徐金蓮，陳學(xué)兵，李書(shū)琴，肖學(xué)會(huì)，王沛(荊門(mén)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北荊門(mén)448000)

尿路感染是人類(lèi)較常見(jiàn)的感染性疾病，作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)的中段尿細(xì)菌定量培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)且存在培養(yǎng)陰性現(xiàn)象，不利于臨床快速診斷及排除尿路感染。UF1000i尿沉渣自動(dòng)化分析儀能準(zhǔn)確提供白細(xì)胞和細(xì)菌含量，常用于尿路感染的篩查。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀雖可于當(dāng)日完成病原菌鑒定，然而鑒定前需培養(yǎng)出單菌落?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)具有快速鑒定病原菌的優(yōu)點(diǎn)，可將已培養(yǎng)的病原菌鑒定時(shí)間縮短至數(shù)分鐘，成為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)鑒定方法[1]。MALDI-TOF MS還能直接檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)和尿液等體液中的病原菌，省去了培養(yǎng)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步縮短了病原菌的鑒定時(shí)間[2-3]。由于標(biāo)本中存在影響質(zhì)譜峰質(zhì)量的細(xì)胞、蛋白質(zhì)等干擾因素，需要對(duì)標(biāo)本中病原菌富集純化后方可提高M(jìn)ALDI-TOF MS鑒定的準(zhǔn)確率。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用的富集純化方法處理時(shí)間均較長(zhǎng)，操作繁瑣。本研究利用UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)中段尿標(biāo)本進(jìn)行初篩，應(yīng)用2個(gè)針式過(guò)濾器組成的雙重過(guò)濾器對(duì)初篩陽(yáng)性的中段尿標(biāo)本進(jìn)行雙重過(guò)濾以富集純化病原菌，運(yùn)用MALDI-TOF MS對(duì)濾膜上富集的病原菌進(jìn)行鑒定，旨在為臨床尿路感染病原菌的快速診斷提供簡(jiǎn)單可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源及處理 收集2020年5—8月荊門(mén)市第一人民醫(yī)院門(mén)診及住院疑似尿路感染患者中段尿標(biāo)本1 583份。標(biāo)本采集量約20 mL，并分為3份，分別用于細(xì)菌定量培養(yǎng)及鑒定、UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)和細(xì)菌計(jì)數(shù)陽(yáng)性標(biāo)本的過(guò)濾集菌及鑒定。

1.2主要儀器與試劑 UF1000i全自動(dòng)尿沉渣分析儀、UFII PACK-BAC稀釋液(日本希森美康公司)；microflex LT MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀、樣品處理基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、大腸埃希菌DH5α(德國(guó)布魯克道爾頓公司)；哥倫比亞血瓊脂及麥康凱瓊脂(鄭州安圖生物公司)；一次性水系針式過(guò)濾器、水系微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)，可換膜針式過(guò)濾器(桃園醫(yī)療化工儀器廠)；甲酸、三氟乙酸及乙腈(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.3雙重過(guò)濾器制作 上層預(yù)過(guò)濾濾器為5 μm孔徑一次性密閉針式過(guò)濾器，下層濾器為可放置不同孔徑微孔濾膜的可換膜針式過(guò)濾器，兩個(gè)過(guò)濾器直接串聯(lián)成雙重過(guò)濾器。過(guò)濾尿液時(shí)，先將浸泡于去離子水中的0.45 μm微孔濾膜置于可換膜針式過(guò)濾器中，再將裝有尿液標(biāo)本的注射器插入雙重過(guò)濾器接口，按壓過(guò)濾。雙重過(guò)濾器示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 雙重過(guò)濾器示意圖

1.4細(xì)菌定量培養(yǎng)及鑒定 分別取10 μL中段尿接種血瓊脂平板和麥康凱平板，置35 ℃培養(yǎng)18～48 h。將菌落計(jì)數(shù)≥104CFU/mL菌落用牙簽挑取少許涂抹于靶板中，加入1 μL 70%甲酸溶液，待其自然干燥后，再加入1 μL配制好的基質(zhì)溶液，自然晾干后將靶板放入質(zhì)譜分析儀進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定。參考衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T489-2016尿路感染臨床微生物實(shí)驗(yàn)室診斷》[4]，對(duì)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)≥104CFU/mL的中段尿標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定。2種菌生長(zhǎng)標(biāo)本僅優(yōu)勢(shì)菌納入鑒定范圍，培養(yǎng)后菌落數(shù)占比>50%的細(xì)菌判斷為優(yōu)勢(shì)菌。2種以上細(xì)菌生長(zhǎng)標(biāo)本視為污染菌，不納入本研究。

