張晨曦，張曉榮，呂晨艷，趙廣華

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京市植物源功能食品重點實驗室，北京 100083）

蝦青素（astaxanthin，AX）屬于葉黃素家族，是一種天然類胡蘿卜素，來源于某些海洋動植物（藻類、酵母、鮭魚、鱒魚、蝦和螃蟹）[1]。AX的每個紫羅蘭酮環(huán)上都含有羥基和酮基，使其具有高抗氧化性[2]。雖然缺乏VA原活性，AX的抗氧化活性比玉米黃質、葉黃素、角黃素、β-胡蘿卜素高10 倍，比α-生育酚高100 倍[3]。由于AX具有顯著的抗氧化活性，其在保護機體免受糖尿病、癌癥、高血壓、神經退行性疾病等方面具有一定的作用[4-5]。然而，AX穩(wěn)定性很差，容易受到如光、熱、氧和溶劑[6-7]等環(huán)境因素的干擾而發(fā)生降解。此外，AX難以被人體消化吸收。為了提高AX的物理穩(wěn)定性和生物利用率，研究人員已經采用了高壓均質化、微通道乳化、脂質體和納米顆粒等多種包埋策略[8]。但目前的方法大都需要嚴苛的環(huán)境條件，同時操作較為繁瑣，且配方和成分受到食品級應用要求的限制，因此仍需要對AX包埋和靶向遞送系統進行改進。

天然籠狀蛋白（如病毒衣殼、來自饑餓細胞的DNA結合蛋白、熱休克蛋白和鐵蛋白）由于其獨特的結構和納米尺寸，在營養(yǎng)物質及藥物的包埋、傳遞和緩釋方面引起了廣泛的關注[9-12]。鐵蛋白是一種主要的鐵儲存蛋白，廣泛分布于人類和許多生物體內[13]。每個鐵蛋白由24 個亞基組成，它們自組裝形成一個外徑為12 nm、內徑為8 nm的中空蛋白籠形結構[14]。鐵蛋白的內腔可以作為合成水溶性、耐熱性和尺寸受限納米顆粒的模板[15]。與其他包埋體系相比，基于人重鏈鐵蛋白（human heavy chain ferritin，HuHF）的納米顆粒有如下優(yōu)點：1）可以在大腸桿菌中高效表達，并可利用其耐熱性輕易純化[16]；2）HuHF納米載體存在于人體內，具有較高的生物相容性和安全性[17]；3）HuHF可以借助其特異性受體——轉鐵蛋白受體1（transferritin receptor 1，TfR1）通過內吞作用進入到人體中[18-19]。迄今為止，一些小分子化合物（如花青素、蘆丁、β-胡蘿卜素）以及鉑類抗癌藥物已經通過pH值調控的蛋白籠解離和重組被包埋在鐵蛋白空腔中[20]。然而，pH值誘導的鐵蛋白解離和重組過程不是完全可逆的，研究表明，只有約60%解聚的亞基能重新組裝成蛋白質納米籠[21]，并且在空心球形結構上會形成孔洞缺陷[22]。近年來，有學者通過在60 ℃下擴展植物鐵蛋白四重軸通道已開發(fā)出一種新的熱處理包埋方法[23]，但并非所有營養(yǎng)素在這種高溫下都能保持其活性。因此，在保持小分子生物活性和鐵蛋白殼結構完整性的同時，建立一種可以在溫和條件下將活性小分子包埋在鐵蛋白納米籠中的方法是十分必要的。

超聲波已廣泛應用于制備納米材料，例如制備納米乳液和含β-胡蘿卜素的酪蛋白納米顆粒[24]，但目前鮮見其應用于制備鐵蛋白包埋體系。本研究利用40 ℃下超聲波處理將AX包埋在HuHF空腔中（圖1），并探究HuHF-AX納米復合物對AX水溶性和光熱穩(wěn)定性的影響。同時利用H2O2誘導HepG2細胞的氧化性損傷模型對HuHF-AX的抗氧化活性進行研究，為AX在食品工業(yè)中的應用提供參考。

圖1 超聲波輔助制備HuHF-AX包埋物的流程圖Fig.1 Process flow chart for the preparation of astaxanthin (AX)encapsulated within the cavity of human heavy chain ferritin (HuHF) by ultrasound treatment

