王 娟，曹龍奎,2,，魏春紅，王維浩,2，趙姝婷，劉德志，全志剛，王一飛，武云嬌，蘇有韜，張東杰,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

小米作為我國的傳統(tǒng)谷物，營養(yǎng)價值高、易消化，且對人體胃腸疾病具有較強的調養(yǎng)作用[1]。膳食纖維作為小米中一種較強的功能性成分，具有助消化、抗脂肪肝、預防肥胖等功效[2]。根據(jù)美國谷物化學家協(xié)會的定義，膳食纖維是一種在人體小腸抗消化、吸收，在大腸完全或部分發(fā)酵的植物可食用組織或相似碳水化合物[3]。根據(jù)其溶解性，膳食纖維可分為水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和水不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[4]，其中SDF在促進腸道蠕動、減少肥胖、胃腸疾病預防等方面均優(yōu)于IDF[5-6]。但由于膳食纖維具有黏滯性、結合有機化合物的特點，因此若胃腸疾病患者不能掌握適當?shù)臄z入量，則容易對腸黏膜產(chǎn)生不良刺激，引起腹脹，導致人體某些營養(yǎng)素（如無機鹽中的鈣、鐵、鋅以及脂溶性維生素VA等）的不足甚至缺乏[7]，某些疾病例如糖尿病患者需適量補充膳食纖維[8]，但若患者胃腸功能較弱則不宜食用膳食纖維[9]。

相關研究表明，對多糖進行適當?shù)姆肿有揎棔苟嗵钱a(chǎn)生新的活性或者增強其原有的生物活性[10]。硒元素作為人體的必需微量元素，對人體健康起著重要的作用，具有抗氧化、抗衰老、提高機體免疫以及抗癌的能力[11]。適量地攝入硒有益人體健康，但我國很多地區(qū)存在硒攝入不足的問題，富硒食品的開發(fā)有益國民健康。自然界中的硒大多以無機硒存在，其對人體具有一定的毒副作用，且吸收率低，而有機硒毒性小、安全指數(shù)高、體內轉化率高[12]，但有機硒種類少、含量低，且穩(wěn)定性差[13]。硒多糖作為一種良好的有機硒來源，可根據(jù)人體需求進行動態(tài)的儲存和緩釋，以達到機體補硒的目的[14]，但是天然硒多糖在自然界中存在較少，而且它的硒含量通常較低[15]，通過生物轉化生產(chǎn)硒多糖的方法又耗時較長[16]。Huang Shiyu[17]和Kaleta[18]等研究發(fā)現(xiàn)硒元素與多糖的結合不僅可以降低無機硒的毒性，還可以增加多糖的生物活性，所以高效、高硒含量的硒多糖人工合成方法越來越受到矚目。

色氨酸作為人體必需氨基酸[19]，在各種生物過程中起著重要作用[20-21]。膳食纖維在胃腸道炎癥治療方面具有一定的作用效果[22]，有研究表明，色氨酸是炎癥和免疫的重要調節(jié)因子，同樣對炎癥性腸道疾病具有一定的治療作用[23-24]。Islam等[25]通過在飲食中添加色氨酸研究其是否對葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎有保護作用，研究結果表明色氨酸可作為一種有前途的預防劑治療潰瘍性結腸炎。因為人體不能自身合成色氨酸，主要通過膳食攝入或者藥物補充[26]，但膳食攝入所提供的色氨酸含量較低，藥物補充會產(chǎn)生一定的副作用[27]。色氨酸和膳食纖維均對炎癥性胃腸病有一定治療作用，故以膳食纖維為原料生產(chǎn)色氨酸或將膳食纖維與色氨酸聯(lián)合用于改善或治療炎癥性胃腸疾病具有一定的研究價值。

