趙琳，宋瑞瑞，吳琦，吳希，云振宇

（中國標準化研究院農業(yè)食品標準化研究所，北京100191）

納米材料因其結構單元小、表面積大，在機械、光學、化學及生物學等方面具有良好的特性，在能源、電子、新材料、生物醫(yī)學、組織工程等領域被廣泛應用。近年來，由于植物納米組學的發(fā)展，納米材料的研究和應用延伸至農業(yè)，如納米肥料、納米農藥、納米土壤改良產品等，納米材料的大量生產、加工、運輸及應用，導致其不可避免的進入了環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)[1-2]，不同程度地釋放并積累于土壤中，影響植物微生態(tài)環(huán)境，干擾正常的物質代謝過程[3-5]。因此，納米材料對植物生長的影響逐漸成為一門新興的農業(yè)研究方向。

石墨烯（Graphene）是一種由碳原子以sp2雜化方式形成的六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料，是由英國曼徹斯特大學物理學家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫采用微機械剝離法從石墨中分離出來的[6]。基于不同的功能基團，石墨烯又衍生出氧化石墨烯、磺化石墨烯、熒光石墨烯等[7]。由于石墨烯及其衍生材料具有優(yōu)異的物理性質，在農業(yè)中的應用不斷被挖掘，已經涉及到農藥、肥料、吸附劑等方面[8-10]。氧化石墨烯（GO）是在石墨烯蜂窩狀晶格結構的基礎上，表面連接羧基、環(huán)氧基、羥基、羰基、酯基等含氧官能團，其具有較高的親水性和表面活性，在催化、儲能、過濾等方面具有廣闊的應用空間[11-15]。隨著GO的大量生產及在環(huán)保、農業(yè)生產等領域中的研究和應用，其廢物最終會進入到土壤中，并隨著地表徑流和降水等水流在土壤中遷移，從而影響地下水、土壤微生物、土壤動物、土壤植物等[16-17]。

農作物的質量和安全與人體健康息息相關，因此GO的生物學效應得到了廣泛關注，大量研究發(fā)現(xiàn)其對多種農作物的生長發(fā)育均有不同程度的影響。Chen等[18]研究了0～2 000μg·mL-1濃度下GO對小麥幼苗萌發(fā)和生長的影響，結果表明在125μg·mL-1和250μg·mL-1濃度時，GO對小麥幼苗的根生長具有不同程度的促進作用，而當GO濃度在1 000μg·mL-1以上時，則對小麥幼苗的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制作用隨著濃度的增加而增大，2 000μg·mL-1濃度下小麥幼苗根部的表皮細胞和皮層細胞出現(xiàn)顯著的崩解和疏松，大部分細胞破裂，且根表面吸附有石墨烯，對植物組織結構有顯著損傷；Park等[19]研究發(fā)現(xiàn)適量的GO對擬南芥生長有積極的影響，可以增加根的長度和葉的數(shù)量，促進花芽的形成，同時GO還會影響西瓜的成熟度，增加西瓜的周長和糖分含量；還有研究發(fā)現(xiàn)GO能夠促進甘藍型油菜種子的萌發(fā)，并顯著影響幼苗的生長發(fā)育[20]。玉米是優(yōu)良的糧食作物，其營養(yǎng)價值較高，在我國各個地區(qū)都有種植。GO是否對玉米的生長發(fā)育有影響，目前還沒有確切的結論。本研究以玉米幼苗作為供試植物，檢測分析了不同濃度的GO對玉米生長狀態(tài)、光合作用及酶活力的影響，旨在為石墨烯材料的毒性評價、生態(tài)環(huán)境效應等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

GO分散液采購于江蘇先豐納米材料科技有限公司，為黑色或褐色液體，厚度為1～6層（TEM），片徑0.5～5μm（TEM），濃度10 mg·mL-1。玉米種子采購于北京大京九農業(yè)開發(fā)有限公司，品種為鄭單958，種子發(fā)芽率大于90%。