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

反式AX（純度＞90%） 上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（色譜純） 美國西格瑪奧德里奇公司；甲醇（色譜純）天津康科德科技有限公司；二氯甲烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

H-7560B透射電子顯微鏡、BL-206-II高速冷凍離心機日本Hitachi公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；LC-10AT高效液相色譜日本島津公司；MK-20金屬浴 中國杭州奧盛儀器有限公司；Cary 50紫外-可見分光光度計、Cary Eclipse熒光儀美國瓦里安公司；WDPN-08動態(tài)光散射儀 美國Wyatt公司。

1.3 方法

1.3.1 HuHF的分離純化及表征

HuHF的純化參考Masuda等[25]的方法。將HuHF表達質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中。將BL21（DE3）細胞在含有100.0 mg/L氨芐青霉素的500 mL LB培養(yǎng)基中生長，溫度為37 ℃。當菌懸液在600 nm波長處的吸光度達到0.6時，將終濃度400 μmol/L異丙基β-D-硫代半乳糖苷添加到培養(yǎng)基中，誘導蛋白質表達。加入誘導劑后，將培養(yǎng)基在37 ℃下孵育4 h。此后，在4 ℃下以10 000 r/min離心獲得菌體，并用50.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）重新懸浮。超聲處理（超聲功率200 W、時間15 min、間歇時間2 s）后，以10 000 r/min離心裂解液10 min，去除細胞碎片沉淀。上清液在60 ℃下加熱10 min并離心以去除雜蛋白。用飽和度60%硫酸銨進行鹽析，離心后取沉淀，沉淀在50.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中溶解，然后在上述Tris-HCl緩沖液中透析3 次。采用二乙氨基乙基纖維素離子交換層析和Sephacryl S-500凝膠過濾層析對蛋白進行進一步純化得到HuHF。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白質純度，4 ℃下用質量分數15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠在120 V下電泳1.5 h。用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-polyacrylamide gel electrophoresis，native-PAGE）測定HuHF的純度和表觀分子質量，4 ℃下用質量分數4%～20%的梯度聚丙烯酰胺凝膠在120 V下運行3.5 h。電泳結束后將凝膠用考馬斯亮藍R-250染色約1 h，隨后用脫色液進行脫色。采用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。

1.3.2 HuHF-AX包埋物的制備

將反式AX溶于DMSO中，制成1.0 mmol/L的儲備溶液，在4 ℃避光貯存。首先，用超聲?。?00 W、40 ℃）對HuHF（1.0 μmol/L、1.0 mL、pH 8.0）進行預處理30 min，然后在上述HuHF溶液中加入200 μL AX儲備液，HuHF和AX物質的量比為1∶200。超聲處理90 min后，將蛋白溶液放入透析袋中（截留分子質量100 kDa），采用Tris-HCl緩沖液（50.0 mmol/L、pH 8.0）透析3 次，每6.0 h更換一次透析液，以去除游離AX和DMSO。最后，將包埋有AX的HuHF溶液通過0.45 μm親水纖維素膜過濾，然后在4 ℃下儲存。將上述樣品命名為HuHF-AX。另外，以簡單混合的AX和HuHF（HuHF和AX物質的量比為1∶200）作為對照，該樣品被命名為HuHF+AX。

1.3.3 HuHF-AX包埋物理化性質的表征

1.3.3 .1 透射電子顯微鏡觀察

首先將各樣品（0.5 μmol/L、10 μL）置于干凈的封口膜上，然后將碳支持膜覆蓋的銅網正面朝下蓋在樣品上4 min，用濾紙從邊緣吸去多余液體，然后用質量分數2%醋酸鈾酰溶液負染4 min，吸去多余的染液，干燥后用80 kV的透射電子顯微鏡觀察并拍照記錄[26]。

1.3.3 .2 紫外-可見光譜分析

采用Cary 50紫外-可見分光光度計分別測定HuHF、AX、HuHF+AX、HuHF-AX溶液在200～700 nm波長處的紫外-可見光譜，對其光譜進行分析比較。為了利于觀察，HuHF選用1.0 μmol/L進行測定，由于該濃度下HuHF溶液所制得的HuHF-AX中含AX濃度較高，因此為了將AX的吸光度控制在合理的范圍內，將HuHF+AX和HuHF-AX樣品溶液使用Tris-HCl緩沖液稀釋約4 倍體積后進行測定。鑒于AX的水溶性差，將AX以1 mmol/L的濃度溶解于DMSO中制成儲備液，使用50.0 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋為20 μmol/L后進行紫外-可見光譜測定。與Tris-HCl緩沖液相比，最終AX溶液中DMSO的含量可以忽略不計。