本實驗以小米為原料，對其中的SDF進行研究，膳食纖維屬于多糖中的一種，可利用硝酸-亞硒酸鈉法對SDF進行修飾，得到小米硒化水溶性膳食纖維（selenium modified soluble dietary fiber，Se-SDF），并對其修飾工藝進行優(yōu)化；采用凝膠滲透色譜法、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、X射線衍射儀分別測定修飾前后分子質量、顆粒形態(tài)、官能團、結晶度的變化；以SDF、IDF、Se-SDF等為碳源進行體外發(fā)酵實驗，考察其促進腸道菌群產(chǎn)色氨酸的能力及修飾前后SDF的體外抗氧化活性，為今后的工業(yè)生產(chǎn)及功能性食品的研究開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

小鼠為5～6 周齡、體質量18～20 g的SPF級雌性昆明小鼠，由長春易思實驗動物科技有限公司提供。

小米為‘東方亮'，由山西省東方亮生命科技有限公司提供，其顆粒飽滿均勻、色金黃、無霉爛碎米。

中性蛋白酶（水解酶類，活力6×104U/mL）、耐高溫α-淀粉酶（水解酶類，活力4×104U/mL）、淀粉葡萄糖苷酶（水解酶類，活力10×104U/mL） 美國Sigma-Aldrich公司；色氨酸標準品 上海楚定分析儀器有限公司；透析袋 天津市大茂化學試劑廠；抗壞血酸（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純；羥自由基測定試劑盒、總抗氧化能力試劑盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

GDE-CSF6膳食纖維測定儀 意大利VELP公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；LC20+RID20A凝膠滲透色譜儀 日本島津公司；D8 ADVANCE X射線粉末衍射儀 德國布魯克公司；SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Specord 210 plus紫外可見分光光度計 德國DeChem-Tech.GmbH公司；DB-1A數(shù)顯恒溫電熱板 常州市英格爾儀器制造有限公司；真空冷凍干燥機 基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米SDF的制備

稱取10 g的小米，經(jīng)粉碎后過60 目篩，得到小米粉。用濾紙將小米粉包成小藥包，用100 mL石油醚于60 ℃條件下冷凝回流4 h進行脫脂處理，脫脂結束后放入通風櫥自然干燥，得到脫脂小米粉，備用。

稱取5 g脫脂小米粉加入125 mL蒸餾水、250 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6、0.08 mol/L），依次經(jīng)耐高溫α-淀粉酶（95 ℃、30 min）、中性蛋白酶（60 ℃、30 min）、淀粉葡萄糖苷酶（60 ℃、30 min）進行酶解，滅酶（100 ℃、20 min），過濾，濾渣為小米IDF，得到的濾液濃縮后，用4 倍體積的95%（體積分數(shù)）乙醇溶液醇沉、離心、干燥得粗小米SDF。

1.3.2 粗小米SDF的純化

采用Sevag法去除蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）＝1∶5配制Sevag試劑。準確稱取粗小米SDF 0.50 g，加蒸餾水溶解、定容至100 mL，加入20 mL Sevag試劑，振搖10 min，離心（5 000 r/min、10 min），收集水相。向水相中加入20 mL Sevag試劑，再次進行上述振搖、離心、收集水相操作，上述步驟反復10 次以上。將最后一次收集的水相用體積分數(shù)5%的氨水調節(jié)pH值8.5左右，加入50 mL質量分數(shù)30%雙氧水，40 ℃保溫60 min脫色，然后60 ℃條件下旋轉蒸發(fā)除去有機試劑，得到約20 mL小米SDF溶液。將小米SDF溶液裝入截留分子質量為3 500 Da透析袋，自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析后，將溶液旋轉蒸發(fā)濃縮至原溶液體積的1/3，加入4 倍體積的體積分數(shù)95%的乙醇溶液，于4 ℃冰箱中醇沉過夜，棄去上清液，再離心分離（5 000 r/min、10 min），沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌兩次，冷凍干燥至恒質量，即得小米SDF，備用[28]。

