張 釗，林希圣，高月明，王興林

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100853

皮膚傷口修復(fù)是一個(gè)由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子參與的復(fù)雜病理生理過程。當(dāng)前，創(chuàng)面治療技術(shù)研究熱點(diǎn)包括細(xì)胞因子相關(guān)的基因工程技術(shù)、組織工程技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)等[1]。這些方法雖然在臨床上取得了良好療效，但其使用技術(shù)復(fù)雜，治療成本較高，存在治療短板。短波紫外線(ultraviolet C，UVC)照射可促進(jìn)皮膚愈合。隨著光生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，LED等冷光源在醫(yī)用方面逐漸顯示出其優(yōu)勢。LED-UVC的使用壽命是普通的熒光紫外線燈的3倍，不含有毒物質(zhì)，較傳統(tǒng)汞燈光源光譜范圍更窄，光子能量更高，方向性好，輸出穩(wěn)定，便于量效關(guān)系評價(jià)[2]。當(dāng)前基于冷光源的新型光學(xué)治療設(shè)備不斷產(chǎn)出，適應(yīng)證也得到顯著擴(kuò)大。然而對于這種冷光源促進(jìn)皮膚愈合及相關(guān)機(jī)制的研究較少。因此，本研究觀察LED冷光源(峰值波長為254 nm)照射對SD大鼠背部皮膚創(chuàng)面愈合的影響，并對其影響皮膚創(chuàng)面愈合的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物 32只SD雌性清潔級大鼠，體質(zhì)量(200±20) g (解放軍醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。飼養(yǎng)條件：每天光照12 h，相對濕度40%～60%，溫度(22±3)℃。每只大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，自由攝食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批通過。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料 254 nm-LED燈由蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所楊西斌研究員提供(專利號：ZL 2011 1 0387282.1)，波長峰值為250～260 nm，使用電流300 mA，室溫條件下(20℃ ～ 30℃) ＞90%波長為250～260 nm，輸出功率為1.6 μW/cm2。血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31抗體(ab182981，ABCAM，美國)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) ELISA試劑盒(ab100786，ABCAM，美國)。

3 造模與分組 32只大鼠術(shù)前1 d背部肩胛區(qū)備皮。手術(shù)當(dāng)天，使用3%戊巴比妥鈉3.5 mg/100 mL腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒，使用皮膚活檢鉆孔器于大鼠肩胛區(qū)脊柱兩側(cè)分別做直徑為8 mm的皮膚全層創(chuàng)面，根據(jù)Dunn等[3]描述的方法，使用自制硅膠夾板固定創(chuàng)面，防止大鼠皮膚創(chuàng)面回縮。建模后，每只大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，自由攝食水。大鼠背部左側(cè)創(chuàng)面作為對照組(Control)，右側(cè)創(chuàng)面作為實(shí)驗(yàn)組(Treated)。實(shí)驗(yàn)組于造模后即刻使用短波紫外LED燈(波長254 nm，功率220 μW/cm2)垂直照射大鼠背部皮膚1次(40 s)，光源距創(chuàng)面5 mm，照射整個(gè)創(chuàng)面及創(chuàng)緣外3 mm皮膚，照射劑量為每創(chuàng)面33 mJ/cm2。對照組不做干預(yù)。

4 創(chuàng)面愈合率計(jì)算 造模當(dāng)日計(jì)為0 d，在1 d、4 d、7 d、14 d分別取8只大鼠，觀察大鼠背部傷口創(chuàng)面愈合情況，采集創(chuàng)面圖片，用Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面面積，每張圖片計(jì)算5次，并取平均值，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(R)=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

5 HE染色觀察組織學(xué)變化 建模后，在1 d、4 d、7 d、14 d分別取8只大鼠，以創(chuàng)面中心為圓心，取直徑15 mm的圓形皮膚樣本，并將樣本沿中線分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水后石蠟包埋；另一份組織勻漿提取蛋白后，-80℃凍存待用。石蠟包埋的組織做厚度為4 μm的垂直創(chuàng)面的組織學(xué)切片，切片脫蠟至水后，經(jīng)蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，反藍(lán)，伊紅染色后，脫水封片，顯微鏡下對比觀察大鼠皮膚創(chuàng)面組織學(xué)變化。

6 免疫組織化學(xué)染色觀察血管再生情況 石蠟包埋的組織做厚度為4 μm的切片，切片脫蠟至水后，采用熱修復(fù)法修復(fù)抗原，10%驢血清封閉抗原后，加一抗CD31(稀釋比1∶2 000)，4℃孵育過夜，加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察CD31(+)細(xì)胞生長情況，在同一標(biāo)本中隨機(jī)選取創(chuàng)面邊緣及中心的5個(gè)視野，使用Image J軟件進(jìn)行平均光密度(optical density，OD)值分析。

