龍朦朦，劉東, ，楊芳，顧寧*

（1. 東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院，江蘇 南京 210096；2. 皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012）

超聲醫(yī)學技術是將醫(yī)學與生物技術、電子科技以及光學等高科技技術相結合的一門技術，其幾乎應用于臨床醫(yī)學的各個階段，包括常規(guī)篩查、診斷測試、疾病分期、手術輔助和治療后監(jiān)測[1-2]。在超聲醫(yī)學中，超聲波的應用最為廣泛，特別在超聲成像領域[3]。超聲成像具有使用方便、無創(chuàng)、動態(tài)觀察、實時檢測、無放射性污染、生物安全性高等優(yōu)點，是一種廣泛應用于多種疾病診斷的工具[4]。微泡（microbubbles，MBs）由于在超聲作用下具有獨特的非線性效應和強聲散射，有利于獲得增強的超聲造影圖像[5]。Gramiak和Shah在對主動脈根部超聲心動圖的觀察中首次提出氣泡具有增強超聲信號的作用[6]，此后，微泡作為超聲造影劑受到越來越多的重視，并逐步在臨床上得到應用。

微泡一般由氣核和穩(wěn)定殼膜組成。氣泡的包被材料一般是由脂質、聚合物或蛋白質組成，它們應具有良好的生物兼容性且靜脈注射時比較安全。其中磷脂作為微氣泡的殼膜比交聯(lián)的聚合物硬殼更具柔韌性，超聲作用下，更易收縮、破裂、彎曲或再鋪展，從而增強微泡對聲波的敏感性[7]。因此，與其他類型的微泡相比，脂質微泡具有更好的應用前景。市售的超聲造影劑如Definity?、Lightity?、SonoVue?、Levovist?等都采用了脂質殼膜[8]。

隨著脂質微泡的發(fā)展，其不僅作為超聲造影劑對血栓、動脈粥樣硬化斑塊、炎癥區(qū)域和腫瘤生長相關的血管生成進行分子成像，還可以作為超聲靶向觸發(fā)的藥物和基因傳遞系統(tǒng)，成為一種治療工具[9]。靶向配體通過脂質微泡表面所修飾的聚乙二醇（PEG）結合到微泡表面，藥物負載在脂質外殼中，形成能夠靶向特定區(qū)域的載藥脂質微泡[10]。作為藥物遞送系統(tǒng)，載藥脂質微泡具有降低藥物使用劑量、靶向定位釋藥、減輕毒副作用、提高治療效果等優(yōu)點，實現(xiàn)診斷-治療一體化[11]。近年來，脂質微泡引起眾多研究者的關注，并被設計出各種各樣用于多模式分子成像、腫瘤治療、溶栓、心血管給藥和跨血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）給藥等的載藥脂質微泡[12-14]。本文首先對脂質微泡的結構進行分析，然后介紹脂質微泡常見載藥方法，最后對其在超聲醫(yī)學技術上的應用進行闡述，并對未來的發(fā)展進行展望。

1 脂質微泡的結構

脂質微泡主要由脂質殼和氣核組成。脂質外殼包括穩(wěn)定的脂質層和乳化劑。組成脂質微泡的每個組件均可影響微泡的穩(wěn)定性和功能性，例如使用氧氣作為填充氣體對于需要快速氧氣輸送的應用有其必要性[15]，但對于需要更長循環(huán)時間的診斷應用效果較差。因此，可溶性較差的氣體，如全氟碳化合物（PFC），通常被選擇用于診斷應用[9]。針對不同的應用，可以通過調節(jié)表面連接的化學成分對微泡外殼進行設計和優(yōu)化。例如，可以通過化學反應對PEG-脂質進行修飾，從而開發(fā)出具有靶向功能并能屏蔽配體介導的先天免疫反應的脂質微泡[10]。以下對載藥脂質微泡的主要成分及其影響微泡穩(wěn)定性的可能機制進行介紹。

1.1 氣核

氣核是微泡系統(tǒng)的關鍵功能元件，大多選擇六氟化硫（SF6）、全氟乙烷（C2F6）或全氟丙烷（C3F8）等高相對分子質量、低溶解度氣體作為氣核成分，這類氣體不易從微泡中溢出，能有效保持微泡的穩(wěn)定性，延長微泡在血液中循環(huán)時間，表現(xiàn)出更高的回聲[16]。對于氧氣、硫化氫、氙氣、一氧化氮等治療性氣體輸送，氣核僅僅是被輸送的治療“貨物”[17]，但在超聲成像應用中，氣核對聲波具有高度響應性，在毫米級縱向超聲波傳播過程中，氣核的非線性振動能產生很強的聲散射信號，用于圖像增強[18]。此外，氣核在超聲波的刺激下可能會塌陷（即慣性空化），產生剪應力，導致血管通透性增加[13]，利于藥物或基因輸送[19]。