1.3.3 小米Se-SDF的制備

1.3.3 .1 單因素試驗

參考文獻[29]進行小米Se-SDF的制備。稱取500 mg小米SDF加入三角瓶中，緩慢滴加50 mL體積分數(shù)0.5%的HNO3溶液，邊加邊攪拌，使之完全溶解。加入不同質量（0.5、0.65、0.75、0.9、1.2、1.5 g）氯化鋇，滴加不同體積（2、4、6、8、10 mL）5 mg/mL亞硒酸鈉溶液，于不同溫度（20、30、50、70、90 ℃）下攪拌反應不同時間（2、4、6、8、10 h）。反應液冷卻后，用質量分數(shù)20%的碳酸鈉溶液調節(jié)pH值至5～6，加入一定量硫酸鈉固體粉末除去鋇離子，5 000 r/min離心10 min，取上清液用流水透析除去亞硒酸鈉。每6 h取少量透析液，加入抗壞血酸固體粉末檢測游離亞硒酸鈉殘留量，無紅色時停止透析。將透析袋內溶液減壓蒸餾至10～20 mL，用蒸餾水透析24 h除鹽，透析液經(jīng)真空冷凍干燥得小米Se-SDF，并測定Se-SDF得率和硒含量。進行單因素試驗時，固定的條件為：氯化鋇質量0.65 g、亞硒酸鈉溶液體積4 mL、反應溫度50 ℃、反應時間6 h。

1.3.3 .2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結果，選擇不同反應溫度、反應時間、5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量、氯化鋇添加量這4 個因素進行進一步優(yōu)化，每個因素選取3個水平進行L9（34）正交試驗，試驗因素水平設計如表1所示。以Se-SDF得率和硒含量為指標，每組試驗重復3 次。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.4 小米Se-SDF中硒含量的測定

1.3.4 .1 硒標準曲線的繪制

參考文獻[30-31]，精確量取100 μg/mL硒標準溶液（Se單質溶液）0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL離心管中，每管均加入質量分數(shù)為37%的濃鹽酸1 mL，定容至10 mL，混勻。取2 mL待測溶液，加入6 mL蒸餾水，用1.0 mol/L鹽酸溶液調至pH值2～3，然后加入4 mL質量分數(shù)2%的鄰苯二胺溶液，放置暗處反應20 min；用質量分數(shù)5%的NaOH溶液調節(jié)至中性，加入5 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，吸取甲苯層測定其在334 nm處吸光度，繪制標準工作曲線。標準曲線回歸方程為y＝0.043 6x+0.006 2，R2＝0.994 5，y為標準溶液在334 nm處吸光度，x為硒質量濃度/（μg/mL）。

1.3.4 .2 小米Se-SDF硒含量的測定

參考文獻[32]，進行小米Se-SDF硒含量的測定。稱取50 mg小米Se-SDF放入三角瓶中，加入3 mL混合酸（質量分數(shù)68%濃硝酸和質量分數(shù)70%高氯酸體積比為4∶1）浸泡12 h，然后用電熱板加熱消解至消化液出現(xiàn)淺棕色，冷卻至室溫；加入0.50 mL質量分數(shù)為30%的雙氧水，加熱至出現(xiàn)白煙后，冷卻至室溫；加入10 mL蒸餾水沖洗瓶壁，加熱溶液至剩余體積為1～2 mL，再用混酸（6 mol/L的硝酸和質量分數(shù)70%高氯酸體積比為4∶1）定容至10 mL待測。取2 mL待測溶液，加入6 mL蒸餾水，用1.0 mol/L鹽酸溶液調至pH值2～3，然后加入4 mL質量分數(shù)2%的鄰苯二胺溶液，放置暗處反應20 min；用質量分數(shù)5%的NaOH溶液調節(jié)至中性，加入5 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，吸取甲苯層測定其在334 nm波長處的吸光度，按照1.3.4.1中標準曲線回歸方程計算甲苯層中硒的質量濃度，按公式（1）計算樣品中硒含量。