7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測肉芽組織VEGF含量 取凍存對照組和實(shí)驗(yàn)組等量皮膚肉芽組織制備勻漿，離心機(jī)4℃，12 000 r/min離心5 min，收集上清。采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)對大鼠創(chuàng)面局部VEGF的表達(dá)進(jìn)行定量分析。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 皮膚創(chuàng)面愈合情況 建模后第1天傷口表面覆蓋一層干燥的滲出層，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面較對照組更為干燥，兩組傷口均未見明顯收縮。建模后第4天兩組創(chuàng)面有痂形成，創(chuàng)面開始收縮，創(chuàng)面邊緣皮膚發(fā)紅，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面表層結(jié)痂較厚，并有部分創(chuàng)面結(jié)痂邊緣開始脫落。建模后第7天，兩組創(chuàng)面愈合加快，出現(xiàn)肉眼可見的愈合，且實(shí)驗(yàn)組傷口愈合快于對照組。建模后14 d實(shí)驗(yàn)組皮膚創(chuàng)面均已愈合，痂脫落后可見小塊粉紅色裸露皮膚瘢痕。對照組部分皮膚創(chuàng)面仍可見小塊痂未脫落。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠創(chuàng)面均未見明顯感染。見圖1。

圖1 大鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況Fig.1 Appearance of wounds

2 皮膚創(chuàng)面愈合率 對照組和實(shí)驗(yàn)組在建模后第1天和第4天愈合率無明顯差異。建模后第7天實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率為85.58% ± 5.37%，高于對照組的80.02% ± 7.38%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。建模后第14天，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面均已愈合，對照組雖然仍有部分創(chuàng)面未愈合，但由于創(chuàng)面過小，兩組間愈合率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率變化比較(%, n=8)Tab.1 Wound healing rates in two groups at different time points (%, n=8)

3 組織學(xué)觀察 HE染色顯示，建模后第1天對照組和實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面均可見大量的血管和炎細(xì)胞浸潤。建模后第4天，實(shí)驗(yàn)組皮膚創(chuàng)面可見大量新生毛細(xì)血管，管腔較厚。肉芽組織增生明顯，成纖維細(xì)胞數(shù)量多，可見較多紅色的膠原纖維。對照組皮膚創(chuàng)面新生毛細(xì)血管增生，肉芽組織增生層較薄，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少。建模后第7天，對照組創(chuàng)面仍可見大量血管，細(xì)胞外基質(zhì)較少。實(shí)驗(yàn)組也可見大量血管，但管壁較對照組更成熟，細(xì)胞外基質(zhì)較對照組多，可見成纖維細(xì)胞。建模后第14天，兩組創(chuàng)面均已經(jīng)被覆蓋，皮下組織中仍可見毛細(xì)血管，成纖維細(xì)胞增多。見圖2。

圖2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)皮膚創(chuàng)面病理學(xué)觀察(HE×100)Fig.2 Pathological changes of skin wounds in two groups at different time points (HE×100)

4 免疫組化CD31染色比較及平均光密度分析 免疫組織化學(xué)染色顯示，建模后第7天對照組和實(shí)驗(yàn)組肉芽組織中均可見大量CD31(+)細(xì)胞，血管大量增生(圖3A、圖3C)。至建模后第14天，對照組CD31(+)細(xì)胞減少，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞仍可見較多CD31(+)細(xì)胞(圖3B、圖3D)。測量平均光密度顯示，建模后第7天兩組OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；建模后第14天，實(shí)驗(yàn)組CD31(+)表達(dá)明顯高于對照組(表2)。

圖3 建模后7 d (A、C)、14 d (B、D)肉芽組織CD31表達(dá)情況 (免疫組化染色×100)Fig.3 New blood vessels in granulation tissue of control and treated group on day 7 (A, C) and 14 (B, D) after operation(IHC×100)

表2 建模后7 d、14 d免疫組織化學(xué)染色CD31(+)平均光密度值比較(n=8)Tab.2 Comparison of mean optical densities at 7 and 14 days after operation (n=8)

5 VEGF含量測定 ELISA實(shí)驗(yàn)分析，建模后1 d、4 d、7 d、14 d實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)均明顯高于對照組。見表3。

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF含量比較(pg/mL, n=8)Tab.3 VEGF levels in two groups at different time points(pg/mL, n=8)

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用LED光源發(fā)射的254 nm UVC一次照射創(chuàng)面33 mJ/cm2可以促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合，這一現(xiàn)象可能與照射后創(chuàng)面處VEGF含量增加，刺激了創(chuàng)面肉芽組織中血管生長有關(guān)。

UVC照射治療是一種十分有效、方便且廉價(jià)的皮膚傷口治療方法，對壓瘡、慢性傷口、感染傷口、糖尿病潰瘍等均有良好的療效[4-6]。目前臨床上常用的紫外線治療儀是低壓汞燈紫外線治療儀。這種低壓汞燈存在著功率低、帶寬大、光譜成分復(fù)雜、光輸出不穩(wěn)等問題，難以科學(xué)評價(jià)其量效關(guān)系，臨床操作以經(jīng)驗(yàn)為主，無法統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，LED光源的出現(xiàn)使得光譜成分可控、波段專一的光源成為現(xiàn)實(shí)。且LED光源壽命長、光功率密度高、光量子能量高、輸出功率可控，可以精確評價(jià)其輸出功率，計(jì)算量效關(guān)系。因此，LED光源作為一種新型冷光源，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[7]。