1.3.3 .3 鐵的還原釋放分析

先將脫鐵鐵蛋白制備成Fe3+與蛋白物質的量比為800∶1的含鐵鐵蛋白，具體方法如下：將硫酸亞鐵溶于pH 2.0的酸化水中，配制成25 mmol/L的儲備液。向經50 mmol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸（4-morpholinepropanesulfonic acid，MOPS）透析后的HuHF（0.5 μmol/L、1.0 mL、pH 7.5）溶液中滴加FeSO4，每次加1 μL，即每次添加50 Fe3+/蛋白（物質的量比），之后將溶液顛倒混勻，使鐵蛋白和硫酸亞鐵充分接觸，間隔15 min后進行下次滴加，共滴加16 次，即共裝載800 Fe3+/蛋白（物質的量比）。

鐵的還原釋放測定：反應體系（1.0 mL）：0.5 μmol/L HuHF、500 μmol/L菲洛嗪（ferrozine）、0.1 mol/L NaCl、50 mmol/L MOPS及1 mmol/L抗壞血酸。由于Fe2+與菲洛嗪生成的產物[Fe(ferrozine)3]2+在562 nm波長處有紫外吸收，因此可以通過檢測其吸光度的增加來反映體系中Fe2+的釋放情況，按式（1）計算Fe2+濃度，反應在25 ℃下進行。

式中：A為產物吸光度；b為光程/cm；ε為摩爾吸光系數（27.9 mmol/（L·cm））；c為產物濃度/（mol/L）（數值上與Fe2+濃度相等）。

1.3.3 .4 動態(tài)光散射分析

使用WDPN-08動態(tài)光散射儀在25 ℃下監(jiān)測樣品的流體力學半徑。對每個樣品測定3 組數據，每組至少運行15 次。將HuHF溶液與經過40 ℃超聲處理2 h的HuHF溶液通過0.45 μm親水性纖維素膜過濾，然后用動態(tài)光散射儀檢測。

1.3.4 HuHF-AX包埋物的定量分析

采用LC-10AT高效液相色譜對HuHF+AX和HuHF-AX樣品中的AX含量進行定量分析，該系統配備了SPD-10A紫外-可見檢測器和填充VP-ODS C18柱，柱溫為25 ℃。將HuHF-AX樣品（0.5 μmol/L、0.5 mL）用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)至pH 12.0，以便從樣品中釋放AX。隨后用等體積二氯甲烷萃取上述所得溶液。有機溶液經0.22 μm纖維素有機膜過濾，使用甲醇作為流動相洗脫，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為470 nm。HuHF+AX樣品除不經NaOH溶液處理外，其余操作相同。根據AX濃度與峰面積的標準曲線計算HuHF-AX樣品中AX的量，將HuHF+AX樣品中AX的量減去后，得到包埋在鐵蛋白籠中AX的量。

1.3.5 HuHF-AX包埋物的光熱穩(wěn)定性分析

光熱穩(wěn)定性分析方法參考本課題組前期研究[26]。在熱穩(wěn)定性實驗中，用MK-20金屬浴在37 ℃加熱AX、HuHF+AX、HuHF-AX樣品90 min，每10 min取樣一次。采用Cary 50紫外-可見分光光度計，每10 min掃描200～700 nm波長處的紫外-可見光譜，對AX的降解動力學進行研究。為了探索光穩(wěn)定性，室溫下將樣品置于18W/YH白熾燈下20 cm處。通過掃描紫外-可見光譜，以10 min為間隔，在60 min內從200～700 nm范圍內對AX的降解動力學進行研究。由于AX的水溶性差，將AX以1 mmol/L的濃度溶解于DMSO中，用50.0 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋至20 μmol/L作為對照。實驗平行重復3 次。