式中：ρ為甲苯層中硒的質量濃度/（μg/mL）；V1為定容后待測溶液體積（10 mL）；V2為甲苯層的總體積（5 mL）；V3為用于絡合反應的待測溶液體積（2 mL）；m為準確稱取的小米Se-SDF質量/g。

1.3.4 .3 小米Se-SDF得率的計算

按公式（2）計算小米Se-SDF得率。

式中：m1為小米Se-SDF質量/g；m2為小米SDF質量/g。

1.3.5 硒化修飾前后小米SDF結構的測定

1.3.5 .1 傅里葉變換紅外光譜測定

參照張艷榮等[33]的方法進行傅里葉變換紅外光譜測定。稱取2 mg干燥樣品與200 mg KBr粉末于研缽中，充分混勻，研磨，制片。在4 000～500 cm－1波數(shù)范圍內進行紅外光譜掃描。

1.3.5 .2 微觀結構的觀察

參照Park等[34]的方法，采用SEM觀察微觀硒化修飾前后小米SDF微觀結構。將樣品干燥至恒質量，取適量進行黏臺、鍍金后進行微觀結構觀察。

1.3.5 .3 相對分子質量分布的測定

采用LC20+RID20A凝膠滲透色譜儀進行硒化修飾前后小米SDF相對分子質量分布的測定，用島津Lab solution GPC色譜工作站進行分析計算。將樣品用流動相溶解得到質量分數(shù)0.1%的溶液。色譜條件：TOSOH TSKGEL GMPWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，13 μm）；流動相：含質量分數(shù)0.06%疊氮化鈉的0.1 mol/L硝酸鈉水溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.5 .4 X射線衍射圖譜測定

參考文獻[35]，取適量干燥后的SDF于樣品槽中用玻璃板壓平，將其置于自動X射線衍射儀中。參數(shù)設置：波長λ＝0.156、管壓36 kV、管流20 mA、Cu靶、掃描速率2（°）/min、衍射角度2θ掃描范圍2°～40°、步寬0.02°。

1.3.6 硒化修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性的測定

1.3.6.1 羥自由基清除能力測定

羥自由基清除能力采用羥自由基測定試劑盒測定。實驗重復3 次。

1.3.6 .2 DPPH自由基清除率測定

參考文獻[36]，取3 mL質量分數(shù)為5%樣品溶液于試管中，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（用體積分數(shù)95%乙醇溶液配制），振蕩混合后，在26 ℃下避光放置30 min，然后在517 nm波長處測定吸光度（A1）；同時用3 mL蒸餾水替代樣品溶液，測定混合溶液的吸光度（A0），用3 mL 95%（體積分數(shù)）乙醇溶液代替DPPH溶液，測定混合溶液的吸光度（A1）。平行測定3 次。按公式（3）計算DPPH自由基清除率。

1.3.6 .3 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力采用總抗氧化能力試劑盒測定。實驗重復3 次。

1.3.7 小米Se-SDF體外發(fā)酵液色氨酸質量濃度的測定

1.3.7 .1 色氨酸標準曲線的繪制

參考文獻[37-38]，配制100 mL質量濃度1 g/L的色氨酸母液，再分別用蒸餾水稀釋成20、40、80、100、120、150 μg/mL的系列標準液。分別量取1 mL色氨酸系列標準液和4 mL質量濃度3 g/L的對二甲氨基苯甲醛溶液（用9 mol/L的硫酸溶液溶解）于比色管中，60 ℃水浴20 min，然后加入30 μL質量分數(shù)0.5%的亞硝酸鈉溶液混勻，繼續(xù)水浴5 min，取出冷卻，測定590 nm處測吸光度（以9 mol/L的硫酸溶液作空白對照）。色氨酸標準曲線回歸方程為y＝0.013x+0.003 6，R2＝0.999 6（y為吸光度，x為色氨酸質量濃度/（μg/mL））。