1.2 試驗處理

選擇籽粒飽滿、大小均勻的玉米種子于1 000 mL燒杯中，用H2O2對種子消毒10 min，蒸餾水沖洗3遍，將種子放置到鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，每顆種子之間的距離約為3 cm，加水至玉米種子高度的1/2處，于室溫黑暗條件下培養(yǎng)，90%的種子根長長到3～4 cm時，轉移至1 000 mL的燒杯中水培，自然環(huán)境下培養(yǎng)24 h后分別轉移至500 mL濃度為0（對照）、25、50、100、200 mg·L-1的GO分散液中培養(yǎng)9 d，每種濃度GO溶液培養(yǎng)的玉米苗不少于8株，每個處理設3個重復。

1.3 生理指標的測量

將幼苗用GO處理9 d后，每個重復隨機挑選5株幼苗用清水洗干凈附著的GO，并用吸水紙輕輕擦干水分，測量主根根長、莖長和葉長，并測定根鮮質量和地上部分鮮質量。

1.4 電鏡表征

取GO處理過的玉米幼苗的根部，用蒸餾水沖洗干凈，再用pH7.2的磷酸緩沖液（PBS）沖洗3次，將根系分散于2.5%的戊二醛中，4℃下固定12 h，用PBS漂洗20 min完成固定，樣品依次經過30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇各20 min進行處理，再用濃度為100%的乙醇處理2次各20 min進行脫水，然后在乙醇∶叔丁醇=1∶1溶液中處理20 min，純叔丁醇30 min，再用純叔丁醇重復1次，將樣品放入-20℃的冰箱冷凍室30 min后，用冷凍干燥儀干燥樣品約4 h，樣品置于樣品臺上，噴金（120 s），用掃描電子顯微鏡觀察（SEM，S-3400N，HITACHI，日本）。

1.5 生化指標測定

1.5.1 葉綠素含量測定

取葉片0.2 g，剪碎，放置于50 mL離心管中，加入25 mL 95%的乙醇，封閉后避光放置24 h待葉片全部變白，使用分光光度計檢測663、645 nm處的吸光值（A值），計算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb），總葉綠素（Ct）的含量（mg·g-1），計算公式為：

式中：A663、A645分別為在波長663、645 nm處的吸光值；V為提取液的總體積，mL；W為葉片鮮質量，g。

1.5.2 酶活性測定

稱取一定質量的根置于預冷的研缽中，按1∶15（g·mL-1）的比例加入含有1%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS（pH 7.8）溶液，研磨至勻漿，12 000 r·min-1、4℃離心30 min，取上清液備用。

酶活性測定方法：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用高錳酸鉀滴定法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法進行測定。

1.6 數(shù)據處理

所有試驗結果以平均值±標準偏差表示。試驗數(shù)據采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，作圖軟件為

Origin。

2 結果與分析

2.1 GO對玉米幼苗生長的影響

從圖1可以看出，GO處理9 d后，相對于對照組，不同濃度GO處理的玉米幼苗根長、莖長和葉長均有不同程度的降低。GO濃度為25 mg·L-1時，玉米幼苗的總體生長減緩情況并不顯著。而當GO濃度達到50、100 mg·L-1和200 mg·L-1時，玉米幼苗的主根根長相對于對照分別降低了39.0%、67.6%和79.8%；葉長分別降低了15.9%、47.5%和49.0%。在GO濃度為100 mg·L-1和200 mg·L-1時，莖的伸長受到顯著影響，相對于對照分別降低26.5%和32.0%。

同樣，GO處理9 d后玉米幼苗各部分的質量也呈現(xiàn)類似的變化（圖2A）。尤其是根鮮質量，隨著GO濃度增加，處理組相對于對照組依次有39.3%、46.4%、71.4%、82.1%的降低。根系生長受到抑制時，根冠比通常會表現(xiàn)出下降的趨勢。如圖2B所示，在各濃度GO處理下，玉米幼苗的根冠比與對照相比顯著下降，分別下降29.3%、39%、53.7%和65.9%。這些結果表明GO在試驗濃度范圍內能抑制玉米幼苗的生長，尤其在GO濃度超過100 mg·L-1時，對玉米幼苗根部的生長抑制效果更加明顯。