1.2 脂質殼

脂質殼通常由具有較長脂肪鏈的高度飽和、穩(wěn)定性高的磷脂組成，例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺（DPPE）等。用于微泡設計的脂質由親水性（鹽）頭基和疏水（油）烴尾部組成。頭基通常是兩性離子成分，如磷膽堿（PC）或磷乙醇胺（PE），其還可以通過化學方法來調節(jié)微泡特性，例如，帶電的頭基可以被取代，以允許DNA或帶相反電荷的聚離子的沉積，以用于逐層組裝[20]。與脂質體一樣，脂質微泡的脂質殼層可以通過化學修飾來調整性能，為診斷和治療應用提供了一個有用的平臺。脂質分子的碳氫化合物尾部，通常選擇溶解度低、堆積順序高且可顯著降低表面張力的飽和的雙酰基鏈。對于飽和的雙酰化鏈狀脂類，亞甲基的加入增加了脂類分子之間的疏水性和范德華引力，從而增加了殼層的剛性[21-22]。與較短的脂鏈相比，這種剛性通常導致較低的氣體滲透性、較大的剪切力和擴張黏彈性。因此，含有較長?；湹闹|組成的微泡更加穩(wěn)定，易于長期保存。

1.3 乳化劑

乳化劑在微泡制劑中無處不在，它們能增加微泡的產量和穩(wěn)定性，其通常是磷脂錨定的PEG（如DSPE-PEG2000等）[23]。乳化劑的主要作用是促進產生微泡，并防止乳化液和氣泡在形成過程中的聚結。PEG乳化劑可以通過分子間相互作用促進脂質外殼-微泡的相互融合，從而有助于脂質微泡的形成。此外，PEG乳化劑可能會擾亂脂質基質，使脂類更容易在微泡表面進行融合和鋪展。一旦脂質單層形成，PEG就會形成一種立體刷，通過空間斥力來抑制微泡的融合，并且PEG立體刷可以防止血漿蛋白吸附在微泡表面，保護微泡免受調節(jié)和過早清除，還可以將配體從微泡外殼上延伸出去，以更好地將這些配體暴露于靶受體[24]。通過PEG進一步對微泡進行化學修飾，還可實現(xiàn)不同的生物醫(yī)學應用。對于核酸輸送，微泡中可以加入PEG化脂質，以克服陽離子脂質在組織中的堆積、顆粒聚集和毒性，同時延長微泡在體內的壽命[25]；對于藥物輸送，PEG能導致細胞膜上的脂質有序性下降，從而增加膜流動性，使裝載在微泡中的藥物分子更易于轉移到相鄰的細胞膜，然而，該現(xiàn)象受各種其他配方和生理因素的影響，因此不能僅由PEG濃度進行控制[8,26]。

2 脂質微泡載藥方法

脂質微泡作為藥物遞送系統(tǒng)，將藥物負載到微泡中并確定微泡中的載藥量至關重要，它直接影響到目標部位藥物濃度。然而，由于影響藥物和微泡的穩(wěn)定性及性能的參數(shù)多種多樣，該實現(xiàn)過程具有一定的復雜性[8]。到目前為止，已有不少研究報道了將藥物負載到脂質微泡的不同技術，并研究了不同量化方法以及局限性，如圖1所示[27]。

圖 1 脂質微泡的不同負載技術示意圖[27]Figure 1 The illustration of different loading techniques for lipid microbubbles[27]

2.1 直接摻入

脂質微泡最簡單的負載方法是將藥物直接結合到微泡的外殼中。其脂質殼具有兩親性結構，因此能夠負載兩親性[28]、親水性[29]或疏水性藥物[30]。該方法操作簡單，藥物在超聲啟動后能夠迅速釋放，但藥物可能會影響外殼的穩(wěn)定性和微泡行為，且微泡釋放可能發(fā)生在體內微泡易被捕獲的區(qū)域，如肺[31]、脾臟[32]或肝臟[33]。微泡的載藥量可用已知的載藥面積、疏水性和溶解度等參數(shù)來估算，也可采用離心法測量，通過離心將微泡與游離藥物分離，進而將載藥脂質微泡進行破膜處理，釋放出所負載藥物后測定藥物濃度[34]。

2.2 靜電作用

通過靜電相互作用可以實現(xiàn)親水性藥物或藥物載體在微泡表面的直接結合[35]。一般通過設計具有與藥物或藥物載體相反電荷的微泡，經過靜電吸引的作用將藥物或藥物載體結合在微泡表面?？梢愿鶕?jù)實驗需要對微泡表面的電荷性質進行設計，例如，微泡使用羥基、磷酸基和羧基進行修飾則會產生負電荷，使用質子化的氮基團（胺、三甲胺）進行修飾則會帶正電荷。

2.3 藥物載體的偶聯(lián)

