under drought stress was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.was located on chromosome 7 of soybean genome. The length of mRNA encoding sequence was 1434bp, encoding a protein containing 477 amino acids, with molecular weight of 53.12kDa and isoelectric point of 5.87. The GmVOZ1 protein sequence contained a VOZ-domain. The results of prediction showed that GmVOZ1 was a hydrophilic protein with no signal peptide and localized in the nucleus. Protein phylogenetic analysis showed that GmVOZ1 was closely related to MtVOZ and AtVOZ1. The promoter sequence ofcontained several light-responsive elements, hormone-responsive elements and stress-responsive elements. The expression ofincreased under drought stress, and the highest value was about 15 times that of the control. These results provided a theoretical basis for the study ofin the field of soybean drought resistance.

soybean；transcription factor；VOZ；drought stress；expression analysis

2021-03-25

黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目“植物性食品加工技術(shù)特色學(xué)科專項(xiàng)”（YSTSXK201878）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2020041）；齊齊哈爾市科技計(jì)劃創(chuàng)新激勵(lì)項(xiàng)目（CNYGG-2020009）

李銘楊（1998-），女，黑龍江綏化人，本科，主要從事植物分子遺傳育種研究，879463529@qq.com。

翟瑩（1982-），女，吉林吉林人，教授，博士，主要從事植物分子遺傳育種研究，fairy39809079@126.com。

S565.1

A

1007-984X(2021)05-0072-05