高 淵，楊亞茹，常明昌,2，孟俊龍,2，劉靖宇,2，馮翠萍,

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西 太谷 030801）

長期攝入高脂高膽固醇類食物會導(dǎo)致人體脂代謝紊亂，從而誘發(fā)肥胖、高脂血癥等慢性代謝疾病，危害人體健康。多糖被認(rèn)為能夠很好地預(yù)防和控制這類疾病。研究發(fā)現(xiàn)天然多糖可以通過調(diào)節(jié)一系列信號通路降低甘油三酯和膽固醇水平[1]。Gu Wen等[2]研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖能夠緩解炎癥，預(yù)防糖脂代謝紊亂。Ma Ming等[3]研究表明枸杞多糖能夠明顯抑制脂質(zhì)過氧化，從而預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生。楊波等[4]研究發(fā)現(xiàn)五味子、黃芪混合多糖能夠促進(jìn)肝臟膽固醇代謝，對高脂血癥大鼠具有降脂作用。Li Yuxin等[5]研究發(fā)現(xiàn)姬松茸酸性多糖具有降脂活性，其降脂機(jī)制是通過激活相關(guān)的膽固醇代謝途徑。

目前，已有大量研究表明食用菌多糖具有廣泛的生物活性[6]。繡球菌（Sparassis crispa）是一種珍貴的食藥用菌[7]，其子實(shí)體含有多種活性物質(zhì)[8]，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)39.3%～43.6%[9-10]。研究表明，繡球菌多糖具有抗炎癥[11-12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]、抗衰老[15]、提高免疫力[16]、抑菌[17]等多種功效。

代謝組學(xué)是連接基因型和表型的橋梁，其研究對象主要是生物有機(jī)體內(nèi)的小分子內(nèi)源性代謝物（分子質(zhì)量小于1 000 Da）[18]。代謝組學(xué)技術(shù)可以從整體和動(dòng)態(tài)的角度揭示外源刺激或干擾對生命系統(tǒng)代謝反應(yīng)的影響[19]。目前，有關(guān)繡球菌多糖功能作用的研究大多集中在抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面，對其降血脂的功能研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究繡球菌多糖對高脂血癥模型大鼠血脂水平的影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測血清中代謝物的變化，并從代謝組學(xué)角度分析其中潛在的差異代謝物及相關(guān)代謝通路，從而探究繡球菌多糖降血脂的功效及作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6 周齡SPF級雌性SD大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。

繡球菌子實(shí)體 山西太和食用菌栽培基地；豬膽鹽北京索萊寶科技有限公司；膽固醇、甲氧胺鹽酸鹽和N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺 上海阿拉丁生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；大鼠谷氨酸、谷氨酰胺酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；吡啶、甲醇、正庚烷均為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D-375高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；N-EVAP-111氮吹儀 美國Organomation公司；Spectra Max i3x多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；WFJ2100可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Trace ISQ GC-MC儀 美國ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 繡球菌多糖制備

參考文獻(xiàn)[20]，將繡球菌子實(shí)體置于35 ℃烘箱中干燥，切片粉碎過200 目篩，取繡球菌子實(shí)體粉，按料液比1∶40（m/V）加入蒸餾水，75 ℃浸提3 h。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80 ℃濃縮提取液至黏稠狀，加入3 倍體積的無水乙醇沉淀，混勻，置于4 ℃冰箱12 h，離心收集沉淀，分別用丙酮、乙醚洗滌沉淀至洗液澄清。參考文獻(xiàn)[21]使用Sevag法除蛋白，參考文獻(xiàn)[22]使用HZ-830大孔樹脂純化后真空冷凍干燥，得到繡球菌多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法[23]測得多糖純度為85.7%。

1.3.2 動(dòng)物分組及設(shè)計(jì)

50 只6 周齡SPF級雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組：正常對照組（NC組），高脂血癥模型組（HFCM組），繡球菌多糖低（HFC+LD）、中（HFC+MD）和高（HFC+HD）劑量組，每組10 只，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其余4 組飼喂高脂高膽固醇飼料。每日給繡球菌多糖低、中、高劑量組分別灌胃100、200、400 mg/kgmb繡球菌多糖，其余2 組灌胃等質(zhì)量的生理鹽水，期間自由飲水進(jìn)食。高脂高膽固醇飼料配方為：基礎(chǔ)飼料88.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）、豬油10%、膽固醇1%、膽鹽0.2%。

1.3.3 樣本采集及保存

5 組大鼠飼喂8 周后，禁食12 h，用乙醚麻醉，眼球取血并于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min。分離血清后置于－80 ℃冰箱中保存，用于血清生化指標(biāo)和差異代謝物的測定。