1.3.7 .2 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質量濃度的測定

參考文獻[39]，選取5 只健康小鼠糞便作為菌種源，為了防止糞便污染，小鼠糞便利用代謝籠每天上午9點鐘進行收集，將小鼠糞便放入滅菌環(huán)氧樹脂管，立即用1 mol/L pH 7磷酸鹽緩沖液按照體積比1∶9稀釋。分別以質量濃度1.55 g/L的小米SDF（2 mL）、小米IDF（2 mL）、小米Se-SDF（低、中、高3 個劑量組分別為1、2、3 mL）和質量濃度9.15 mg/L的亞硒酸鈉（2 mL）作為碳源（空白為2 mL蒸餾水），加入10 mL糞便稀釋液進行體外發(fā)酵實驗。將樣品混勻后在37 ℃厭氧工作站中發(fā)酵，并在發(fā)酵的0、6、12、24 h取樣測定色氨酸的質量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均設置3 組平行，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 22軟件及Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan檢驗進行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著，用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 硒化修飾小米SDF條件的單因素試驗結果

如圖1A所示，隨著反應溫度的升高，小米Se-SDF得率及硒含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，兩者在50 ℃達到峰值，此時小米Se-SDF得率為14.85%，硒含量為2.07 mg/g；隨著反應溫度進一步升高，小米Se-SDF得率及硒含量迅速降低，這可能是由于溫度對SDF結構造成一定程度的破壞，使其發(fā)生降解，導致硒不能與SDF很好地結合，因而降低了Se-SDF得率和硒含量。任廣明[40]研究發(fā)現(xiàn)，反應溫度達到60 ℃以上時會使硒化修飾過程中香菇多糖硒含量及硒結合力明顯降低，并分析這是由于反應液溫度過高時，反應溶液中的多糖分子運動增強，離子振動劇烈，阻礙了香菇多糖與硒之間的結合。

圖1 反應溫度（A）、時間（B）、亞硒酸鈉溶液添加量（C）、氯化鋇添加量（D）對小米SDF硒化修飾的影響Fig.1 Effect of reaction temperature (A), time (B), amount of sodium selenite solution (C) and amount of barium chloride (D) on the selenium modification of millet SDF

反應時間對硒化修飾結果的影響如圖1B所示。隨著反應時間的延長，小米Se-SDF得率及硒含量呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，在反應時間為6 h時，小米Se-SDF得率及硒含量達到最大，分別為15.1%、2.07 mg/g；實驗開始時反應時間太短而導致SDF與亞硒酸鈉反應不充分，兩者不能有效結合，所以得率及硒含量較低；而在反應6 h后，隨著反應時間過長，SDF在高溫、強酸條件下產(chǎn)生降解，導致小米Se-SDF得率降低[41]。

如圖1C所示，5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量為4 mL時小米Se-SDF得率及硒含量達到最大，分別為14.56%、2.07 mg/g。當繼續(xù)增加亞硒酸鈉溶液添加量時，小米Se-SDF得率降低，硒含量降低，這與任廣明[40]的研究結果一致。這可能是由于溶液中硒的結合位點有限，當亞硒酸鈉溶液添加量不斷增加時，亞硒酸根離子之間的競爭增加，而催化劑含量不足，催化作用降低，從而降低了反應效率，導致硒結合率下降，使得小米Se-SDF得率、硒含量降低。

如圖1D所示，氯化鋇添加量為0.75 g時小米Se-SDF得率達到最大，為12.53%，此時硒含量也達到峰值，為2.41 mg/g；當氯化鋇添加量大于0.75 g時，小米Se-SDF得率和SDF的硒結合量均降低。這可能是因為隨著氯化鋇添加量的增加，其對亞硒酸鈉和小米SDF的反應起到催化作用，所以兩者的結合能力增強，但當繼續(xù)加入時，氯化鋇阻礙了硒與SDF之間的結合，因而導致小米Se-SDF得率和硒含量降低[41]。

