許崇利，許崇波，佘玉罕

（1. 吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022；2. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶401331；3. 韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）引起的急性傳染病。大腸桿菌利用菌毛上的抗原（又稱為黏附素）與仔豬小腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，吸取腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素而導(dǎo)致強(qiáng)烈的腹瀉。大腸桿菌（ETEC）的主要致病因子是黏附素和腸毒素[1-4]。目前，已從豬源大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F18、F41、F42、F107 等多種菌毛[5-8]。腸毒素包含耐熱腸毒素（ST）和不耐熱腸毒素（LT）。ST1能夠使小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）升高10倍，而且該毒素有組織特異性[9-11]。LT 由A 亞單位和B 亞單位組成，全LT 或B 亞單位均具有良好的免疫原性。LTA亞單位是大腸桿菌（ETEC）毒素的活性部位，LTB亞單位負(fù)責(zé)與GMl神經(jīng)節(jié)苷脂糖蛋白受體結(jié)合，產(chǎn)生功能性細(xì)孔。LTA亞單位則由孔進(jìn)入，激活胞漿內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶（AC），環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量增加，引起腸道內(nèi)環(huán)境改變，從而導(dǎo)致腹瀉[12-13]。

ECET腹瀉的藥物治療已經(jīng)使菌株產(chǎn)生耐藥性。目前常使用疫苗免疫接種的方式來預(yù)防、控制新生仔豬的大腸桿菌性腹瀉。目前，應(yīng)用的疫苗主要有K88-K99-987P、K88-LTB和K88-K99等基因工程亞單位疫苗[14-15]。本課題組構(gòu)建重組菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)[16-17]。該重組菌株在保留K88ac 和LTB原有抗原性的基礎(chǔ)上，使原本不具有抗原性的ST1被賦予抗原性，并喪失ST1腸毒素的活性；并采用控制不同單因素變量的方法，探索K88ac-ST1-LTB三價(jià)基因工程疫苗菌株最適的培養(yǎng)方法，確定最佳培養(yǎng)條件，并進(jìn)行滅活試驗(yàn)，從而為ETEC疫苗的成功研制和生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

基因工程菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)由許崇波等[15]構(gòu)建。

1.2 試驗(yàn)試劑

肉湯培養(yǎng)基：20.0 g 蛋白胨、5.0 g 牛肉粉、5.0 g 氯化鈉，加蒸餾水定容到1 000 mL，調(diào)pH值至7.5。

LB 培養(yǎng)基：5.0 g 酵母粉、10.0 g 氯化鈉、10.0 g 胰蛋白胨，加蒸餾水定容到1 000 mL。

改良LB培養(yǎng)基：5.0 g酵母粉、8.0 g胰蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g NaCl，加蒸餾水定容到1 000 mL。制備好的3 種培養(yǎng)基需要分別添加一定量的消泡劑。2 mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH值至7.4~7.6，高壓滅菌20 min。

IPTG、聚丙烯酰胺等購自南京海克爾生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉購自上海新睿生物科技有限公司；牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉購自赫澎（上海）生物科技有限公司。

1.3 菌株最佳培養(yǎng)條件試驗(yàn)

1.3.1 最佳培養(yǎng)基的篩選

將制備的LB、改良LB 和普通肉湯培養(yǎng)基分別添加至發(fā)酵罐，每罐10 萬mL，2%比例接種大腸桿菌菌株的種子液，37 ℃通氣培養(yǎng)6 h 后，加入葡萄糖溶液至終濃度0.2%，繼續(xù)培養(yǎng)16 h 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每種培養(yǎng)基重復(fù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)，記錄每種培養(yǎng)基的菌數(shù)，并計(jì)算平均值（CFU/mL）。

1.3.2 最佳誘導(dǎo)劑的篩選

4個(gè)發(fā)酵罐分別加入改良LB培養(yǎng)基，每罐為10萬mL，按照2%比例接種菌株的種子液，37 ℃通氣培養(yǎng)4~6 h后，加入終濃度為0.2%葡萄糖補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每罐分別加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG、1.0 mmol/L的乳糖、10.0 mmol/L的乳糖、100.0 mmol/L的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h，每罐取1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析并檢測目的蛋白表達(dá)量。