2.2 GO對玉米幼苗根部形態(tài)的影響

使用SEM對玉米根系的表面結構進一步觀察，與對照組（圖3A和圖3B）相比，50 mg·L-1GO處理9 d后，玉米幼苗根尖未見明顯結構變化（圖3C），成熟區(qū)部分表面光滑、有根毛（圖3D），總體上未見有明顯損傷。而200 mg·L-1GO處理組的玉米幼苗根尖部分有明顯的結構變化，根冠與分生區(qū)之間界限消失（圖3E），成熟區(qū)表面褶皺且破損，出現(xiàn)明顯的損傷痕跡（圖3F）。SEM結果與生理指標測試結果相符，證實了高濃度的GO對玉米幼苗根部生長發(fā)育有明顯影響。

2.3 GO對玉米幼苗光合作用的影響

葉綠素是高等植物進行光合作用的主要色素，主要有葉綠素a和葉綠素b兩種。葉綠素含量會影響植物的光反應，進而影響光合效率。如圖4所示，Ca、Cb、Ct含量均隨著GO濃度的增加表現(xiàn)出類似的規(guī)律，即先增加后降低。在25 mg·L-1時，Ca、Cb、Ct含量較對照分別增加18.5%、22.9%和20.0%，而當GO濃度達到200 mg·L-1時，各指標較對照分別下降了21.2%、8.6%和17.8%。總體來看，Ca、Cb、Ct含量水平只有在高濃度GO處理條件下才有所降低，表明高濃度的GO才會影響玉米幼苗葉綠素的合成。

2.4 GO對玉米幼苗根部SOD、POD和CAT活性的影響

SOD、POD和CAT是生物體內活性氧清除系統(tǒng)中重要的保護性酶。如圖5A和圖5B所示，不同GO濃度處理玉米幼苗9 d后，根部SOD和POD的活性較對照組均未發(fā)生顯著變化。而CAT的活性隨著GO濃度的增加出現(xiàn)了顯著的升高趨勢，尤其在100 mg·L-1和200 mg·L-1高濃度GO條件下，CAT活性分別升高145.8%和187.5%（圖5C）。

2.5 GO對玉米幼苗根部MDA含量的影響

MDA是膜質過氧化作用的重要產物之一，通過測定MDA含量可評估脂質過氧化程度。MDA含量檢測結果顯示（圖5D），隨著GO處理濃度的升高，MDA含量也逐漸增加，在GO濃度為25、50、100 mg·L-1和200 mg·L-1時，相較于對照組MDA含量分別增加57.5%、158.9%、189.0%和335.6%。

3 討論

石墨烯材料與植物的相互作用已經開始被廣泛研究。但不同石墨烯材料的物理化學性質存在巨大差異，因此對植物生長的效應也有所不同[21]。已有研究表明石墨烯能夠抑制黃瓜和玉米幼苗的生長，且隨著石墨烯濃度及暴露時間的增加，毒性也明顯增強[22]。低濃度磺化石墨烯（SG）能清除玉米幼苗根部活性氧（ROS），提高幼苗的健康狀態(tài)，而高濃度的SG則會促使根部ROS產生，導致細胞死亡[23]。胺功能化氧化石墨烯（G-NH2）的暴露引起了小麥幼苗根長與莖長的增加，促進了小麥的生長[18]。現(xiàn)階段石墨烯材料對植物生長發(fā)育影響的研究主要集中在小麥、水稻、玉米、黃瓜、番茄等可食作物上。關于GO對植物的影響大多表現(xiàn)為抑制作用，包括抑制種子的發(fā)芽、根的生長等。然而，由于植物種類和暴露濃度的不同，GO對某些植物的生長也表現(xiàn)出促進作用[24]。因此，GO對植物生長效應的評價研究需要精確細分濃度梯度。本研究測試濃度范圍內，GO能夠抑制玉米幼苗根系的生長，降低根冠比，并隨著濃度的升高，根部形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)明顯的結構性損傷，生長抑制趨勢更加顯著。本研究所選試驗濃度基于現(xiàn)有相關研究，接近實際的環(huán)境濃度，具有一定的現(xiàn)實意義。