2.2 硒化修飾小米SDF正交試驗結果及方差分析

表4 以硒化修飾小米粉SDF硒含量為指標的正交試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance for selenium content of Se-SDF

由表2～4可知，反應溫度對小米SDF硒化結果影響最為顯著（P＜0.01），由表2可知，各因素對小米Se-SDF得率的影響大小為：反應溫度＞氯化鋇添加量＞反應時間＞亞硒酸鈉溶液添加量；各因素對產(chǎn)物中硒含量的影響大小為：反應溫度＞反應時間＞亞硒酸鈉溶液添加量＞氯化鋇添加量。由表3、4可知，亞硒酸鈉溶液添加量對硒化結果影響不顯著，結合表2結果得到最優(yōu)組合為：反應溫度40 ℃、反應時間6 h、質量濃度5 mg/mL亞硒酸鈉溶液添加量3 mL、氯化鋇添加量0.65 g，通過最優(yōu)組合進行實驗，得小米Se-SDF的得率為10.56%，硒含量為2.69 mg/g。后續(xù)實驗在最優(yōu)組合下進行。

表2 硒化修飾小米SDF條件正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments on the condition of selenochemically modified millet

表3 以硒化修飾小米粉SDF得率為指標的正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for Se-SDF yield

2.3 硒化修飾前后小米SDF的結構

2.3.1 硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜

如圖2所示，硒化修飾前后小米SDF的主體結構并未改變，但硒化修飾后出現(xiàn)了新的特征吸收峰（1 434、1 297、886、832、695、600 cm－1）。相關研究表明，1 434 cm－1處為糖環(huán)上與Se＝O相鄰的C－H的特征吸收峰[28]；1 297 cm－1處為C－H的彎曲振動峰[41]，也可能是O－Se－O的拉伸振動引起的[42]；886 cm－1處為Se＝O鍵的特征吸收峰[43]；832 cm－1處為Se＝O鍵的特征吸收峰[41]；695、600 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰分別為Se－OH、Se－O－C的特征吸收峰[44-45]。硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜表明，硒與SDF的結合是通過O－Se－O、Se－OH、Se－O－C和Se＝O鍵完成的。

圖2 硒化修飾前后小米SDF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of millet SDF before and after modification

2.3.2 硒化修飾前后小米SDF微觀結構

由圖3可以清晰地看出修飾前后小米SDF微觀形態(tài)的差異。小米Se-SDF表面多孔且孔徑較大，呈蜂窩狀，而未經(jīng)修飾的小米SDF為不規(guī)則片狀，且結構致密，這與曹龍奎等[46]的研究結果一致。小米SDF表面顆粒較聚集，可能是因為其分子間相互作用力強，使分子間產(chǎn)生強烈的吸引力；而小米Se-SDF表面多孔，聚合度小，這種變化可能是由于硒與SDF之間的相互作用改變了分子間的相互作用及范德華力的作用[47]。

圖3 修飾前后小米SDF的SEM圖Fig.3 SEM images of millet SDF before and after modification

2.3.3 硒化修飾前后小米SDF相對分子質量分布

圖4為硒化修飾前后小米SDF的凝膠滲透色譜圖，可以看出硒化修飾前后小米SDF各有兩個組分，相對分子質量分別為0.57×104～33.25×104、0.05×104～0.56×104和2.75×104～686.79×104、157～20.98×104。如表5和圖4所示，小米SDF重均相對分子質量Mw＝2.67×104，數(shù)均相對分子質量Mn＝1.32×104，分散系數(shù)為2.02，相對分子質量20×104～30×104、10×104～20×104、1×104～10×104、小于1×104的分布占比分別為1.202 0%、14.187 7%、55.348 5%、29.261 8%；小米Se-SDF重均相對分子質量Mw＝1.09×104，數(shù)均相對分子質量Mn＝2.72×103，分散系數(shù)為4，相對分子質量在100×104～750×104、50×104～100×104、10×104～50×104、1×104～10×104、小于1×104的分布占比分別為75.256 2%、10.010 2%、2.791 5%、8.684 9%、3.257 2%，兩種SDF分散系數(shù)均小于10，說明樣品純度較高[48]。由以上數(shù)據(jù)知，硒化修飾后小米SDF重均相對分子質量下降，分散范圍較廣，推測這可能是因為酸性條件使得SDF發(fā)生降解，這與圖3所測得的結果一致。

