周霞，張堯，張煥新，孫燕，胡錦鴻

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 園林園藝學院,江蘇 泰州 225300）

免疫力是指人體免疫系統(tǒng)抵御病原體感染的能力。正常人體的免疫力大小保持一定的平衡，太強或太弱都會危害人體的健康。目前，據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的調(diào)查結(jié)果顯示：世界亞健康人口的比例已達到75%，亞健康的人表現(xiàn)為失眠、多夢、不易入睡或白天打瞌睡等癥狀，而亞健康與人體的免疫力低下有關(guān)。因此，增強免疫力對維持人體健康具有重要意義。近來研究表明天然植物多糖、多酚和皂苷等都較理想的免疫增強劑［1-3］。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl）又稱金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）多年生附生草本植物，為名貴的中藥材，享有“仙草之美譽”［4］。多糖和生物堿是金釵石斛中主要的化學活性物質(zhì)［5,6］。研究表明金釵石斛多糖具有較強的免疫增強活性［7］。茶（Camellia sinensis）為山茶科山茶屬植物（Camellia sinensis（L.） O.Kuntze）的葉芽。其主要化學成分是兒茶素類（屬于多酚），現(xiàn)代藥理研究表明茶多酚具有免疫調(diào)節(jié)功能［8,9］。由于金釵石斛具有滋陰降火、提高免疫力、補益脾胃、降低血糖等功效，適用于免疫力低下人群的配方原料［10］；而綠茶中的茶多酚能夠促白細胞介素的合成，激活巨噬細胞（mφ）和T、B 淋巴細胞，提高機體免疫球蛋白的水平，茶多酚可以通過多作用位點來調(diào)節(jié)機體免疫力［11-13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛與綠茶組合物能夠提高免疫力，但其作用機理尚不清楚［14］。因此本研究以小鼠為實驗動物，將二者提取物聯(lián)合使用，研究對機體免疫力相關(guān)指標的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

金釵石斛提取物（規(guī)格3∶1，石斛堿＞1.0%）由贛州華漢生物科技有限公司提供；綠茶提取物（茶多酚＞30%）由遵義陸圣康源有限公司提供；瓊脂糖、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、2-巰基乙醇、硫化鋇等購于百靈威科技有限公司；刀豆蛋白A（ConA）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；綿羊紅細胞（SRBC）、Hank’s 液、牛血清、牛血清白蛋白（BSA）和MTT 等購于上海源葉生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素混合溶液購于上海遠慕生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購于青島捷世康生物科技有限公司；XTT試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司；LDH試劑盒購于武漢默沙克生物科技有限公司；YAC-1細胞購于中科院上海細胞庫；HCl、NaOH、異丙醇和甲醇等均為分析純，由國藥集團上?；瘜W試劑公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6J小鼠，8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2013-0018，體重為18～22 g。飼養(yǎng)環(huán)境條件為室溫20～26 ℃、相對濕度40～70%、光照-黑暗周期12 h。

1.2.2 淋巴細胞體外增殖實驗（XTT 法）

取脾臟組織前配置好完全培養(yǎng)基：RPMI1640 培養(yǎng)液中添加10%小牛血清、1%谷氨酰胺（200 mmol/L）、1%的青霉素（100 U/mL） -鏈霉素（100 μ/L） 及5×10-5mol/L 的2-巰基乙醇，調(diào)pH 至7.0-7.2。

脫頸椎處死小鼠，無菌取脾臟，將脾磨碎后，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)活細胞，調(diào)整濃度為2×107個/mL，取100 μL 加入96 孔板；用完全培養(yǎng)基分別配制不同濃度的金釵石斛提取物和綠茶提取物復方樣液，過無菌濾膜，每孔加入100 μL，對照組加100 μL 完全培養(yǎng)基，每個樣做6 個平行，其中3 個加入7.5 μL ConA 液，最后加入完全培養(yǎng)基使體積至200 μL，使樣品質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，結(jié)束前4 h加入XTT，用酶標儀測定450 nm 處的光密度。計算不加ConA 的孔和加入ConA 的孔的差值，以差值大小表征淋巴細胞的體外增殖能力。

