黃承俊，張文軍，王 格，李 寧

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧沈陽110032）

活體卵母細胞是進行試驗研究、保種育種、動物繁殖等的材料[1-2]。目前，B 超法活體采卵是較為理想的方式，但需要B 超儀與經(jīng)驗豐富的工作人員相配合[3-5]。因此，方便可持續(xù)性獲取活體卵母細胞的方法仍在探索中。

在解剖生理上，空懷牛的卵巢多位于骨盆腔內(nèi)，經(jīng)產(chǎn)及妊娠牛的卵巢往往吊在腹腔靠近體壁處，并由系膜懸掛，具有一定的可延伸性。右側(cè)髖關(guān)節(jié)前水平線稍下的腹壁處是離卵巢最近，且可安裝瘺管的位置[6]。如果卵巢位于腹腔內(nèi)，加上卵巢系膜的延展性，通過此處安裝瘺管，將體內(nèi)卵巢取出具有一定的可行性。如果卵巢位于骨盆腔內(nèi)，將其系膜和韌帶部分割斷，仍具有取出的可能性。本試驗通過瘺管，結(jié)合超數(shù)排卵技術(shù)[7]，進行可持續(xù)性的獲得活體卵母細胞，為卵母細胞的獲取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

沿江初產(chǎn)母牛1頭，3周歲。兩側(cè)卵巢完整，均位于骨盆腔內(nèi)。

1.2 儀器與試劑

SZM7045B1 體視顯微鏡（深圳市泰宇星光電儀器有限公司）、直徑10 cm 瘺管（武漢科立搏牧業(yè)科技有限公司）。

LA1812 PBS磷酸鹽緩沖液（Labcoms）。

1.3 瘺管安裝

1.3.1 術(shù)前準備

試驗牛禁食24 h，禁水12 h。準備好相關(guān)手術(shù)器械和藥品。瘺管用開水燙至軟化。

1.3.2 保定與麻醉

將牛保定在單排結(jié)實的鐵柵欄一側(cè)。術(shù)部去毛和消毒，利用硬膜外腔麻醉法進行麻醉[8]。

1.3.3 安裝瘺管

術(shù)部位于髖關(guān)節(jié)與最后肋骨間靠近髖關(guān)節(jié)一側(cè)。開口上緣在髖關(guān)節(jié)與最后肋骨水平連線下8 cm。用針頭以瘺管塞為中心，上下左右扎4個點位確定位置，并漸退式注入麻藥。沿確定好的范圍剪除皮膚、肌肉和脂肪，并將切口處的表皮與肌肉連在一起進行結(jié)節(jié)縫合。最后裝上瘺管[9]，涂抹上紅霉素軟膏。

1.4 瘺管牛的管理

術(shù)后用多層紗布包裹住瘺管部，并按常規(guī)手術(shù)進行消炎治療，連續(xù)7 d[10]。治療結(jié)束后，牛的精神狀態(tài)恢復正常，即開始采卵試驗。

1.5 系膜的割斷

試驗牛硬膜外腔麻醉后，通過直腸將腹膜貼于瘺管口，用手術(shù)刀將腹膜切開一條能伸進手的裂縫。通過直腸將卵巢固定，將夾有手術(shù)刀片的手通過裂縫伸到卵巢的位置，通過手指把握卵巢的方式，將懸掛卵巢、子宮角的系膜與韌帶部分割斷，同時向瘺管口拉扯，直到卵巢可以取卵為止。連接卵巢、輸卵管的韌帶中有血管，切割點以子宮角處為主。

1.6 卵母細胞的獲取

使用含2 mL PBS液的10 mL注射器，從側(cè)面吸取卵巢表面上2~8 mm 卵泡的卵泡液，將吸取的液體倒入直徑120 mm的細菌培養(yǎng)皿中，并于顯微鏡下觀察統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘺管的安裝（見圖1）

圖1 瘺管的安裝Fig.1 The fistula installed

由圖1 可知，瘺管安裝于牛右側(cè)髖關(guān)節(jié)前水平線稍下的腹壁處，也是離卵巢最近且可安裝瘺管的地方。試驗中未將腹膜打開，瘺管僅安裝在肌肉層。

2.2 卵巢的拉出（見圖2）

試驗牛兩側(cè)卵巢均位于骨盆腔內(nèi)，離瘺管口較遠，需進行系膜割斷手術(shù)。

由圖2可知，兩側(cè)卵巢均有不同程度的囊腫，右側(cè)較為嚴重，直腸把握時可感覺有硬塊存在。囊腫都發(fā)生在卵巢的頂部，在拉出時表現(xiàn)為靠外。

2.3 活體采卵（見圖3）

圖2 卵巢的形態(tài)Fig.2 The feature of ovary

圖3 卵丘-卵母細胞復合體Fig.3 The cumulus-oocyte comples

由圖3 可知，兩側(cè)卵巢表面均無突出的大卵泡。右側(cè)卵巢共吸取3 針，撿卵1 枚。左側(cè)卵巢共吸取6 針，撿卵2枚?；铙w卵均為卵丘-卵母細胞復合體（COC）形態(tài)。

3 討論

本試驗探索1種利用瘺管進行牛活體采卵的方法。共取得卵丘-卵母細胞復合體3 枚，說明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)活體采卵的目的。

本試驗中，瘺管安裝于牛右側(cè)髖關(guān)節(jié)前水平線稍下的位置。該位置位于腹部外側(cè)，也是離卵巢最近且可安裝瘺管的地方。理論上，如果卵巢位于腹腔內(nèi)，右側(cè)卵巢便位于瘺管口靠后一點的位置。此外，牛子宮呈羊角狀，卵巢、輸卵管和子宮角有系膜和韌帶固定。如果將其展開，整個子宮加輸卵管有50 cm 左右的長度[11-12]，足夠?qū)⒙殉怖鲶w外。試驗中未將腹膜打開，瘺管僅安裝在肌肉層，可以降低安裝瘺管的難度，減少試驗牛內(nèi)臟被感染的風險，有利于保護卵巢。本試驗方法在采卵時打開1個裂縫，采卵后裂縫自動愈合，形成封閉的環(huán)境。

試驗牛為初產(chǎn)牛，卵巢位于骨盆腔內(nèi)，不能直接拉出瘺管口，需將子宮角、卵巢的系膜和韌帶進行部分割開。試驗中需兩人配合操作。一人通過直腸固定好卵巢，另一人通過瘺管口將系膜韌帶割斷并拉出卵巢。這種手術(shù)有一定的風險，容易對卵巢、輸卵管供血系統(tǒng)造成損傷或引起子宮脫。因此，試驗中需反復確認手術(shù)的位置。相對初產(chǎn)母牛，經(jīng)產(chǎn)牛和老齡化牛的卵巢則位于腹腔內(nèi)，更接近手術(shù)部位[6]。用淘汰高產(chǎn)母牛做試驗，或許難度較低，價值更大[13]。

試驗共取得3 枚卵子，均為卵丘-卵母細胞復合體形態(tài)。就采卵數(shù)而言，與未實施超排技術(shù)的B超法活體采卵相比差別不大[14-15]。但該方法卵巢囊腫較為嚴重，可能與藥物的使用和手術(shù)應激有關(guān)[16]。解決囊腫問題是提高采卵數(shù)、開展可持續(xù)采卵的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

利用瘺管能夠獲得牛的活體卵，但易引起卵巢囊腫。