圖4 硒化修飾前后小米SDF的凝膠滲透色譜圖Fig.4 Gel permeation chromatograms of millet SDF before and after modification

表5 硒化修飾前后小米SDF的相對分子質量Table 5 Relative molecular masses of native and selenized millet SDF

2.3.4 硒化修飾前后小米SDF的X射線衍射圖譜

由圖5可知，小米SDF在2θ為21.840 29°處出現(xiàn)較弱的結晶衍射峰，衍射峰較寬，說明小米SDF為不規(guī)則且無定型態(tài)[49]，與SEM圖觀察到的結果一致；小米Se-SDF在21.684 37 °處有明顯的結晶衍射峰，這說明硒化修飾在一定程度上會使小米SDF結構呈現(xiàn)微晶態(tài)[40]，通過對比發(fā)現(xiàn)修飾對SDF的XRD衍射峰位置無明顯影響，因此認為硒化修飾并未使其結晶結構類型發(fā)生改變[50]。根據(jù)Segal[51]的計算方法，可計算得到小米SDF的結晶指數(shù)為11.23%，小米Se-SDF的結晶指數(shù)為9.51%，說明硒化修飾使小米SDF結晶度降低，結晶區(qū)域變小[52]，或是由于物理結構的破壞和內部結構的暴露，促進了結晶中酶解的增強，導致結晶度降低[53]。

圖5 修飾前后小米SDF的X射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction spectra of millet SDF before and after modification

2.4 小米Se-SDF體外抗氧化活性

如表6所示，與小米SDF相比，小米Se-SDF羥自由基清除能力提高了2.20%，DPPH自由基清除率提高了130.18%，總抗氧化能力提高了52.40%。羅敏等[54]研究發(fā)現(xiàn)，硒化前后米胚多糖對O2－?、?OH、DPPH自由基均有不同程度的清除能力，且硒化的米胚多糖效果更佳顯著。Xiao Heng等[55]通過比較馬尾藻多糖硒化前后抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過硒化的多糖表現(xiàn)出更高的活性。膳食纖維是一種非淀粉多糖，其抗氧化活性與其分子質量、糖醛酸含量等有關[56]。有研究表明，多糖清除自由基的能力與其羥基的供氫能力呈正相關[55-57]。由圖2可知，小米Se-SDF在1 459 cm－1附近的吸收峰顯示羥基的存在，這可能是其抗氧化能力較強的原因。此外，糖醛酸含量較高的多糖容易解離出氫原子，抗氧化活性更強[58]，由圖2可知，小米Se-SDF在1707 cm－1附近的吸收峰顯示醛基或羧基的存在，說明小米Se-SDF中富含糖醛酸，這可能是其抗氧化能力較強的另一個原因。多糖中硒基或硒酸酯基的存在也能激活異位碳[59]的氫原子，這也與圖2的結果相一致。修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性測定結果表明，硒化修飾在提高SDF的抗氧化活性方面發(fā)揮了關鍵的作用，與Lee等[60]報道的結果一致。

表6 硒化修飾前后小米SDF的體外抗氧化活性測定結果Table 6 In vitro antioxidant activity of millet SDF before and after modification