1.2.3 實驗動物處理

設(shè)低（0.16 g/kg BW）、中（0.32 g/kg BW）、高（1.0g/kgBW）三個劑量金釵石斛與綠茶復方實驗組。其中金釵石斛提取物的量分別為0.12、0.24、0.75 g/kg BW，綠茶提取物的量分別為0.04、0.08、0.25 g/kg BW，取30 g金釵石斛提取物和10 g綠茶提取物混合均勻，分別取混合物2.4，4.8和15.0 g加去離子水200 mL，小鼠灌胃體積為10 mL/kg BW。通過灌胃對實驗組動物進行給藥，體積為0.1 mL/10 g BW，對照組給予等體積的溶劑（生理鹽水），每日一次，持續(xù)30 d。

1.2.4 ConA 誘導小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT 法）

實驗動物處理結(jié)束后，在無菌條件下取出脾臟置于無菌Hank’s液的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕將脾臟撕碎，制成單細胞懸液，過200目濾網(wǎng)，洗滌，計數(shù)后，用RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整至3×106個/mL。分兩孔將細胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，其中一孔加入75 μL ConA 液（即7.5 μg/mL），另一孔設(shè)為對照，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前，輕輕吸去每孔中的0.7 mL 上清液，再向其中加入不含小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液和50 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，再向每孔中加入1 mL 酸性異丙醇，用移液槍吹打均勻，使其中的紫色結(jié)晶物質(zhì)完全溶解。在570 nm 波長處測定吸光度值（OD）。最后用加ConA 孔的吸光度值減去不加ConA 孔的吸光度值表示淋巴細胞的增殖能力。

1.2.5 抗體生成細胞檢測

在處理結(jié)束前第5 天，給小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）的壓積羊紅細胞（SRBC）懸液，刺激免疫，5 天后，在無菌條件下取出脾臟，制成單細胞懸液，用RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為5×106個/mL，將表層培養(yǎng)基（1 g 瓊脂糖和100 mL 雙蒸水）加熱溶解后，置于45℃水浴鍋中保溫，加入2 倍濃度的等量Hank’s 液混合，分裝于小試管中，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加入50 μL10% SRBC（v/v，SA 液配制）和20 μL 脾細胞懸液（5×106個/mL），迅速混勻，立即倒于含有薄層瓊脂糖的玻片上，待瓊脂糖凝固之后，將玻片平放在玻片架上，在CO2培養(yǎng)箱中保溫培育1.5 h，然后將用生理鹽水稀釋的補體（1∶8）加入到玻片的凹槽內(nèi)，繼續(xù)保溫培育1.5 h，對玻片溶血空斑數(shù)進行計數(shù)。

1.2.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

在處理結(jié)束前第4 天，對每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）的壓積綿羊紅細胞（SRBC）懸液，4 天后，對每只小鼠腹腔注射3 mL 含有小牛血清的Hank’s 液。頸椎脫臼法處死小鼠后，輕揉小鼠腹部20 次，以充分揉出小鼠腹腔中的巨噬細胞，然后在小鼠腹壁處剪開一個小口，用膠頭滴管吸取2 mL 腹腔懸液于試管內(nèi)。吸取0.5 mL 腹腔懸液，加入至含有0.5 mL 1%的雞血紅細胞懸液試管內(nèi)，充分混勻。吸取0.5 mL 混合液，加入到玻片中的瓊脂圈內(nèi)。放置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)15 min。培養(yǎng)結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞洗掉，將貼壁細胞置于甲醇中固定1 min，再用Giemsa 液染色15 min。蒸餾水洗凈晾干后，顯微鏡檢測，計數(shù)100 個巨噬細胞，計算雞紅細胞吞噬指數(shù)。