1.3.4 血清脂質(zhì)指標(biāo)測定

按照試劑盒說明書測定TC、TG、LDL-C、HDL-C、TBA濃度。

1.3.5 血清代謝物的GC-MS檢測

參考文獻(xiàn)[24-25]進(jìn)行血清預(yù)處理。血清解凍后取100 μL加入600 μL甲醇，漩渦振蕩1 min，冰水浴超聲提取10 min并于4 ℃、12 000 r/min的條件下離心15 min；取400 μL上清液轉(zhuǎn)移到玻璃管中，氮?dú)獯蹈?，加?5 μg/μL甲氧胺吡啶溶液75 μL，漩渦5 min，70 ℃水浴肟化1 h，再加入75 μLN,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺，漩渦5 min，室溫下放置1 h；加入200 μL正庚烷，漩渦30 s，4 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液置于樣品瓶中進(jìn)行GC-MS檢測。

GC條件：VF-5MS熔融石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫條件：起始溫度70 ℃，以10 ℃/min的速率均勻升至180 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min的速率均勻升至260 ℃；載氣（氦氣）流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1。

MS條件：電離電壓70 eV；檢測電壓0.9 kV；電子轟擊離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣口溫度240 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量范圍m/z45～450，掃描間隔0.2 s。

1.3.6 血清樣品中谷氨酸、谷氨酰胺濃度的測定

采用相應(yīng)酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定血清樣品中谷氨酸、谷氨酰胺濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

血清脂質(zhì)指標(biāo)相關(guān)數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析下的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異具有顯著性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Graphpad prism 8.0作圖。

GC-MS采集的數(shù)據(jù)經(jīng)過Thermo Xcalibur軟件和NIST 08標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行峰的提取和匹配，然后進(jìn)行峰面積歸一化處理，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA），并使用Metabo Analyst 4.0平臺對差異代謝物進(jìn)行差異代謝物篩選、聚類分析及通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球菌多糖對大鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)的影響

各組大鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)的檢測結(jié)果如圖1所示。與正常對照組比較，高脂血癥模型組大鼠血清中TC、LDL-C、TBA濃度顯著升高（P＜0.05）；高脂血癥模型組大鼠血清中TG濃度高于正常對照組，差異不顯著（P＞0.05）；高脂血癥模型組大鼠血清中的HDL-C濃度顯著低于正常對照組（P＜0.05）。與高脂血癥模型組比較，繡球菌多糖干預(yù)組大鼠血清中的TC、TG、LDL-C、TBA濃度降低，其中繡球菌多糖高劑量組的TC濃度顯著降低（P＜0.05）；HDL-C濃度有升高趨勢，但變化不顯著（P＞0.05）。

圖1 繡球菌多糖對大鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)的影響（n＝ 10）Fig.1 Effects of Sparassis crispa polysaccharides on serum lipid indexes in rats (n = 10)

2.2 繡球菌多糖對大鼠血清代謝物的影響

2.2.1 血清代謝物定性分析結(jié)果

血清樣本預(yù)處理后進(jìn)行GC-MS檢測，選取正常對照組、高脂血癥模型組、繡球菌多糖高劑量組的大鼠血清樣本GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖2）。對比發(fā)現(xiàn)這3 組血清代謝譜的峰高和峰面積均有差異，說明有差異代謝物的存在。

圖2 NC（A）、HFCM（B）、HFC＋HD（C）組血清代謝物的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion current chromatograms of serum metabolites in NC (A), HFCM (B), and HFC + HD (C) groups

2.2.2 血清代謝物的主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析結(jié)果

對正常對照、高脂血癥模型、繡球菌多糖高劑量組血清樣本GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（n＝8），結(jié)果如圖3所示。正常對照組與高脂血癥模型組樣本不能被顯著區(qū)分（圖3A），高脂血癥模型組與繡球菌多糖高劑量組樣本可以被顯著區(qū)分（圖3B），且沒有離群樣本。進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA（圖4），其橫坐標(biāo)為預(yù)測主成分得分，縱坐標(biāo)為正交主成分得分。圖4A中，（模型對X變量的解釋度）＝0.978，（模型對Y變量的解釋度）＝0.986，Q2（模型的可預(yù)測度）＝0.384；圖4B中，＝0.978，＝0.997，Q2＝0.972，可以看出正常對照組與高脂血癥模型組、高劑量組與高脂血癥模型組樣本均能夠被明顯分開，說明正常對照組與高脂血癥模型組、繡球菌多糖高劑量組與高脂血癥模型組的代謝信息有明顯差異。

圖3 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的PCA得分圖Fig.3 Principal component analysis score plots of serum metabolites in NC and HFCM (A), HFCM and HFC + HD (B) groups