2.5 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質量濃度的變化

由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中色氨酸質量濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在發(fā)酵6 h時，各組發(fā)酵液中色氨酸質量濃度達到峰值，這可能是因為當各種碳源加入到發(fā)酵液中后，為發(fā)酵液中菌類提供營養(yǎng)物質來源，發(fā)酵液中有一部分菌類利用這些營養(yǎng)物質產(chǎn)生色氨酸，從而增加了發(fā)酵液中色氨酸質量濃度[61]；隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，色氨酸質量濃度降低，這可能是因為碳源被利用導致發(fā)酵液葡萄糖濃度增高，進而導致發(fā)酵液黏度增大，造成溶氧量下降，使菌體的生長代謝受到影響，產(chǎn)色氨酸能力下降[62]，而色氨酸代謝反應仍在進行，所以導致色氨酸質量濃度降低。不同時間不同碳源發(fā)酵液中色氨酸質量濃度均低于空白組，這可能是因為碳源的加入改變了發(fā)酵液中微生物數(shù)量及種類，增加了可以利用色氨酸的微生物數(shù)量，也可能是由于微生物對碳源選擇的差異性，導致實驗組中色氨酸質量濃度更較空白組低。從圖6中可知，反應6 h后，亞硒酸鈉發(fā)酵液中色氨酸質量濃度最高，這可能是因為亞硒酸鈉發(fā)酵液中產(chǎn)色氨酸的微生物較活躍，而利用色氨酸的微生物部分被抑制，而被抑制的原因可能是亞硒酸鈉對利用色氨酸微生物具有一定的毒副作用。反應6 h后，以小米Se-SDF為碳源的發(fā)酵液中色氨酸質量濃度均高于以小米SDF（9.61 μg/mL）和小米IDF（10.11 μg/mL）為碳源的發(fā)酵液中色氨酸質量濃度，中劑量的小米Se-SDF組發(fā)酵液中色氨酸質量濃度最高，為12.01 μg/mL，說明小米Se-SDF可以很好地被微生物利用，這可能是因為小米SDF經(jīng)過硒化修飾后，其自身生物活性得到提高，而且硒的毒性也在一定程度上被降低，所以使其產(chǎn)色氨酸的能力增強。綜合上述實驗結果可知，以中劑量小米Se-SDF為碳源的小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液產(chǎn)色氨酸的效果最佳。Park等[22]證明膳食纖維可以通過腸道菌群對胃腸疾病有改善的作用，但Gibson等[63]的研究表明SDF與部分結腸炎癥狀如腹痛、腹脹、腹瀉的發(fā)生或惡化有關，而相關研究指出胃腸道炎癥患者攝入色氨酸可以緩解炎癥[23-24]，修飾后的水溶性膳食纖維在微生物的作用下可以產(chǎn)生一定量的色氨酸，因此，小米Se-SDF可能比小米SDF更適合胃腸功能較弱的人群食用。

圖6 小鼠糞便稀釋液體外發(fā)酵液中色氨酸質量濃度的變化Fig.6 Changes in tryptophan content in fermentation broth of mouse intestinal flora utilizing different carbon sources

3 結 論

在最佳硒化修飾條件下，小米Se-SDF得率為10.56%，硒含量為2.69 mg/g；修飾后小米Se-SDF分子質量增加，表面多孔且孔徑較大，呈蜂窩狀，聚合度降低，出現(xiàn)Se＝O、Se－OH、Se－O－C等官能團，結晶結構類型無明顯變化，結晶指數(shù)降低，且修飾后小米Se-SDF抗氧化活性得到提高，促腸道菌群產(chǎn)色氨酸能力增強。目前，缺硒人數(shù)逐年升高，體外補硒引起廣泛關注，本研究不僅為SDF與亞硒酸鈉生產(chǎn)有機硒食品提供理論依據(jù)，還可為后續(xù)小米在功能性食品加工領域中的應用奠定基礎。小米SDF具有一定的保健功效，本研究僅對小米Se-SDF的體外抗氧化活性進行檢測，未進行體內的功能性研究，后續(xù)可通過體內實驗進一步探究小米Se-SDF的功能特性，為開發(fā)富硒食品提供理論依據(jù)。