1.5UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù) 取中段尿3 mL，按UF1000i全自動(dòng)尿沉渣分析儀要求進(jìn)行細(xì)菌(包括真菌)計(jì)數(shù)檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[5]，細(xì)菌計(jì)數(shù)閾值判斷標(biāo)準(zhǔn)為≥105個(gè)/mL。

1.6雙重過(guò)濾法集菌及鑒定 用無(wú)菌注射器抽取UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)≥105個(gè)/mL的中段尿5 mL，插入雙重過(guò)濾器接口，輕輕按壓注射器過(guò)濾尿液，過(guò)濾完畢后吸取1 mL無(wú)菌去離子水洗滌過(guò)濾。用接種環(huán)刮取下層過(guò)濾器濾膜上的細(xì)菌并涂抹于靶板，按常規(guī)方法操作并進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定。同時(shí)將濾膜上的刮取物涂抹于潔凈的玻片上進(jìn)行快速革蘭染色。MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果判斷：當(dāng)鑒定分值≥1.700時(shí)為鑒定結(jié)果可信，鑒定分值<1.700時(shí)為鑒定結(jié)果不可信。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分?jǐn)?shù)表示。利用配對(duì)χ2檢驗(yàn)及Kappa一致性檢驗(yàn)，分別比較UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)與定量培養(yǎng)、雙重過(guò)濾法與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果差異及一致性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)及與定量培養(yǎng)結(jié)果比較 1 583份中段尿標(biāo)本中，UF1000i篩選出細(xì)菌計(jì)數(shù)≥105個(gè)/mL標(biāo)本381份(24.1%)，其中培養(yǎng)后菌落數(shù)<104CFU/mL標(biāo)本109份，菌落數(shù)≥104CFU/mL標(biāo)本272份；1 202份細(xì)菌計(jì)數(shù)<105個(gè)/mL標(biāo)本中，培養(yǎng)后菌落數(shù)<104CFU/mL標(biāo)本1 183份，菌落數(shù)≥104CFU/mL標(biāo)本19份，細(xì)菌漏檢率為6.5%(19/291)。見(jiàn)表1。UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)閾值設(shè)置為≥105個(gè)/mL時(shí)，UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)與定量培養(yǎng)結(jié)果的陽(yáng)性符合率為93.5%(272/291)，陰性符合率為91.6%(1 183/1 292)，總符合率為91.9%(1 455/1 583)。2種方法陽(yáng)性率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但檢測(cè)結(jié)果一致性較好(kappa=0.759)。

表1 UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)與細(xì)菌定量培養(yǎng)結(jié)果比較

2.2雙重過(guò)濾法與培養(yǎng)法鑒定結(jié)果比較 細(xì)菌培養(yǎng)菌落數(shù)≥104CFU/mL且為單一菌生長(zhǎng)標(biāo)本共229份，其中，雙重過(guò)濾法鑒定出細(xì)菌的標(biāo)本為211份，鑒定符合率為92.1%(211/229)，其中革蘭陰性菌鑒定符合率為94.7%(177/187)，革蘭陽(yáng)性菌鑒定符合率為84.6%(33/39)，真菌鑒定符合率為33.3%(1/3)。43份標(biāo)本為2種菌混合生長(zhǎng)，雙重過(guò)濾法未能可靠地鑒定出2種混合菌，鑒定的細(xì)菌主要為優(yōu)勢(shì)菌，鑒定符合率為72.1%(31/43)。見(jiàn)表2。381份UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)陽(yáng)性的中段尿標(biāo)本中，272份標(biāo)本菌落數(shù)≥104CFU/mL，雙重過(guò)濾法鑒定出細(xì)菌生長(zhǎng)標(biāo)本242份，與培養(yǎng)法的鑒定符合率為89.0%(242/272)。2種方法檢測(cè)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但一致性較好(kappa=0.822)。