圖4 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的OPLS-DA得分圖Fig.4 Orthogonal partial least square-discriminate analysis score pots of serum metabolites in NC and HFCM (A), HFCM and HFC + HD (B) groups

2.2.3 差異代謝物篩選結(jié)果

通過OPLS-DA模型對各組進(jìn)行分析后可以得到S-Plot載荷圖（圖5）和變量重要性（variable importance in the projection，VIP）圖（圖6）。在S-Plot圖中，橫坐標(biāo)為每個(gè)代謝物對模型分組的影響大小，縱坐標(biāo)解釋了每個(gè)代謝物對模型分組的可靠性，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，顯示兩組之間差異的內(nèi)源性分子，代謝物對組間差異的貢獻(xiàn)由VIP值衡量，變量離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，VIP值越大。VIP圖能夠以降序的形式顯示各變量的重要程度，其橫坐標(biāo)為每個(gè)變量的名稱，縱坐標(biāo)為VIP值，根據(jù)VIP值對變量進(jìn)行篩選，選擇VIP＞1.2且相對峰面積獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＜0.05的物質(zhì)作為潛在的差異代謝物。從正常對照組和高脂血癥模型組血清中篩選出11 種差異代謝物（表1）。與正常對照組相比，高脂血癥模型組血清中代謝物表達(dá)上調(diào)的主要有苯丙氨酸、蛋氨酸、丙酸與纈氨酸；下調(diào)的主要有1,5-脫水山梨糖醇、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和蘇氨酸。從高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組血清中篩選出14 種差異代謝物（表2）。與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖高劑量組血清中代謝物表達(dá)上調(diào)的主要有戊酸、酪氨酸、甘油、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸和琥珀酸；下調(diào)的代謝物主要有尿素、嘧啶、葡萄糖、膽固醇、異亮氨酸和棕櫚酸。

圖5 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的S-Plot圖Fig.5 S-Plot of serum metabolites in NC group versus HFCM group (A),and HFCM group versus HFC + HD group (B)

表2 HFCM組和HFC＋HD組血清中主要差異代謝物Table 2 Main differential serum metabolites in HFCM and HFC + HD groups

圖6 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的VIP圖Fig.6 Variable importance in the projection map of serum metabolites in NC versus HFCM groups (A), and HFCM versus HFC + HD (B) groups

表1 NC組和HFCM組血清中主要差異代謝物Table 1 Main differential serum metabolites in NC and HFCM groups

2.2.4 差異代謝物聚類分析與通路分析結(jié)果

聚類分析圖可以反映出差異代謝物在各組相對含量增加或減少的情況（圖7）。與正常對照組相比，高脂血癥模型組差異代謝物相對含量與對照組相比發(fā)生較大改變，而高劑量繡球菌多糖的干預(yù)能夠抑制這種改變。

圖7 NC、HFCM、HFC＋HD組血清中差異代謝物的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of different serum metabolites in NC, HFCM and HFC + HD groups

對正常對照組和高脂血癥模型組、高脂血癥模型組和高劑量組之間的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析（圖8），并采用HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比。將差異代謝物對通路的影響值大于0.2的代謝通路作為潛在的靶標(biāo)代謝通路，共發(fā)現(xiàn)8 條相關(guān)的代謝通路，除了共有的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸合成，甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸合成，苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸合成，丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸代謝，甲烷代謝，花生四烯酸代謝和甘油磷脂代謝之外，高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組之間還涉及谷氨酸與谷氨酰胺代謝，繡球菌多糖可能通過影響這些代謝通路來改善高脂血癥大鼠血脂的異常，其中谷氨酸與谷氨酰胺代謝的影響最大。

圖8 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清中差異代謝物的代謝通路分析Fig.8 Analysis of metabolic pathways of differential serum metabolites between NC and HFCM groups (A), and between HFCM and HFC + HD groups (B)

2.3 繡球菌多糖對大鼠血清谷氨酸和谷氨酰胺水平的影響

對大鼠血清的谷氨酸和谷氨酰胺水平進(jìn)行測定，結(jié)果見圖9。與正常對照組比較，高脂血癥模型組的谷氨酸和谷氨酰胺水平降低，其中谷氨酸水平顯著降低（P＜0.05）；與高脂血癥模型組比較，繡球菌多糖干預(yù)組血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平有升高趨勢，其中低劑量組中谷氨酸水平顯著高于高脂血癥模型組（P＜0.05），中、高劑量組大鼠血清中的谷氨酸、谷氨酰胺水平顯著高于高脂血癥模型組（P＜0.05）。