1.3.3 乳糖最佳誘導(dǎo)條件的篩選

按照2%比例接種種子液于發(fā)酵罐中，37 ℃培養(yǎng)4~6 h，加入終濃度為0.2%葡萄糖補(bǔ)充碳源，繼續(xù)通氣培養(yǎng)4 h，加入終濃度為100 mmol/L乳糖誘導(dǎo)6 h，期間每隔1 h取1 mL菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)SDS-PAGE 檢測目的蛋白表達(dá)量。

1.3.4 最佳通氣量培養(yǎng)條件的篩選

按照2% 比例分別接種大腸桿菌BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株的種子液至3 個(gè)發(fā)酵罐，每罐10 萬 mL，3 個(gè)罐的通氣量分別為 50、100、500 L/min。37 ℃培養(yǎng)6 h 后，加入終濃度0.2%的葡萄糖補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入終濃度為100 mmol/L 的乳糖誘導(dǎo)6 h，取1 mL 菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)SDS-PAGE 檢測目的蛋白表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 滅活試驗(yàn)

取3 罐菌數(shù)在1.15×1010~1.23×1010CFU/mL 的大腸桿菌菌液，每罐分成9份，共27份。將27份菌液隨機(jī)分成3 組，每組 9 份。將 9 份菌液分為 3 組，每組 3 份，每組分別加入終濃度為0.4%、0.6%和0.8%的甲醛溶液37 ℃滅活。滅活時(shí)間分別為12、24、48 h。滅活的過程中，需要振搖菌液數(shù)次，以保證菌液的徹底滅活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌株生長的影響（見表1）

表1 不同培養(yǎng)基對菌株生長的影響Tab.1 The influence of different media on the growth of strains

由表1可知，配置的3種培養(yǎng)基對細(xì)菌生長影響較大，其中改良LB 培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基的細(xì)菌數(shù)目極顯著高于LB培養(yǎng)基（P<0.01）。從菌株培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性和降低工業(yè)化生產(chǎn)成本角度來說，改良LB 培養(yǎng)基是最適宜培養(yǎng)基。

2.2 不同誘導(dǎo)劑對菌株生長的影響（見圖1、表2）

圖1 IPTG與乳糖誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The induced test results of IPTG and lactose

表2 不同誘導(dǎo)劑對菌株生長的影響Tab.2 The effect of different inducers on the growth of strains

由圖1、表2 可知，分別使用IPTG 和乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，100 mmol/L 乳糖和1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)效果最較好，GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析表明，二者表達(dá)量分別為29.43%和33.24%，考慮生產(chǎn)成本，宜選用乳糖作為誘導(dǎo)劑。

2.3 乳糖不同誘導(dǎo)時(shí)間對菌株生長的影響（見表3、圖2）

由表3、圖2 可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，pH 值先降低后升高，總菌數(shù)和蛋白表達(dá)量也在相應(yīng)增多。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，蛋白表達(dá)達(dá)到最大值。GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析表明，蛋白表達(dá)量為30.02%。

表3 乳糖不同誘導(dǎo)時(shí)間對菌株生長的影響Tab.3 The effect of different induction time of lactose on the growth of strains

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different induced time on the expression of the target protein

2.4 通氣量對菌株生長的影響（見表4）

由表 4 可知，采用改良LB 培養(yǎng)基（10 萬mL）對BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株通氣培養(yǎng)。其中以500 L/min的通氣培養(yǎng)條件培養(yǎng)的菌數(shù)最高，3 種通氣量對目的蛋白的表達(dá)量無明顯差異。

表4 通氣量對菌株生長的影響Tab.4 The effect of ventilation on the growth of strains

2.5 菌株滅活試驗(yàn)結(jié)果（見表5）

表5 菌株滅活試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Strain inactivation test results

選取3 種不同濃度（0.4%、0.6%、0.8%）的甲醛溶液加入培養(yǎng)好的菌液中滅活。由表5 可知，滅活培養(yǎng)菌數(shù)在1.15×1010~1.24×1010CFU/mL 之間的菌液以0.4%甲醛溶液（按菌液終濃度計(jì)算）滅活48 h，可以達(dá)到很好的滅活效果。