藥物載體通常需要連接到微泡外殼上實現(xiàn)載藥，在這些情況下，藥物通常被裝載到第二藥物載體，即聚合物納米顆?；蛑|體中，并通過靜電作用或化學結合的方式偶聯(lián)到微泡上[36-37]。這種方式可以通過藥物包埋降低藥物的系統(tǒng)毒性；此外，與直接摻入殼體相比，藥物載體與殼體的偶聯(lián)可以潛在地提高微泡的載藥量。Kheirolomoom等[38]計算出大約多達10 000個100 nm的脂質體通過親和素-生物素連接裝載到平均直徑為1.7 μm的單個微泡上，與單個微泡相比，僅通過附著這些脂質體就可使表面積增加近35倍[39]。通常通過功能配體將載體與殼膜進行結合，常見的連接劑是PEG，原因是其毒性低、成本低、易于操作，且易得到不同形式的PEG及其偶聯(lián)物[40]。對于脂質微泡，PEG可以在微泡制備前進行連接，以減少易碎微泡的處理步驟，或者將具有官能團的PEG-脂質結合物在微泡制備過程中直接摻入。未反應的PEG分子可以通過洗滌和尺寸排除色譜（SEC）從微泡中分離，并通過折射率檢測進行定量[41]。

2.4 親和素-生物素非共價鍵結合

親和素-生物素是常用的非共價鍵之一，其使用簡單，且易獲得帶有生物素或親和素配體的PEG連接物或PEG-脂質結合物。親和素-生物素對廣泛的緩沖條件具有高度的耐受性，因此常用來制備脂質微泡用于藥物、核酸或成像劑的遞送[42]。一般通過廣泛使用的熒光生物素或親和素來定性確定摻入微泡外殼中的物質，也可通過使用2-（4'-羥基偶氮苯）苯甲酸（HABA）的比色和熒光測試快速測定樣品中的生物素水平以定性測量結合在脂質微泡上的藥物或其他物質[43]。然而，有些微泡制劑中使用的生物素化脂質的比例很低，通常物質的量比介于5% ～ 10%，因此以該種方式研究微泡，即使是熒光HABA分析也難以確定生物素的數(shù)量[27]。

2.5 碳二亞胺化學交聯(lián)

在碳二亞胺化學交聯(lián)反應中，羧基通常先使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）或N-羥基磺基琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亞胺（EDC）活化成能與氨基形成共價鍵的配體化合物，再與氨基反應生成碳二亞胺。具有羧基的脂質微泡外殼可被EDC/NHS活化以結合使用氨基官能化的藥物或藥物載體[44]，也可以將含有羧基的藥物或藥物載體使用EDC/NHS活化后與具有氨基基團的脂質微泡進行反應，從而將藥物或藥物載體連接在脂質微泡表面[45]。脂質-PEG-NHS結合物可在脂質微泡制備過程中直接摻入，然而以這種方式形成的碳-氮鍵具有不可逆性。此外，由于反應試劑對溫度、pH和時間的敏感性，導致該類反應的進行和優(yōu)化具有挑戰(zhàn)性。

2.6 巰基鍵結合

脂質微泡表面的PEG可使用馬來酰亞胺或含吡啶基二硫化物修飾，使用巰基功能化的藥物能與馬來酰亞胺或含吡啶基二硫化物反應生成硫醚鍵和二硫鍵，從而將藥物連接在脂質微泡上[46]。馬來酰亞胺試劑比EDC/NHS更穩(wěn)定，并能形成穩(wěn)定的硫醚鍵。馬來酰亞胺基團的存在可采用市售的熒光分析試劑盒或分光光度法[47]來檢測；含吡啶基二硫化物與巰基形成的二硫鍵，可用340 nm處的吸光度檢測[48]。

3 載藥脂質微泡在超聲醫(yī)學技術上的應用

微泡早期在超聲醫(yī)學技術上主要應用于超聲分子成像領域，隨著微泡技術的發(fā)展，微泡除了作為超聲造影劑增強超聲信號外，還可以作為超聲介導的藥物遞送系統(tǒng)，通過超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術將藥物靶向遞送至病灶區(qū)域并釋放出所負載藥物，實現(xiàn)診斷-治療一體化[49]。研究顯示超聲能夠增加微血管壁的通透性，同時也能促進藥物外滲和向靶組織的輸送；臨床前研究也表明，超聲與微泡聯(lián)合使用可增加細胞膜的通透性，從而增強分子、納米顆粒和其他治療劑的組織分布和細胞內藥物傳遞[19]。通透性增強的機制是通過高強度超聲波和微泡相結合產生的一種“聲空化”效應，在低超聲強度（0.3 ～ 3 W · cm-2）下，聲空化可能是由微泡穩(wěn)定運動引起的，也稱為穩(wěn)定空化；而在較高的超聲強度（大于3 W · cm-2）下，聲空化通常伴隨著微泡的爆炸性增長和崩塌的慣性空化[50]。