圖9 繡球菌多糖對大鼠血清谷氨酸（A）和谷氨酰胺（B）水平的影響（n＝10）Fig.9 Effect of Sparassis crispa polysaccharides on serum glutamic acid (A) and glutamine (B) in rats (n = 10)

3 討 論

許多食藥用菌的有效成分可以通過調(diào)控機(jī)體膽固醇代謝和甘油三酯代謝達(dá)到降血脂的功效[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)繡球菌多糖能夠顯著降低高脂血癥大鼠血清的TC濃度，從而達(dá)到降血脂的功效。根據(jù)進(jìn)一步對大鼠血清的代謝組學(xué)分析，并得到OPLS-DA評分圖，可以發(fā)現(xiàn)高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組的樣本可以完全被區(qū)分，說明繡球菌多糖的干預(yù)對高脂血癥大鼠有明顯的影響。通過VIP圖篩選和代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)繡球菌多糖的降血脂作用主要與機(jī)體內(nèi)的氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝有關(guān)。

繡球菌多糖能夠通過調(diào)節(jié)血清中的氨基酸來改善血脂異常。與NC組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中苯丙氨酸、蛋氨酸和纈氨酸水平上升，谷氨酸、脯氨酸水平下降；與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖高劑量組大鼠血清中異亮氨酸水平降低，酪氨酸、絲氨酸水平升高。Teymoori等[27]研究結(jié)果也表明，一些氨基酸水平的變化能夠增加或減少血脂水平，其中蛋氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的增加會導(dǎo)致TG水平升高，而谷氨酸的增加會導(dǎo)致TG、TC水平的降低。本實(shí)驗(yàn)通過測定血清中谷氨酸和谷氨酰胺的水平發(fā)現(xiàn)繡球菌多糖能夠顯著調(diào)節(jié)血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平，谷氨酸水平的上升可以使其被谷氨酰胺合成酶催化為谷氨酰胺，從而對機(jī)體脂質(zhì)代謝產(chǎn)生重要作用。Petrus等[28]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以緩解小鼠脂肪組織的炎癥，且其水平與脂肪量呈負(fù)相關(guān)。苯丙氨酸可以被苯丙氨酸羥化酶催化為酪氨酸，使酪氨酸水平升高，進(jìn)而影響機(jī)體的糖脂代謝[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖誘導(dǎo)酪氨酸、脯氨酸和絲氨酸濃度上升，并可減輕血脂異常，這與Okekunle等[30]的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)這3 種氨基酸的攝入量與肥胖風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。

與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖組可使大鼠血清中甘油、琥珀酸水平升高，膽固醇、棕櫚酸水平下降。機(jī)體攝入的TG可分解為甘油和脂肪酸，甘油水平的上升說明繡球菌多糖能夠促進(jìn)TG分解；膽固醇水平的下降說明繡球菌多糖能夠促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝。Takeyama等[31]也同樣發(fā)現(xiàn)膳食繡球菌能夠顯著降低甘油三酯和膽固醇濃度，從而表現(xiàn)出抗肥胖和抗高脂血癥活性。琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其濃度的上升能夠增加琥珀酸脫氫酶的活性，從而上調(diào)活性氧濃度，最終促進(jìn)棕色脂肪分解[32]。棕櫚酸是機(jī)體中飽和脂肪酸的主要來源，其濃度的上升會誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[33]。

綜上所述，繡球菌多糖可調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血清中的氨基酸和脂類物質(zhì)，提高有益代謝物水平，從而改善機(jī)體內(nèi)血脂異常的狀態(tài)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)研究繡球菌多糖對高脂血癥大鼠血清代謝產(chǎn)物的干預(yù)情況，通過多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)高脂高膽固醇飼料會引起大鼠血清中代謝物的明顯改變，其中篩選出的顯著差異代謝物主要為氨基酸類物質(zhì)，說明高脂血癥模型組大鼠體內(nèi)可能存在氨基酸代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝的紊亂。與高脂血癥模型組相比，高劑量繡球菌多糖干預(yù)8 周后可以顯著回調(diào)部分氨基酸水平（P＜0.05），并降低葡萄糖和膽固醇水平，提示繡球菌多糖對大鼠體內(nèi)的氨基酸和脂質(zhì)代謝紊亂有改善作用。進(jìn)一步的代謝通路分析發(fā)現(xiàn)谷氨酸與谷氨酰胺代謝對繡球菌多糖的干預(yù)作用影響最大，通過對血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平的測定，發(fā)現(xiàn)與高脂血癥模型組相比，中、高劑量繡球菌多糖能夠顯著調(diào)節(jié)其水平（P＜0.05），證明繡球菌多糖可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸與谷氨酰胺代謝起到降血脂的作用。