1.3.6 HepG2細胞活力檢測

HepG2細胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加體積分數10%胎牛血清和體積分數1%雙抗的DMEM（高糖）培養(yǎng)基。每隔一天更換一次培養(yǎng)基。用細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）測定細胞活力，該方法基于測定活細胞通過線粒體脫氫酶裂解四唑鎓鹽的能力來反映細胞的存活率[27-28]。設置添加培養(yǎng)基但沒有加入細胞的孔作為空白組，以僅使用培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的細胞為對照組。對數期細胞以5×103個/孔的密度接種在96 孔板中。在37 ℃培養(yǎng)12 h后，用游離AX、HuHF+AX和HuHF-AX（AX終濃度為5.0 μmol/L）在37 ℃孵育24 h（同時設置H2O2組，即不加AX、HuHF+AX和HuHF-AX處理），然后吸棄孔內液體，在37 ℃下用200 μmol/L H2O2處理12 h，加入CCK-8溶液（10 μL/孔），并進一步孵育30 min。用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度，按式（2）通過對照組與實驗組的吸光度計算細胞存活率，實驗平行重復6 次。

式中：As、Ab和Ac分別為實驗組（H2O2組）、空白組和對照組在450 nm波長處的吸光度。

1.4 數據處理與分析

利用Origin 8.0軟件對所有數據進行處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 HuHF-AX納米顆粒的鑒定與表征結果

如圖2所示，Native-PAGE圖中顯示兩條帶，440 kDa附近條帶為HuHF的單聚體條帶（24 個亞基），當蛋白濃度較高時會出現鐵蛋白二聚體條帶，即669 kDa處的條帶，表明該蛋白已純化至均一。SDS-PAGE結果表明，該蛋白的亞基分子質量約為21.0 kDa，與文獻[26]報道的HuHF的電泳圖條帶一致，可用于后續(xù)的實驗。

圖2 HuHF的Native-PAGE（A）與SDS-PAGE（B）圖譜Fig.2 Native-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (A) and SDS-PAGE (B) patterns of HuHF

采用紫外-可見分光光度法對HuHF-AX樣品進行了研究。如圖3所示，HuHF和其他蛋白質一樣，在280 nm波長處有最大吸收峰。HuHF-AX溶液不僅在280 nm波長處有吸收峰，而且在455 nm波長處有一個新的吸收峰，這是AX的特征吸收峰，表明AX分子經超聲處理后由于和鐵蛋白發(fā)生作用已成功包埋于蛋白溶液中。另外，從各樣品溶液表觀圖可以看出，HuHF溶液呈無色透明，而AX水溶性差，溶于緩沖液后為渾濁液。HuHF與AX簡單混合后制得的樣品HuHF+AX呈現橘色，表明AX可能少量附著于鐵蛋白表面，與HuHF+AX相比，HuHF-AX溶液呈干凈透明的紅色，紫外吸收峰強度也明顯高于HuHF+AX。上述結果表明，HuHF-AX樣品中AX被成功包埋在蛋白空腔中，且包埋可以很大程度上提高其在水中的溶解度。此外，與游離AX以及HuHF+AX相比，在HuHF-AX樣品中AX的最大吸收峰發(fā)生紅移，這可能是位于HuHF內表面的氨基酸殘基與AX分子之間產生強烈的相互作用所致。

圖3 HuHF、AX、HuHF+AX和HuHF-AX溶液的表觀圖和紫外-可見光譜掃描圖Fig.3 Visual appearance and UV-Vis spectra of HuHF alone, free astaxanthin, HuHF＋AX and HuHF-AX

為了確定AX是否被成功包埋在HuHF的內腔中，利用透射電子顯微鏡觀察了樣品的微觀形貌。醋酸鈾酰負染色后，因為鈾通過鐵蛋白通道流入HuHF空腔，因此單獨的HuHF會顯示許多含鈾的核（圖4A）。由圖4B可知，當AX與HuHF以物質的量比200∶1簡單混合后得到的蛋白質樣品（HuHF+AX）顯示出與HuHF幾乎相同的含鈾核，表明沒有AX分子擴散到鐵蛋白腔中。而40 ℃超聲處理后得到的HuHF-AX包埋物內部空腔卻沒有鈾核（圖4C）。這是因為AX分子首先占據鐵蛋白內腔，從而阻止乙酸鈾酰進入內腔。上述結果表明，40 ℃超聲處理的方法可以將AX包埋在鐵蛋白的空腔中。AX分子被包裹在HuHF的內腔中后基本不會再擴散出去，因為AX的分子尺寸（長29.5 ?、寬4.7 ?）大于鐵蛋白通道的孔徑（3～4 ?）[25]。