1.2.7 自然殺傷細胞（NK）細胞活性測定

處理結(jié)束后，取脾臟制成單細胞懸液，用RPMI 1640 培養(yǎng)液將細胞調(diào)整濃度為2×107個/mL，此為效應(yīng)細胞。實驗前24 h 傳代培養(yǎng)YAC-1 細胞，使用前用Hank's 液洗滌3 次，用RPMI 1640 完全培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為4×105個/mL，此為靶細胞。取效應(yīng)細胞和靶細胞各100 μL （效比1∶50），加入至U 型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔中加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放孔中加細胞和1%NP40各100 μL；上述各項均設(shè)定三個平行對照，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后將96 孔培養(yǎng)板于1 500 r/min下離心5 min，每孔吸取100 μL 上清液置平底96 孔培養(yǎng)板中，并加入100 μL LDH 基質(zhì)液，反應(yīng)8 min后，每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCl，于490 nm 處測定吸光度值（OD），計算NK 細胞活性。

1.2.8 臟器指數(shù)

各組實驗動物處理結(jié)束后，頸脫臼法處死小鼠，取其胸腺及脾臟稱重，計算胸腺和脾臟的臟器指數(shù)，即胸腺/體重和脾臟/體重的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)采用方差分析，P＜0.05 代表組間差異具有顯著性，P＜0.01代表組間差異具有極顯著性；實驗重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛與綠茶復方對體外小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

金釵石斛與綠茶復方對體外小鼠淋巴細胞增殖能力的影響見表1。結(jié)果顯示：在低濃度（2 mg/mL）時金釵石斛與綠茶復方對淋巴細胞的增殖能力無顯著增強；金釵石斛與綠茶復方（3∶1），中濃度（4 mg/mL）和高濃度（8 mg/mL）時均能顯著增強淋巴細胞增殖能力。因此，后續(xù)選擇比例為3∶1 的復合物進行后續(xù)實驗。

表1 金釵石斛與綠茶復方對體外小鼠淋巴細胞增殖的影響（±s）Table 1 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on proliferation of mouse lymphocyte in vitro

表1 金釵石斛與綠茶復方對體外小鼠淋巴細胞增殖的影響（±s）Table 1 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on proliferation of mouse lymphocyte in vitro

注：括號中的比例為兩種提取物的比值；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）。

組別金釵石斛與綠茶（1∶1）金釵石斛與綠茶（2∶1）金釵石斛與綠茶（3∶1）對照（生理鹽水）淋巴細胞增殖能力2 mg/mL 0.062±0.013 0.124±0.022 0.119±0.037 0.056 4 mg/mL 0.103±0.038 0.136±0.027 0.282±0.032*8 mg/mL 0.118±0.088 0.581±0.034*0.372±0.123**

2.2 金釵石斛與綠茶復方對小鼠T 淋巴細胞增殖能力的影響

T 細胞為重要的免疫細胞，主要介導細胞免疫。T 細胞受ConA 刺激后母細胞會發(fā)生增殖反應(yīng)［15,16］。金釵石斛與綠茶復方對小鼠T 淋巴細胞增殖能力的影響見表2，在ConA 的誘導下，小鼠T 淋巴細胞增殖能力隨復方劑量的增加而增大，與陰性對照組相比，低劑量組無顯著性增加（P＞0.05），而中、高劑量組其顯著性增加（P＜0.01）。結(jié)果說明金釵石斛與綠茶復方可顯著增強小鼠的細胞免疫功能,這與Wong 等的研究一致［17］；且本復方中、高劑量對淋巴細胞的增殖率要高于金釵石斛單獨使用（低劑量28.57%，高劑量80.00%）的效果［18］，說明茶葉提取物的加入可以協(xié)同增強金釵石斛對小鼠T 淋巴細胞免疫力。

表2 金釵石斛與綠茶復方對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響（±s）Table 2 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on proliferation of ConA-induced lymphocyte in mice

表2 金釵石斛與綠茶復方對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響（±s）Table 2 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on proliferation of ConA-induced lymphocyte in mice