利用微泡進行的超聲治療已被證明是一種通過微泡增強微血管通透性來提高藥物攝取率的高效方法，而且微泡介導的藥物輸送可以潛在地克服對周圍正常組織的不可逆熱損，能減輕藥物對正常組織的毒性作用[19]。與其他類型的微泡相比，脂質微泡柔性更好，對臨床超聲頻率的刺激表現(xiàn)出更好的應答，并且脂質可以在所含氣體和周圍血液之間形成一致的單層屏障，以防止注射后血栓的形成，因此脂質微泡在超聲醫(yī)學領域被廣泛使用[5]?，F(xiàn)從超聲分子成像、癌癥治療、超聲溶栓、跨血腦屏障給藥等方面闡述脂質微泡在超聲醫(yī)學技術上的應用。

3.1 超聲分子成像

超聲分子成像是微泡應用的最早領域，在過去幾十年中，微泡超聲造影劑的出現(xiàn)增強了超聲作為一種醫(yī)學成像手段的能力，其可對血栓、動脈粥樣硬化斑塊、炎癥區(qū)域和腫瘤生長相關的血管[51]生成進行分子成像，并促進了癌癥檢測、治療和治療后監(jiān)測的創(chuàng)新策略。近幾年，隨著微泡技術的發(fā)展，脂質微泡用于成像的策略越發(fā)新穎。Meng等[52]設計了一種將脂質微泡轉化為納米粒的超聲（US）響應型光聲成像（PA）探針（Au@lip MBs），用于活體“無背景”的光聲成像。如圖2所示，Au@lip MBs由負載金納米顆粒（Au NPs）的脂質微泡組成。Au@lip MBs在近紅外光（NIR）激發(fā)下具有較低的PA信號，但在超聲脈沖作用下，其會發(fā)生破裂形成納米尺度的Au@lip納米粒子聚集體，由于紅移的表面等離子體共振，這些納米粒子表現(xiàn)出顯著增強的近紅外光聲（NIR PA）信號。因此，通過從超聲后捕獲的PA圖像減去超聲前捕獲的，可以扣除組織背景PA信號，以實現(xiàn)高靈敏度的無背景PA成像。該研究可以啟發(fā)下一代US/PA雙模顯像劑的設計，有望精確檢測具有強吸收背景的組織或具有復雜血管組織的器官。

圖 2 微泡超聲響應型光聲成像探針用于活體“無背景”光聲成像模式圖[52]Figure 2 The illustration of microbubbles (MBs) ultrasound responsive photoacoustic imaging probe for"background-free" photoacoustic imaging pattern in vivo[52]

具有多模式成像功能的脂質微泡成為近期研究的熱點。Huynh等[53]采用了一種使用低頻超聲（LFUS）將卟啉脂質微泡（PMBs）轉化為納米顆粒用作超聲、光聲和熒光成像的三模態(tài)造影劑進行多模式成像。當暴露在超聲波下時，負載全氟碳氣體的PMBs破裂并形成更小的具有與原始微泡相同光學特性的納米顆粒。并且，這種轉化在荷瘤小鼠中是可能的，可以用光聲成像進行驗證。超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIONs）作為無機生物材料，因其獨特的物理、化學和生物學特性而備受關注。SPIONs可被引入到微泡外殼中，由此產生的復合微泡結構已被應用于超聲與核磁共振（MR）相結合的多模式成像和藥物輸送[54]。Yan等[55]采用層層自組裝的方法將磁性Fe3O4納米顆粒通過靜電作用結合到脂質微泡的表面，制備具有超聲和磁場雙重響應特性的磁性脂質微泡；Park等[56]設計了可將不同類型的納米顆粒（包括Fe3O4或Au）附著到表面的穩(wěn)定脂質微泡，用于增強US成像、MR成像或PA成像對比度。此外，還可以錳螯合卟啉脂質為原料，包裹C3F8惰性氣體，制備出集US成像和MR成像于一體的脂質微泡，并在US和MR成像中均表現(xiàn)出良好的對比度增強[57]。

總之，脂質微泡易于功能化，能夠與其他成像技術相結合，以促進多模式成像，這也是脂質微泡在超聲分子成像應用中的一個重要發(fā)展趨勢。隨著成像技術的發(fā)展，脂質微泡的優(yōu)勢也越來越明顯，有望成為新一代成像劑，用于多模式成像，推動智能化醫(yī)學成像技術的發(fā)展。