表2 雙重過(guò)濾法與培養(yǎng)法鑒定結(jié)果比較

2.3雙重過(guò)濾法與培養(yǎng)法中段尿標(biāo)本處理流程及周轉(zhuǎn)時(shí)間比較 雙重過(guò)濾法利用UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行快速初篩，初篩陽(yáng)性標(biāo)本雙重過(guò)濾集菌后直接進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定。2種方法的中段尿標(biāo)本處理流程見(jiàn)圖2。傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，但中段尿標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間約需18～48 h。雙重過(guò)濾法在收到標(biāo)本后的5 min內(nèi)完成細(xì)菌計(jì)數(shù)，15 min內(nèi)完成標(biāo)本過(guò)濾集菌及靶板點(diǎn)樣，30 min內(nèi)完成細(xì)菌鑒定。雙重過(guò)濾法中最為關(guān)鍵的尿液標(biāo)本過(guò)濾集菌僅需2～3 min。

圖2 培養(yǎng)法、雙重過(guò)濾法的標(biāo)本處理流程與時(shí)間軸

3 討論

本研究運(yùn)用的微孔濾膜雙重過(guò)濾法采用2個(gè)針式過(guò)濾器直接串聯(lián)成的雙重過(guò)濾器，2～3 min內(nèi)完成尿液標(biāo)本的過(guò)濾集菌，耗時(shí)短，過(guò)濾效率高，操作簡(jiǎn)單，該雙重過(guò)濾方法聯(lián)合UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)和MALDI-TOF MS直接對(duì)尿液中的病原菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定，為臨床尿路感染快速診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

鑒于MALDI-TOF MS直接檢測(cè)尿液中病原菌的菌量至少需要105CFU/mL[6]，以及尿路感染患者尿液中的病原菌菌落數(shù)通常高于104～105CFU/mL[7]，本研究通過(guò)UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)來(lái)確定尿液標(biāo)本是否需要進(jìn)行過(guò)濾集菌及鑒定。1 583份尿液檢測(cè)結(jié)果顯示，UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)與定量培養(yǎng)結(jié)果的符合率達(dá)到91.9%，2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性較好(kappa=0.822)。研究表明，通過(guò)合適的閾值設(shè)置，UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)可作為MALDI-TOF直接檢測(cè)尿液中病原菌的檢測(cè)指征與尿路感染的初篩指標(biāo)，快速篩選出培養(yǎng)陰性占大多數(shù)的尿液標(biāo)本，減少過(guò)濾及鑒定工作量。UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)也正好彌補(bǔ)雙重過(guò)濾法不能計(jì)數(shù)尿液病原菌的不足。此外，由于標(biāo)本中細(xì)菌濃度與MALDI-TOF MS鑒定能力具有相關(guān)性[8]，對(duì)UF1000i細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果不高(105～106個(gè)/mL)的尿液標(biāo)本，可以通過(guò)增加尿量或使用小過(guò)濾器的方法以增加富集的菌量，從而提高M(jìn)ALDI-TOF MS鑒定率。