葉綠素作為植物主要的光合色素，其含量反映了植物光合性能的強弱，而且在一定程度上能表征植物受逆境脅迫的狀況[25-26]。葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，即隨著GO濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。本研究的試驗結果說明25 mg·L-1GO處理在一定程度上能刺激光和色素的生成，GO濃度超過50 mg·L-1時，玉米幼苗的光合性能才會受到影響，高濃度的GO可能使葉綠體結構遭到破壞，從而限制了葉綠素的合成。這一結果與Hu等[27]發(fā)現(xiàn)200 mg·L-1石墨烯對植物葉綠素a和葉綠素b的合成有不利影響相一致。

目前，有關納米材料的毒性機制，較為認可的是納米材料能誘導植物產生過量的ROS，引起氧化脅迫和脂質過氧化，從而導致細胞膜破壞、DNA損傷，甚至細胞死亡[28-30]。面對氧化脅迫，植物會通過刺激抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性來抵抗氧化應激，但在強氧化條件下，抗氧化系統(tǒng)一旦被破壞，抗氧化酶的活性也會降低[31]。石墨烯材料的植物毒性很可能也與氧化應激有關，Zhang等[32]的研究結果顯示，在250～1 500 mg·L-1石墨烯濃度范圍內，小麥葉片中SOD和POD活性有顯著升高。GO誘導了高羊茅SOD、POD和CAT活性升高，同時產生膜質過氧化損傷，MDA含量增加[33]。

SOD、POD和CAT是植物在逆境條件下酶促防御反應系統(tǒng)的關鍵酶，能減輕活性氧對植物的傷害[34]。在測試的25～200 mg·L-1GO濃度范圍內，玉米幼苗根部SOD和POD的活性較對照組并未出現(xiàn)顯著變化，可能與石墨烯材料種類、暴露濃度及植物物種有關。CAT作為調節(jié)植物體內氧化還原動態(tài)平衡的重要酶，與抗逆性及氧化衰老等生理過程相關，在植物抗毒害方面起著重要作用[35]。本研究測試濃度范圍內，CAT活性隨著GO濃度的增加出現(xiàn)顯著的升高趨勢，CAT參與了抵抗GO脅迫。MDA作為膜質過氧化的標志物，其含量是一種重要的逆境生理指標[36-37]。玉米幼苗根部MDA含量與CAT活性有著類似的變化趨勢，即隨著GO濃度的增加而顯著升高，表明玉米幼苗根系ROS大量產生，細胞膜的完整性遭受損傷，這與Ren等[23]高濃度磺化石墨烯處理玉米幼苗的結果相符。GO處理玉米幼苗產生的抑制效應可能是GO通過胞外覆蓋、胞內氧化脅迫或者直接破壞細胞膜等方式對植物細胞產生危害[1，24]，但不同濃度GO對玉米幼苗產生不同效應的內在機制還不清楚，我們將在下一步的研究中針對相關信號通路及基因表達進行深入的研究與探討，從而為石墨烯的毒性評價和生態(tài)環(huán)境效應提供基礎資料和科學依據。

4 結論

（1）GO脅迫不同程度地抑制了玉米幼苗的生長，在25～200 mg·L-1濃度范圍內，GO能夠抑制玉米幼苗根系的生長、降低根冠比，并隨著濃度的升高，抑制趨勢更加顯著。

（2）玉米幼苗葉綠素含量水平只有在濃度超過50 mg·L-1GO處理條件下才有所降低，表明較高濃度GO對葉綠素的合成有不利影響。

（3）不同GO濃度處理下，玉米幼苗根部SOD和POD的活性較對照組均未發(fā)生顯著變化，而CAT的活性和MDA含量隨著GO濃度增加而升高。