3.2 癌癥治療

在諸多應用中，超聲微泡（USMB）介導的藥物傳遞在癌癥治療方面顯示出巨大的潛力，同時也是一種相對安全和低成本的方法。微泡可與抗癌藥物或藥物載體結合在一起，以允許同時給藥或單獨給藥。超聲波照射后，血管中的微泡在腫瘤組織經歷空化和塌陷，這些機械效應將會破壞或打開腫瘤組織內皮細胞之間的緊密連接，導致血管通透性增加。因此，抗癌藥物可以在腫瘤部位被特異性地攝取并發(fā)揮治療作用。這種方法允許具有較高選擇性的治療藥物進入腫瘤細胞，因此，超聲引導的靶向給藥可以減少全身毒性，同時確保治療部位的高劑量局部給藥。此外，由于脂質微泡脂質外殼具有兩親性結構且表面易于修飾，其可負載化療藥物[58]、小分子核酸[59]、抗體[35]、光敏劑[60]等不同類別的藥物，故能針對癌癥進行化療、基因治療、免疫治療、光動力治療（photodynamics therapy，PDT），或將幾種療法相結合進行協(xié)同治療，從而提高療效，同時減小對正常組織的毒副作用。例如，Li等[44]設計了一種負載化療藥物多西他賽（docetaxel，DTX）并使用PD-L1單克隆抗體（anti-PD-L1-mAb）修飾的多功能脂質微泡（PDMs），用于肺癌的化療和免疫治療。如圖3所示，圖3A總結了PD-L1介導的免疫化療脂質微泡的合成過程，即DTX負載在脂質微泡的脂質外殼中，PD-L1單抗通過氨基（-NH2）和羧基（-COOH）形成的碳二亞胺連接在脂質微泡表面。如此形成的免疫化療脂質微泡通過尾靜脈注射到體內后，在腫瘤部位給予超聲波照射（見圖3B），通過UTMD技術破裂微泡釋放所包載的抗癌藥物DTX，使DTX在腫瘤部位得到蓄集，達到更高的藥物濃度，微泡在超聲作用下的空化和聲孔效應，促使更多的藥物進入腫瘤細胞，從而提高療效。同時，PD-L1單抗在腫瘤部位可以阻斷免疫抑制的PD1/PD-L1途徑，使功能受抑制的免疫細胞恢復對腫瘤細胞的識別功能，從而達到通過自身免疫系統(tǒng)實施免疫治療，有效抑制腫瘤生長的目的。如此設計的智能化免疫化療脂質微泡，可使藥物在腫瘤部位局部釋放，有效減輕化療藥物以及PD-L1單抗對正常組織產生的潛在毒性。作者通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測顯示，小鼠經PDMs處理后，腫瘤細胞對DTX攝取增加；通過體內熒光成像觀察DTX和PD-L1在腫瘤組織中的分布，結果表明，PDMs不僅可以提高化療效果，而且可以通過促進CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖，降低血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等細胞因子水平來增強抗腫瘤作用。以上結果都表明PDMs具有良好的抗腫瘤作用，并且超聲聯(lián)合免疫化療微泡的協(xié)同治療可能是治療多種惡性腫瘤的一種有潛力的方法，有望為聯(lián)合免疫治療開辟一條新的途徑。

PDT利用光啟動光敏劑，將能量傳遞給組織氧，產生直接導致組織破壞的活性氧物質[61]。其因公認的選擇性、安全性和可重復性已成為許多腫瘤的潛在替代療法[62]。微泡是一種很好的輔助PDT用于癌癥治療的候選材料，原因在于微泡可以增強超聲對比度，有助于更好地定位病變部位，并通過UTMD技術靶向輸送光敏劑，這是提高PDT選擇性的關鍵。You等[63]報道了一種由卟啉接枝脂質（PGL，由雙碳鏈和卟啉組成）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）、DSPE-PEG2000、膽固醇和惰性氟碳氣體混合制備而成的微泡（PGL-MBs）。PGLMBs是一種新穎的基于MBs、LFUS輔助的PDT策略，其具有較高的卟啉負載率，且可以通過US成像進行實時檢測，應用UTMD技術可以有效地將PGL-MBs轉化為卟啉接枝脂質納米粒（PGLNPs），這種“由大到小”結構的轉換能促進光敏劑在腫瘤組織中選擇性積聚，對腫瘤部位進行激光照射后可以對腫瘤起到良好的光動力治療效果（見圖4）。此外，Sun等[64]設計了負載低氧誘導因子-1α小干擾RNA（HIF1α-siRNA）的陽離子PMBs；Zhao等[60]設計了負載乳腺癌分子分型的重要轉錄因子的小干擾RNA（FOXA1-siRNA）的PMBs用于乳腺癌的治療，兩項研究均表明，通過UTMD技術將PDT與基因療法相結合，協(xié)同治療癌癥，均能增強治療效果。

圖 3 新型免疫化療脂質微泡形成過程及協(xié)同治療腫瘤方案[44]Figure 3 The formation process of novel immune chemotherapy lipid microbubbles and collaborative treatment of tumor[44]

圖 4 基于微泡的超聲輔助PDT策略示意圖[63]Figure 4 Schematic diagram of ultrasound-assisted PDT strategy based on microbubbles