本研究中，雙重過(guò)濾法對(duì)229份單一菌生長(zhǎng)尿液標(biāo)本過(guò)濾集菌后的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與培養(yǎng)法鑒定結(jié)果的符合率為92.1%，其中革蘭陰性菌鑒定符合率達(dá)到94.7%，革蘭陽(yáng)性菌鑒定符合率為84.6%。3份真菌生長(zhǎng)標(biāo)本只鑒定出了1份，還有10份革蘭陰性桿菌生長(zhǎng)標(biāo)本和6份革蘭陽(yáng)性球菌生長(zhǎng)標(biāo)本未能成功鑒定，可能與以下因素有關(guān)。(1)富集菌中有干擾因素。本研究中所用的上層預(yù)過(guò)濾器的濾膜孔徑為5 μm，只能濾除大多數(shù)直徑大于5 μm的有形成分，不被截留的小于5 μm的有形成分可能會(huì)留在下層0.45 μm孔徑過(guò)濾膜上，從而影響MALDI-TOF MS鑒定。因此，雙重過(guò)濾并不能完全去除尿液中的細(xì)胞及細(xì)胞破碎物、蛋白質(zhì)、色素物質(zhì)等可能的干擾因素。本研究對(duì)5份無(wú)鑒定結(jié)果標(biāo)本的濾膜取菌涂片，革蘭染色后發(fā)現(xiàn)有較多富集菌，但背景不干凈，可能因干擾物質(zhì)影響鑒定結(jié)果。(2)富集菌量較少。尿液經(jīng)預(yù)過(guò)濾器過(guò)濾會(huì)被截留部分細(xì)菌，菌量不高的尿液標(biāo)本過(guò)濾后富集菌量更少，使MALDI-TOF MS檢測(cè)能力明顯降低[6,9-10]。此外，尿液中的真菌孢子、呈鏈狀排列或聚集成團(tuán)的革蘭陽(yáng)性球菌及菌體長(zhǎng)的細(xì)菌均大于預(yù)過(guò)濾器的濾膜孔徑，會(huì)使過(guò)濾后的菌量大大減少。本研究中分別有3份腸球菌與2份葡萄球菌生長(zhǎng)標(biāo)本均由于細(xì)菌聚集，不能從5 μm濾膜濾出導(dǎo)致無(wú)鑒定結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)本中菌量不高，而尿液中細(xì)胞、結(jié)晶等異常成分比較多時(shí)，尿液標(biāo)本常常也無(wú)可靠鑒定結(jié)果。(3)細(xì)菌破壁效果不好。本研究中真菌鑒定率低，除了與富集菌量少有關(guān)，也可能與真菌細(xì)胞壁較難破壞有關(guān)[3,11-12]。本研究中雙重過(guò)濾法對(duì)混合菌生長(zhǎng)尿液標(biāo)本鑒定率雖可達(dá)到72.1%，但鑒定的細(xì)菌主要為優(yōu)勢(shì)菌。由于混合菌檢測(cè)是MALDI-TOF MS技術(shù)的短板，故雙重過(guò)濾法不適合混合菌生長(zhǎng)標(biāo)本的鑒定。

MALDI-TOF MS直接檢測(cè)尿液中病原菌的關(guān)鍵之處在于如何純化富集病原菌。富集的菌量及細(xì)菌的純度與MALDI-TOF MS鑒定的準(zhǔn)確性具有相關(guān)性。目前文獻(xiàn)報(bào)道的純化富集尿液病原菌的方法主要有離心法、短期培養(yǎng)法和負(fù)壓式過(guò)濾法[3,13-14]。研究顯示，離心法聯(lián)合MALDI-TOF MS對(duì)尿液?jiǎn)我痪L(zhǎng)標(biāo)本準(zhǔn)確度介于68.4%～92.9%[3,14]。短期培養(yǎng)法聯(lián)合MALDI-TOF MS鑒定尿液病原菌，4 h培養(yǎng)單一菌檢出率為80.1%，6 h培養(yǎng)檢出率可達(dá)97.1%[13]。國(guó)外Veron等[14]采用負(fù)壓過(guò)濾法聯(lián)合MALDI-TOF MS檢測(cè)尿液病原菌的準(zhǔn)確度為78.9%，高于差速離心法的68.4%，但低于5 h培養(yǎng)法的84.2%。本研究采用注射器按壓過(guò)濾法收集細(xì)菌。雙重過(guò)濾器中5 μm孔徑的上層預(yù)過(guò)濾器對(duì)尿液進(jìn)行預(yù)過(guò)濾，以除去細(xì)胞、結(jié)晶等有形成分，下層可換膜式針式過(guò)濾器用于收菌細(xì)菌，過(guò)濾后直接取濾膜上細(xì)菌涂片行革蘭染色，可輔助判斷集菌情況。該集菌純化法聯(lián)合MALDI-TOF MS對(duì)單一菌生長(zhǎng)尿液標(biāo)本鑒定準(zhǔn)確度可達(dá)92.1%，不亞于上述3種方法。此外，雙重過(guò)濾集菌純化法操作簡(jiǎn)便、快速，2道過(guò)濾步驟一步完成，大多數(shù)尿液標(biāo)本2～3 min內(nèi)完成過(guò)濾集菌，標(biāo)本前處理時(shí)間遠(yuǎn)低于上述3種方法；所用過(guò)濾裝置簡(jiǎn)單拼裝，無(wú)需特殊設(shè)備，成本也比較低。

總之，本研究探索的雙重過(guò)濾裝置純化富集尿液中病原菌的方法，具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)且實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，與UF1000i及MALDI-TOF MS聯(lián)合應(yīng)用，可快速排除與診斷尿路感染。