圖4 HuHF（A）、HuHF＋AX（B）和HuHF-AX（C）的透射電子顯微鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopic images of HuHF (A),HuHF + AX (B) and HuHF-AX (C)

蛋白的鐵釋放特性是反映鐵蛋白通道微環(huán)境變化的重要指標。已有文獻報道，鐵蛋白通道對于環(huán)境條件變化敏感，如高靜水壓、脈沖電場等[29-30]。為了闡明AX分子在超聲輔助作用下擴散到鐵蛋白空腔中的原因，本研究比較了在40 ℃超聲作用和未超聲作用下VC誘導的含鐵鐵蛋白釋放鐵的速率，結果如圖5所示，超聲作用下鐵蛋白釋放鐵的速度明顯快于未超聲作用下鐵蛋白釋放鐵的速度，這表明超聲可能會擴大鐵蛋白的通道，從而使鐵離子更快地從鐵蛋白腔中擴散出去。同時，據動態(tài)光散射結果可知，超聲處理后的鐵蛋白納米籠具有和未超聲處理的鐵蛋白幾乎相同的流體動力學半徑（7.52 nm）（圖6）。該結果說明40 ℃超聲處理并不能破壞鐵蛋白的籠形結構，不會使鐵蛋白解離成亞基。電泳結果也表明，40 ℃超聲處理2 h不會影響鐵蛋白的結構（圖2）。因此，可以推測超聲改變了HuHF的通道大小，從而使得AX分子可以擴散到鐵蛋白腔中。

圖5 抗壞血酸誘導不同處理的HuHF（Fe3＋與蛋白物質的量比為800∶1）釋放鐵的動力學Fig.5 Kinetics of iron release from HuHF (molar ratio of iron to protein 800:1) with different treatments induced by ascorbic acid

圖6 40 ℃超聲處理2 h對HuHF的影響Fig.6 Effect of ultrasound treatment at 40 ℃ for 2 h on HuHF

2.2 HuHF-AX納米顆粒的定量分析結果

AX的高效液相色譜圖如圖7所示，保留時間約為5.06 min。AX溶于二氯甲烷的標準曲線在濃度為20～100 μmol/L（R2＝0.998）時呈良好的線性關系。在扣除表面結合的AX后，得到每個鐵蛋白分子可以將39.6 個AX分子包裹在其空腔中，其包埋率為19.8%。AX的水溶性可達到40 μmol/L（0.024 mg/mL）。研究表明，20 μmol/L的AX就可以起到顯著清除自由基以及抑制脂質過氧化的作用[31]。另外，AX作為抗氧化劑的推薦劑量為3～5 mg/d，用于降血脂需要10～12 mg/d。因此，本實驗所制得的AX樣品足以滿足日?？寡趸枨?，可以用于功能性食品及保健品的制備。

圖7 AX的高效液相色譜圖Fig.7 Typical HPLC chromatogram of astaxanthin

2.3 AX的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性分析結果

HuHF外殼由于緊密堆積而非常穩(wěn)定，能夠在80 ℃加熱10 min而不發(fā)生變性[32]。相比之下，AX很容易因加熱和光照而降解，導致其活性喪失[7]。為了探究將AX分子包埋在鐵蛋白的空腔中能否提高其熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，檢測了37 ℃加熱及白熾燈光照處理后AX的保留率。從圖8A的AX紫外-可見光譜可以看出，隨著處理時間的延長，455 nm波長處的峰強度降低，且伴隨著紅移，表明分子降解或異構化。AX與鐵蛋白進行簡單混合后，雖然結合在蛋白表面可以減少其降解，但加熱處理90 min后降解率也達到了7%（圖8D）。相反，HuHF-AX樣品中的AX幾乎不發(fā)生降解（圖8D），可以耐受較長時間的熱處理。游離AX的降解遵循一級反應模型，如式（3）所示。決定系數R2＝0.997，這表明AX的降解率與處理時間有很好的相關性。這一結果與前人報道的色素降解動力學結果[33-34]一致。

圖8 加熱處理對AX穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of heat treatment on the stability of astaxanthin

式中：c表示不同時間的AX濃度/（mmol/L）；cf是處于平衡狀態(tài)的AX濃度/（mmol/L）；c0是初始時的AX濃度/（mmol/L）；k是反應速率常數/min－1；t是反應時間/min。