腫瘤缺氧被認為是限制癌癥治療成功的一個因素，利用負載氧氣的脂質微泡向腫瘤部位輸送氧氣增強放射治療和PDT等的療效也是腫瘤治療的一個策略[65]。由于微泡具有聲學活性，可利用超聲刺激載氧微泡在缺氧腫瘤部位進行氧氣釋放。Yang等[66]制備了一種負載混合氣體（O2/C3F8）的載氧脂質涂層微泡（OLMs），該微泡可通過超聲控制腫瘤特異性氧氣的輸送。研究表明，OLMs表現(xiàn)出較好的氧氣輸送能力，可用于腫瘤復氧的可控釋氧。McEwan等[67]也研究了在低氧環(huán)境下將載氧微泡與增敏藥物聯(lián)合使用以增強聲動力學效應的可能性，結果表明，這種將氧氣和增敏藥物遞送至缺氧腫瘤的方法，可以顯著提高聲動力治療效果。

微泡用于癌癥的治療主要依賴于UTMD，即利用低頻中功率超聲與微泡聯(lián)合觸發(fā)空化的超聲治療方法[49]，其可以促進負載在微泡中的藥物靶向集中在病灶部位，從而針對性地殺傷腫瘤細胞，同時減輕對正常組織的毒副作用。與其他類型的微泡相比，脂質微泡因其獨特的負載藥物能力以及易于修飾的特性而具有更大的發(fā)展?jié)摿?。近年來，越來越多新型多功能的載藥脂質微泡被報道，顯示出其在超聲醫(yī)學技術上正朝著智能化方向發(fā)展，有望利用其改善癌癥治療效果，為癌癥治療提供可行的新策略。

3.3 超聲溶栓

血栓形成是指血液在血管內形成凝塊，阻塞通過心血管系統(tǒng)的血液流動，是導致心、腦和外周血管事件的關鍵致病因素，也是導致死亡和殘疾的直接原因。血栓形成的臨床研究主要集中在常見的動脈血栓，如卒中或心肌梗死，或靜脈血栓，如深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）；血栓形成也會影響微循環(huán)，對身體健康產生嚴重影響[68]。超聲溶栓（ultrasound thrombolysis，STL）利用微泡與超聲相結合來促進血栓溶解，是一種微創(chuàng)或非侵入性的物理方法。超聲本身就具有增強溶栓作用，而微泡增強溶栓的機制通常歸因于超聲誘導的空化，其能導致聲流效應、軸向流體加速和高速流動梯度，可以穿透和破壞血栓的基礎結構[69]。

利用脂質微泡對血栓進行分子成像以快速定位血栓在STL的應用中至關重要，Wang等[70]報道了一種快速、可靠、高靈敏度的可實現(xiàn)活化血小板特異性CD62p靶向血栓超聲分子成像的方法，首先合成并預先注射反式環(huán)辛烯（TCO）修飾的CD62p抗體（TCO-antiCD62p），CD62p抗體是血小板黏附受體（P-選擇素）的重要靶向探針，當血小板被啟動形成血栓時，外膜與血小板α顆粒的融合使P-選擇素暴露在血小板表面[71-72]。因此，在TCOantiCD62p處理的第一步，血栓可與TCO-antiCD62p非共價結合并相互作用。隨后加入精制的四嗪標記 的 微 泡（tetratrazin-tagged microbubbles，Tetra-MBs），其能與TCO-antiCD62p預處理的血栓或血小板聚集進行快速選擇性反應，從而可以進行實時超聲分子成像。由于微泡在空間和時間上的高度敏感性，這種預靶向策略在分子水平上為早期檢測血栓提供了高精度。此外，Tetra-MBS在生理條件下表現(xiàn)出長期穩(wěn)定性，能夠保持實時監(jiān)測血栓變化的能力。這種基于Tetra-MBs的生物正交靶向分子超聲成像策略也被證明可以成為快速診斷急性血栓形成的一種簡單而有力的工具。該研究為今后開發(fā)診斷、預防和治療急性血栓的智能化創(chuàng)新策略打開了新思路。

最近，不少研究報道了脂質微泡負載溶栓藥物，通過超聲波局部啟動，靶向釋藥抗擊血栓，同時脂質微泡本身在超聲波中產生的空化作用可以在微觀尺度上機械地破碎凝塊，從而取得不錯的溶栓效果。例如，Wang等[73]采用超聲微泡造影劑（SonoVue?）聯(lián)合常見溶栓藥物——尿激酶（urokinase，UK）治療血栓形成，評價尿激酶聯(lián)合超聲、微泡在體內外溶栓治療DVT的效果。在體外，使用形成時間分別為1、3、7、14和21 d的血栓用于溶栓；在體內，用45只成年雜種犬評價體內血栓形成情況。體內外實驗分析表明，與UK單獨使用和UK+US聯(lián)合使用相比，UK+US+MBs的溶栓效果最佳，溶栓率顯著提高，表明超聲與微泡造影劑、尿激酶聯(lián)合應用可能具有協(xié)同溶栓作用，同時超聲和微泡的組合會減少尿激酶的劑量并降低藥物的不良反應。