不同波長的紫外線產(chǎn)生的光化學(xué)效應(yīng)不同。一般認(rèn)為紫外線治療創(chuàng)面的有效波段為254 nm附近的短波紫外線。由于UVC可以被大氣層完全吸收，自然界中并不存在UVC，因此目前對紫外線的研究主要集中在長波紫外線和中波紫外線[8]。已有的文獻(xiàn)認(rèn)為UVC促進(jìn)傷口愈合 可能與下調(diào)炎癥反應(yīng)，提高血清生長因子水平等因素有關(guān)[9]。根據(jù)已有報(bào)道，低壓汞燈UVC治療大鼠皮膚新鮮創(chuàng)面采用15 mJ/cm2照射，連續(xù)照射3 d，具有顯著的促進(jìn)愈合作用[10]，但UVC治療皮膚創(chuàng)面的最適劑量未見明確報(bào)道。低壓汞燈是利用汞在熱作用下蒸發(fā)成蒸汽狀態(tài)產(chǎn)生光，光譜中主要為180～390 nm紫外線及部分400～450 nm藍(lán)紫光，光譜成分復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)前，我們對已有低壓汞燈輸出功率進(jìn)行測量，結(jié)果顯示除UVC有效治療波段外，還包含大量的長波紫外線和中波紫外線。而與已有報(bào)道使用的光源不同，本研究采用的LED光源產(chǎn)生的短波紫外線主要為250～260 nm，有效波長占比高，便于新式LED-UVC技術(shù)量效關(guān)系評價(jià)。但本實(shí)驗(yàn)使用的紫外線輻射劑量與文獻(xiàn)報(bào)道的劑量存在差異[10]。已有的動物研究中需要使用UVC照射連續(xù)照射3次，總照射劑量為45 mJ/cm2，臨床研究中需要使用12 mJ/cm2連續(xù)照射12 d[11]。而本實(shí)驗(yàn)采用LED-254 nm UVC照射1次，照射劑量僅為33 mJ/cm2，是文獻(xiàn)中動物實(shí)驗(yàn)治療劑量的2/3，臨床研究劑量的1/6，也可以達(dá)到促進(jìn)皮膚傷口愈合的效果。從理論上講，更少劑量和次數(shù)的紫外線暴露可減少紫外線照射導(dǎo)致的不良事件[12]。

皮膚創(chuàng)傷愈合可以分3個(gè)階段：炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、組織重塑，這3個(gè)階段互有重合，并不完全分離[13]。我們觀察到經(jīng)LED-254 nm UVC照射的傷口創(chuàng)面更為干燥，結(jié)痂更厚且脫痂時(shí)間更早。HE染色顯示，LED照射組膠原合成更早，且增生的血管也更為成熟。這些現(xiàn)象提示LED照射組的皮膚傷口可能更早進(jìn)入增殖和重塑階段，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了方向。

血管再生對修復(fù)有很大的意義，是皮膚創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。新生的血管為傷口提供營養(yǎng)、免疫細(xì)胞和氧氣等修復(fù)必須物質(zhì)[15]。本研究使用免疫組織化學(xué)染色檢測CD31(+)血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在建模后第7天和第14天，創(chuàng)傷部位血管均大量增生，第14天LED組血管增生明顯多于空白組。VEGF是血管生成強(qiáng)有力的刺激因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新血管形成，并能促進(jìn)膠原沉積和創(chuàng)面再上皮化[16-17]。本研究結(jié)果也表明LED組創(chuàng)傷部位的VEGF含量要高于對照組。這一結(jié)果提示UVC照射促進(jìn)愈合的作用可能與血管再生相關(guān)。但VEGF的來源、VEGF增加與紫外線照射的劑量關(guān)系等問題仍待進(jìn)一步探討。

綜上所述，LED 254 nm UVC照射可以加速大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，這種促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果可能與創(chuàng)面局部血管再生能力增強(qiáng)有關(guān)。這種治療方法使用方便，照射劑量小，UVC波長控制好，較臨床上使用的低壓汞燈有一定的優(yōu)勢，有可能替代低壓汞燈成為臨床上進(jìn)行UVC光療的新型光源。紫外線的光化學(xué)效應(yīng)不僅與紫外線的波長有關(guān)，也與輻射強(qiáng)度有著密切關(guān)系，如臨床上一般使用大劑量照射處理感染傷口，使用小劑量照射處理新鮮傷口[10]。然而本研究由于受到光源輸出功率的限制，僅對一種輻射劑量進(jìn)行了研究，仍不能認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中采用的劑量是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的最佳劑量。因此，我們將繼續(xù)探索紫外線治療的量效關(guān)系，并深入挖掘UVC治療皮膚傷口的機(jī)制，以期找到更為合理的UVC光療方案。