組別陰性對照低劑量中劑量高劑量動物數(shù)/n 10 10 10 10光密度差值0.142 0.153 0.269**0.476**增值率/%-5.63 89.43 235.21

2.3 金釵石斛與綠茶復方對小鼠抗體生成細胞的影響

抗體生成細胞由B淋巴細胞分化產(chǎn)生，能產(chǎn)生各種免疫球蛋白，介導體液免疫［19］。金釵石斛與綠茶復方對小鼠抗體生成細胞的影響見表3。與陰性對照組相比，低劑量組溶血空斑的增加不顯著（P＞0.05），而中、高劑量組溶血空斑數(shù)顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果說明金釵石斛與綠茶復方能顯著增強小鼠的體液免疫功能，體液免疫功能的增強與免疫球蛋白水平的增加密切相關(guān)［20］。茶多酚可以提高人體血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量而增進人體的免疫力［13］，提示綠茶提取物可能具有重要作用。

表3 金釵石斛與綠茶復方對小鼠抗體生成細胞的影響（±s）Table 3 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on antibody producing cells in mice

表3 金釵石斛與綠茶復方對小鼠抗體生成細胞的影響（±s）Table 3 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on antibody producing cells in mice

組別陰性對照低劑量中劑量高劑量動物數(shù)/n 10 10 10 10溶血空斑數(shù)37.0±3.12 39.5±3.03 44.6±2.37**50.8±1.99**

2.4 金釵石斛與綠茶復方對小鼠腹腔單核/巨噬細胞吞噬能力的影響

金釵石斛與綠茶復方對小鼠腹腔巨噬胞吞噬雞紅細胞的影響見表4。與陰性對照組比較，中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬指數(shù)分別為（P＜0.05＜0.01）和吞噬指率（P＜0.01）均顯著升高。單核/巨噬細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中重要的細胞組分，包括血液中的單核細胞和組織中固定或游走的巨噬細胞，巨噬細胞由單核細胞發(fā)育而成，通過病原體分子模式行使吞噬功能和開啟炎癥反應(yīng)［21］。吞噬指數(shù)/吞噬率升高表示巨噬細胞對異己成分吞噬能力增強，這說明金釵石斛與綠茶復方可以增強小鼠的巨噬細胞吞噬功能,這與Monobe 等人的研究結(jié)果一致［22］。文獻報道金釵石斛對小鼠巨噬細胞吞噬能力影響較小［15］，這意味著復方茶多酚對巨噬細胞吞噬能力起主要作用。

表4 金釵石斛與綠茶復方對小鼠巨細胞吞噬雞紅細的影響（±s）Table 4 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on macrophage phagocytizing chicken red blood cell in mice

表4 金釵石斛與綠茶復方對小鼠巨細胞吞噬雞紅細的影響（±s）Table 4 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on macrophage phagocytizing chicken red blood cell in mice

與陰性對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

組別陰性對照低劑量中劑量高劑量動物數(shù)/n 10 10 10 10吞噬指數(shù)24.1±0.65 25.2±2.10 28.7±0.89**31.1±0.97**吞噬率0.32±0.042 0.30±0.028 0.38±0.063*0.44±0.059**

2.5 金釵石斛與綠茶復方對小鼠K 細胞活性的影響

NK 細胞即天然殺傷細胞，因其無需抗原預先致敏就能破壞靶細胞（如病毒感染的細胞、某些腫瘤細胞核和受損傷的細胞）而得名。NK 細胞是參與固有免疫的重要成員，特別是參與早期防御［23］。金釵石斛與綠茶復方對小鼠K 細胞活性的影響見表5。各劑量組小鼠NK 細胞活性與陰性對照組比較，差異均無顯著性意義（P＞0.05）。說明金釵石斛與綠茶復方不能增強小鼠的NK 細胞活性。然而，有研究報道發(fā)現(xiàn)綠茶提取物可增強NK 細胞功能［24］，本研究中金釵石斛與綠茶復方中的不同成分可能存在相互作用，需進一步研究。