微泡增強的超聲溶栓治療是增加當前溶栓藥物治療的耐受性和療效的有前途的方法，然而，在血栓部位保持足夠治療濃度的微泡和溶栓藥物仍然是一個挑戰(zhàn)。為此，De Saint Victor等[74]設計了一種新型的具有磁性靶向功能的脂質微泡，負載新型的血栓溶解劑——組織型纖溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，tPA）進行超聲溶栓。該磁性靶向微泡是將粒徑為10 nm的磁鐵納米粒和tPA負載在脂質微泡中形成。實驗使用蘇木素伊紅（hematoxylin & eosin，H&E）染色研究了不同處理對血凝塊結構的影響，結果顯示血凝塊給予有磁場的tPA+US的磁性微泡處理后，與tPA單獨處理、tPA+US處理和無磁場的tPA+US的磁性微泡處理相比，其對血凝塊有明顯的溶解效果。該研究在體外闡明了磁性靶向可以顯著加速超聲時微泡增強的酶促超聲溶栓作用，并有可能減少給藥劑量，使血管再通更快實現(xiàn)。與無磁力的微泡相比，使用磁性靶向時，觀察到的血栓的裂解速率增加了3倍以上。這些結果表明，在微泡介導的超聲溶栓治療閉塞性疾病的應用中，磁性靶向具有增強治療功效和患者耐受性的潛力。

大多數(shù)超聲溶栓研究都基于非阻塞性血栓，主要通過微通道或旁路輸送微泡和溶栓劑。然而臨床上大多數(shù)血栓是阻塞性的，微泡誘發(fā)的聲空化只能發(fā)生在接觸的血栓邊緣，使其溶解血栓的效率降低。Gao等[75]報道了一種將導管定向療法（catheterdirected therapy，CDT）與超聲溶栓技術相結合的溶栓治療方法。CDT也稱為血管內療法，可以機械去除大部分或部分血栓或直接將較高濃度的血栓溶解劑遞送至血管內血凝塊，其是血栓形成疾病的替代方法。CDT可增加血塊中微泡的局部濃度，再進行超聲處理，微泡產生足以擊碎血栓的聲空化。這種簡單的技術可以加快血栓栓塞性血管的再通，并減少溶栓劑的施用，從而改善溶栓效果并降低溶栓相關副作用發(fā)生率。

3.4 跨血腦屏障給藥

BBB限制了分子在人體與腦實質之間的運輸，本質上，只有具有低相對分子質量和疏水性的藥物才能跨過BBB到達腦實質[76]。針對帕金森病、阿爾茨海默病和腦瘤等腦部疾病，需通過特殊的藥物輸送系統(tǒng)將藥物輸送到腦實質中，因此，開發(fā)增強BBB通透性的方法意義重大。通常認為，MBs在聲場中的膨脹和塌陷使細胞膜或微脈管系統(tǒng)發(fā)生通透性變化，從而有利于血管內的藥物或基因向組織遞送。近年來有文獻報道，聚焦超聲（focused ultrasound，F(xiàn)US）結合靜脈注射MBs可用于無創(chuàng)、局部和可逆地打開BBB，實現(xiàn)非侵入性、暫時性和局部性腦內給藥[77]。這項技術通過增加局部BBB的通透性，允許部分大分子和小分子運輸?shù)剿璧拇竽X區(qū)域，而不依賴于增強的滲透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應[78]。脂質微泡由于脂質殼層親脂的性質以及易于功能化和負載治療藥物，并具有良好的生物兼容性，常被用于與FUS相結合打開BBB進行藥物或基因遞送[79]。例如，Huang等[80]通過多聚L-賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）的逐層組裝技術將質粒連接到脂質微泡的表面，在核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）誘導下，使用FUS和裝載DNA質粒的脂質微泡實現(xiàn)基因的腦內靶向輸送；Fan等[81]開發(fā)了負載治療劑[阿霉素（DOX）]并與SPIONs偶聯(lián)的多功能脂質微泡（DOX-SPIONs-MBs），在充當MRI和US雙重造影劑的同時，打開BBB并執(zhí)行磁靶向的藥物輸送；此外，負載DNA（熒光素酶質粒）和偶聯(lián)葉酸的陽離子脂質微泡傳遞系統(tǒng)也被構建并用于BBB開放和選擇性基因傳遞[82]。