經曲線擬合可得，游離AX的降解速率常數為（0.027 0±0.002 2）min－1，半衰期為25.71 min。在37 ℃下加熱90 min后，AX降解率達到45%。相比之下，HuHF-AX樣品中的大多數AX分子在加熱過程中保持穩(wěn)定，在相同的實驗條件下，只有3%的AX分子被降解。結果表明，鐵蛋白殼狀結構能更有效地保護AX免受熱降解。

此外，AX是一種光敏分子，容易被光氧化過程漂白，導致分子失活，失去功能性、感官性和營養(yǎng)性。既然鐵蛋白可以提高AX分子的熱穩(wěn)定性，故推測也可能提高其光穩(wěn)定性。為了驗證這一假設，在室溫下研究了樣品在白熾燈下的光降解動力學。游離AX在455 nm波長處的吸光度隨光照時間的延長而降低，同時伴隨著紅移現象（圖9A）。光降解的動力學數據適用于上述一級反應模型，曲線擬合得到，游離AX的降解速率常數為（0.059 2±0.004 4）min－1，半衰期（t1/2）為11.70 min。而在相同時間（11.70 min）下，HuHF-AX樣品中AX的濃度只下降了不到1%。經過60 min的處理，游離AX降解率達到31%，HuHF+AX溶液中的AX降解了10%，而HuHF-AX溶液中的AX只降解了3%（圖9D）。因此，與游離AX以及結合在蛋白表面的AX相比，包埋在HuHF內腔中的AX具有更好的光穩(wěn)定性。這一結果與前人關于花青素包埋結果[35]一致。

圖9 光照處理對AX穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of light treatment on the stability of astaxanthin

上述觀察到的與鐵蛋白相關AX分子穩(wěn)定性的增強可能是由3 個原因引起的。一是通過對鐵蛋白的氨基酸序列進行分析發(fā)現鐵蛋白含有半胱氨酸殘基和其他功能基團，它們可以通過螯合過渡金屬或作為自由基清除劑起到有效的抗氧化作用[36]；二是鐵蛋白可能通過氫鍵、范德華相互作用和疏水力與AX形成分子復合物，從而保護AX分子不被降解；三是鐵蛋白本身具有非常好的穩(wěn)定性，它的球狀外殼可以作為隔離溫度和光照的物理屏障[37]。然而，具體的保護機制還有待進一步研究。

2.4 不同處理對H2O2誘導的HepG2細胞活力影響

如圖10所示，與對照組相比，用200 μmol/L的H2O2刺激HepG2細胞12 h，細胞存活率下降約40%，表明氧化應激模型構建成功。游離AX組的存活率無明顯提高，經HuHF+AX預處理后，細胞存活率有所提高。經HuHF-AX預處理后，細胞存活率明顯提高，幾乎恢復到對照組水平，說明HuHF-AX可以保護HepG2細胞免受H2O2誘導的氧化損傷。HuHF-AX對HepG2細胞的保護作用可能是因為：1）HuHF通過TfR1與細胞特異性結合并進入細胞內，AX在溶酶體中逐漸從HuHF納米籠中釋放出來，隨后轉入細胞核并起到保護作用[19,38]；2）HuHF蛋白外殼可以作為物理屏障，保護AX在進入HepG2細胞前不被降解。

圖10 AX對H2O2誘導的HepG2細胞活力的影響Fig.10 Effect of astaxanthin on H2O2-induced HepG2 cell viability

3 結 論

AX因其具有多種生物活性而備受關注，但其較差的水溶性和穩(wěn)定性限制了其應用。本研究通過超聲輔助策略，在溫和條件下高效地將AX包埋在鐵蛋白納米籠中。與已報道的方法相比，該方法具有兩個優(yōu)點：1）包埋過程中，鐵蛋白結構保持良好，幾乎沒有蛋白質變性發(fā)生；2）40 ℃下超聲處理條件較為溫和，不會嚴重破壞AX等生物活性小分子的活性，且AX的水溶性和光熱穩(wěn)定性均可得到顯著改善。此外，與游離AX相比，包埋物能極顯著抑制H2O2誘導的HepG2細胞活力下降。該方法可用于鐵蛋白對一系列pH值敏感、水溶性差的生物活性分子的包埋，所得溶液具有透明、色澤鮮艷的特點，有利于AX在食品工業(yè)中的應用。