表5 金釵石斛與綠茶復方對小鼠NK 細胞活性的影響（±s）Table 5 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on NK cell activity in mice

表5 金釵石斛與綠茶復方對小鼠NK 細胞活性的影響（±s）Table 5 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on NK cell activity in mice

組別陰性對照低劑量中劑量高劑量動物數(shù)/n 10 10 10 10吞噬指數(shù)46.6±2.1 48.2±2.1 47.6±1.8 49.7±5.7

2.6 金釵石斛與綠茶復方對小鼠體重及臟器的影響

金釵石斛與綠茶復方對小鼠體重以及脾臟和胸腺指數(shù)影響的實驗結(jié)果見表6。A 組為ConA 誘導的小鼠牌淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗小鼠體重增長率,B 組為抗體生成細胞數(shù)實驗小鼠體重增長率，C 組為小鼠腹腔巨細胞吞噬能力實驗小鼠體重增長率，D 組為NK 活性測定實驗小鼠體重增長率。三個劑量組小鼠體重以及脾臟和胸腺指數(shù)在實驗期間分別與陰性對照組比較，差異均無顯著性意義（P＞0.05）。說明受試物不會影響正常小鼠的體重及臟器。

表6 金釵石斛與綠茶復方對小鼠體重增長率及脾臟、胸腺指數(shù)的影響（±s）Table 6 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on the body weight of mice

表6 金釵石斛與綠茶復方對小鼠體重增長率及脾臟、胸腺指數(shù)的影響（±s）Table 6 The effect of complexes of Dendrobium nobile and green tea on the body weight of mice

組別陰性對照低劑量中劑量高劑量動物數(shù)/n 10 10 10 10 A 組20.3±1.2 19.8±1.6 21.0±2.5 19.4±2.0 B 組18.6±3.3 18.1±4.5 21.1±3.4 20.6±3.5 C 組22.9±2.5 23.3±3.2 20.6±4.1 21.4±2.6 D 組17.7±4.3 15.9±2.9 18.3±2.7 17.0±3.2脾臟/體重/（mg/g）4.206±0.237 4.408±0.223 4.733±0.301 4.502±0.350胸腺/體重/（mg/g）2.289±0.294 2.471±0.231 2.555±0.299 2.189±0.236

3 討論

免疫是機體對抗原性異物的識別和清除。巨噬細胞（mφ）吞噬作用、淋巴細胞的增值是機體免疫力高低的重要指標［26］。mφ表達多種模式識別受體（PRR）與病原體有關(guān)的分子模式（PAMP）（高度保守的分子結(jié)構(gòu)包括脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（LTA）、肽聚糖（PGN）、甘露糖、葡聚糖、細菌DNA、雙鏈RNA等）相結(jié)合，病原體被攝入細胞內(nèi)形成吞噬體，隨機在多種溶酶體酶的作用下，實施對病原體的殺傷和分解。同時，mφ借助PRR 識別病原體后，同時被激活，進一步產(chǎn)生和分泌多種趨化因子、細胞因子和化學介質(zhì)，包括MIP-1α/β、MCP-1 和IL-8 等。此外，mφ是機體內(nèi)重要的專職抗原提呈細胞，因著對胞外病原體的吞噬和加工，相應(yīng)蛋白質(zhì)抗原與MHC II類分子形成抗原肽-MHC 復合物（pMHC），并被提呈細胞表面為CD4T 細胞活化提供第一信號。同時，mφ還表達共刺激分子，與T細胞上的配體結(jié)合，提供活化第二信號，啟動T 細胞介導的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［26］。

許多天然產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)的功能，因其在體內(nèi)代謝快，高效低毒，兼有藥物與營養(yǎng)雙重功能越來越引起研究者的關(guān)注。本實驗以金釵石斛提取物和綠茶提取物組成的復方，研究了其對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示該復方可以協(xié)同刺激T、B 淋巴細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時，對腹腔巨噬細胞的吞噬能力也有明顯提高；這種免疫作用隨劑量的增加而增強，表明該復方具有增強免疫力功能。