超聲啟動MBs可誘導其轉化為納米顆粒（NPs），這種“由大變小”的策略可以進一步增加藥物對腫瘤和腦組織等多種組織的輸送[83]。例如，Zhao等[84]制備了含磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的脂質微泡（PS-MBs），通過UTMD暫時打開腦梗死晚期的BBB，此外，PS-MBs可在超聲波作用下轉化為更易于通過BBB的PS-NPs，然后被活化的小膠質細胞/巨噬細胞（microglia/macrophage，M/M）吸收，實現(xiàn)了針對炎癥區(qū)域的遞送（見圖5）。研究表明，PS-MBs結合超聲暴露可以安全地打開BBB，且所得的PS-NPs可進一步靶向神經炎癥中活化的M/M，而這種靶向性主要歸功于PS頭基的磷酸化-L-絲氨酸。

圖 5 磷脂酰絲氨酸脂質微泡靶向活化的小膠質細胞/巨噬細胞治療卒中炎癥的示意圖[84]Figure 5 The illustration of phosphatidylserine microbubbles targeting activated microglia/macrophages for stroke inflammation treatment [84]

FUS與MBs相結合打開BBB進行藥物或基因的遞送用于治療腦相關疾病，其藥物傳遞效率和機制已在中樞神經系統(tǒng)疾病動物模型中得到了廣泛的研究。這項技術可用于在不發(fā)生腦損傷的情況下，在特定區(qū)域進行非侵入性和暫時性的藥物輸送，屬于較為智能的藥物輸送方式。最近，相關臨床試驗也對FUS與MBs相結合打開BBB的治療策略進行了評估，例如，使用低功率MR引導的經顱FUS和Definity?相結合進行BBB開放的臨床試驗[85]，以及使用非聚焦超聲與SonoVue?相結合打開BBB的臨床試驗[86]。這些臨床試驗招募了膠質母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤和阿爾茨海默病等患者，超聲和微泡的組合被證明可以誘導其腦組織中的BBB開放，而對大腦無明顯的損害。因此，利用超聲和微泡打開BBB正被廣泛應用到臨床研究中。隨著脂質微泡技術的發(fā)展，更加智能化的通過FUS打開BBB的藥物輸送系統(tǒng)有望被設計出來，并向臨床轉化，更進一步推進脂質微泡在超聲醫(yī)學技術上的發(fā)展。

4 總結與展望

微泡的外殼可由多種材料制成，包括蛋白質、表面活性劑、脂質、聚合物和聚電解質多層膜等[87]，與其他類型的微泡相比，脂質微泡具有更多優(yōu)勢，原因在于脂質微泡具有以下特性：1）穩(wěn)定性好。與表面活性劑氣泡相比，脂質微泡具有穩(wěn)定的脂質殼層，并能延長在血液中的循環(huán)時間，造影持續(xù)時間長。2）具有安全性。構成脂質層的磷脂膜具有良好的生物相容性且可以生物降解，對人體無害。3）藥物負載方式多樣性。脂質殼層的兩親性結構，決定了脂質微泡可以負載親水、親油或兩親性藥物，且殼層表面易于修飾，從而可以通過靜電作用、化學反應或配體結合的方式連接更多類型的藥物或配體。4）靶向性。脂質殼層易于功能化，可以連接靶向特定部位的靶分子，增強靶向性。

脂質微泡與超聲波的結合最早應用于超聲分子成像領域，但隨著微泡技術的發(fā)展，除了在診斷領域體現(xiàn)的靶向成像外，脂質微泡作為藥物和基因的輸送系統(tǒng)用于疾病的治療也取得了一定的進展，特別是在跨越BBB的藥物輸送和癌癥治療方面。載藥脂質微泡與超聲相結合除了在分子成像、癌癥治療、超聲溶栓和跨越BBB給藥等方面的應用以外，還可以用于治療泌尿系統(tǒng)感染[42]與結石[88]、黏膜疫苗接種[89]、經皮給藥[90]、治療性氣體輸送[17]等。因此，脂質微泡在超聲醫(yī)學領域表現(xiàn)出來的優(yōu)勢越來越明顯，也逐漸成為一種備選的治療方案，推動智能化超聲醫(yī)學技術的發(fā)展。

然而，載藥脂質微泡仍然存在以下問題需要進一步研究：1）克服脂質微泡與超聲相結合對機體帶來的潛在毒副作用，例如超聲與微泡相結合導致的空化效應對組織或血管帶來的損傷；2）提高脂質微泡的載藥率和包封率；3）提高載藥脂質微泡的靶向性；4）明確載藥脂質微泡在體內的代謝途徑。隨著國內外對載藥脂質微泡研究的不斷深入，相信這些問題都會在將來得到很好的解決?？偠灾?，載藥脂質微泡和超聲波的結合具有很大的應用潛力，不僅可以被設計成為多模式的成像系統(tǒng)，還可以作為藥物遞送系統(tǒng)用于重大疾病的治療，例如癌癥、神經性疾病、腦卒中和血栓等，使超聲醫(yī)學逐漸朝著更加智能化的方向發(fā)展。