3 討論

本研究中，關(guān)于工業(yè)化生產(chǎn)中誘導(dǎo)劑的篩選試驗(yàn)是在培養(yǎng)基配制好的20 萬mL 的發(fā)酵罐中進(jìn)行的。該菌株37 ℃培養(yǎng)4~6 h 后，發(fā)酵罐內(nèi)加入葡萄糖溶液（終濃度0.2%）用以補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)菌株4 h。選取等量的菌液分別添加4 種不同濃度的誘導(dǎo)劑（1.0 mmol/LIPTG、1.0 mmol/L 乳糖、10.0 mmol/L 乳糖和 100.0 mmol/L 乳糖）對菌株展開誘導(dǎo)，使目的蛋白大量表達(dá)。在誘導(dǎo)4 h 后每種濃度各提取1 mL菌液，在低溫（4 ℃）條件下，5 000 r/min離心 5 min，使用 100 μL 10 mmol/L Tris·Cl（pH 值 8.0）重懸菌體沉淀。依據(jù)所收集的試驗(yàn)材料使用常規(guī)的操作方法進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)分析，得到的目的蛋白表達(dá)含量依次為33.21%、8.27%、26.39%、29.44%。根據(jù)研究資料，生產(chǎn)與檢驗(yàn)所培養(yǎng)的菌種使用的培養(yǎng)容器等條件不同，于37 ℃溫度下進(jìn)行搖床，振蕩培養(yǎng)2 h后，使用IPTG（終濃度為1.0 mmol/L）誘導(dǎo)4 h 后，可收獲所需的菌液，吸取1 mL菌液，4 ℃、5 000 r/min 離心5 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris·C（lpH 值8.0）重懸菌體使其沉淀，并按照常規(guī)的方法步驟進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，所獲得的目的蛋白表達(dá)量在40%左右。

上述2次試驗(yàn)中，同是IPTG作為誘導(dǎo)劑的情況下蛋白的表達(dá)量卻相差較大。原因可能是2次誘導(dǎo)蛋白的容器不同，培養(yǎng)的體系差別較大，補(bǔ)料條件不同，通氣條件有差別，加入誘導(dǎo)劑時(shí)的菌液濃度有差別，因此導(dǎo)致2種情況下蛋白的表達(dá)量差別較大。

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，改良LB 中的培養(yǎng)菌數(shù)比LB 的高，比普通肉湯的低一點(diǎn)。改良LB批次之間差異小，能夠保持疫苗的免疫原性和質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，且其生產(chǎn)成本比普通肉湯低50%以上。在工業(yè)化生產(chǎn)中選用改良LB培養(yǎng)基具有更大的經(jīng)濟(jì)效益。對于誘導(dǎo)劑來說，乳糖的加入濃度為100 mmol/L 且誘導(dǎo)時(shí)間在6 h 以上，目的蛋白的表達(dá)量較多。重組菌株中蛋白的表達(dá)，運(yùn)用的是乳糖操縱子的原理（乳糖操縱子會轉(zhuǎn)錄表達(dá)β-半乳糖苷酶）。使用乳糖作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)的效果好且價(jià)格比IPTG低，更加適合于工業(yè)化的大量生產(chǎn)。在大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)通入無菌空氣維持罐內(nèi)的氧溶解度，可促進(jìn)其大量繁殖。本試驗(yàn)用10萬mL發(fā)酵罐展開培養(yǎng)，在相同的培養(yǎng)條件下對3種不同通氣量進(jìn)行比較。在不影響蛋白相對表達(dá)量的情況下，培養(yǎng)菌數(shù)最高是500 L/min的通氣量。由于本次試驗(yàn)所用菌株其質(zhì)粒之中所含有的生物公害——卡那霉素抗性基因，所以在使用時(shí)必須滅活。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，終濃度0.4%的甲醛溶液在37 ℃下，攪動(dòng)、滅活48 h效果最佳。

4 結(jié)論

本研究在成功地構(gòu)建BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)重組表達(dá)菌株基礎(chǔ)上，從培養(yǎng)基的選取、通氣量的多少、誘導(dǎo)劑的選擇以及其對應(yīng)的誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)時(shí)間及濃度）4個(gè)方面對其培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，改良的LB 培養(yǎng)基為培養(yǎng)該菌株的最適宜培養(yǎng)基，100 mmol/L乳糖誘導(dǎo)6 h，可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益最大化，同時(shí)確定在20萬mL發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組菌株的最適宜通氣量為500 L/min。滅活試驗(yàn)結(jié)果表明，37℃0.4%甲醛滅活48 h，滅活效果徹底。

本研究探索K88ac-ST1-LTB三價(jià)基因工程疫苗菌株最適的培養(yǎng)方法，確定最佳培養(yǎng)條件并進(jìn)行滅活試驗(yàn)，從而為ETEC疫苗的成功研制和生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。