彭晴晴，楊靜雅，鐘民正，邢洋洋，李紫燕，毛暉，周莉娜*

（1.農業(yè)農村部西北植物營養(yǎng)與農業(yè)環(huán)境重點實驗室，陜西 楊凌712100；2.西北農林科技大學資源環(huán)境學院，陜西 楊凌712100）

納米氧化鋅（ZnONPs）作為一種金屬氧化物納米顆粒，因顆粒尺寸的細微化而產生其本體塊狀材料所不具備的表面效應、小尺寸效應、量子效應和久保效應等特殊的物理性質[1]，從而越來越多的應用于工業(yè)、農業(yè)等多領域的研究[2-3]。納米材料的廣泛應用會增加其進入環(huán)境中的風險，已有研究證實，大多數納米材料會流入污水處理廠的污泥中，這些污泥作為土壤肥料施用時無疑會給農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)帶來一定的風險[4-5]。

種子萌發(fā)是植物生命周期的關鍵階段，也是對外界環(huán)境因子最敏感的時期之一。有研究表明，納米顆粒對種子發(fā)芽的影響與其作用濃度密切相關[6]。Mahajan等[7]研究表明，在培養(yǎng)基中添加20 mg·L-1的ZnONPs會利于綠豆種子的萌發(fā)，1 mg·L-1的ZnONPs會利于鷹嘴豆種子的萌發(fā)，高于該濃度會抑制其萌發(fā)和生長。Sedghi等[8]研究也表明較低濃度ZnONPs對大豆種子發(fā)芽具有促進作用，而較高劑量ZnONPs會抑制大豆種子發(fā)芽。Prasad等[9]在花生以及Rashar等[10]在洋蔥中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。萌發(fā)后期，植物對水分和養(yǎng)分的吸收取決于根系的生長狀況及根系形態(tài)。ZnONPs對植物根系形態(tài)的研究也報道不一。Xiang等[11]研究結果表明80 mg·L-1的ZnONPs對白菜發(fā)芽率沒有影響，但顯著抑制了白菜根和芽的生長。鋅是唯一參與六大酶促反應的金屬元素，在許多影響植物生長代謝的過程中發(fā)揮重要作用[12]。ZnONPs顯著降低了芥菜的生物量，并且對植物的根、莖和葉產生了一定的氧化損傷[13]。

已有大量研究闡明Zn2+對植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[14-15]。關于ZnONPs對水稻[16]、小麥[17]、玉米[18]等糧食作物種子萌發(fā)的影響研究也已展開，而其對豆科植物的影響研究大多集中在大豆[8]、綠豆[7]、豇豆[19]等植物，較少研究ZnONPs對豆科牧草類植物萌發(fā)及幼苗生長的影響。因此，本研究通過種子發(fā)芽試驗，探究ZnONPs對不同豆科植物種子萌發(fā)和幼苗生理生化指標的差異影響，及鋅在不同豆科植物中的累積，以期評價不同豆科植物對ZnONPs的敏感性，為揭示納米顆粒對同一科屬不同品種植物的生長影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試種子：豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草種子，于山東壽禾種業(yè)購買。ZnO NPs粒徑（20±5）nm，純度＞99.6%。分別稱取1、5、10、20、40、80 mg ZnONPs粉末分散于盛有100 mL超純水的燒杯中，在超聲振動儀中（100 W，40 kHz）振蕩30 min，制得濃度為10 mg·L-1（N10）、50 mg·L-1（N50）、100 mg·L-1（N100）、200 mg·L-1（N200）、400 mg·L-1（N400）、800 mg·L-1（N800）的懸浮液，無添加ZnONPs的超純水作為對照（CK）。

1.2 試驗方法

培養(yǎng)皿滅菌：將直徑為10 cm的玻璃培養(yǎng)皿在121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min。種子表面消毒：分別隨機選取一定數量的飽滿、大小均勻的豌豆、綠豆、苜蓿、白三葉草種子，用10%的過氧化氫浸泡10 min消毒，再用超純水沖洗3遍。種子萌發(fā)試驗：將消毒的種子平鋪于放有定性濾紙的培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿內的種子數量分別為豌豆10粒、綠豆15粒、苜蓿100粒、三葉草100粒，每個培養(yǎng)皿取液量均為5 mL，每個濃度處理設置6個重復，置于恒溫培養(yǎng)箱（25±1）℃避光培養(yǎng)7 d，每日補充適量超純水。

1.3 測定方法

將ZnONPs粉末在水體中充分穩(wěn)定分散，采用透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 100CX，日本）觀測ZnO NPs顆粒微觀結構。使用馬爾文激光粒度儀（Mastersizer 2000，英國）測定ZnO NPs顆粒水動力學尺寸。本試驗種皮中出現(xiàn)胚根或子葉即視為發(fā)芽，收取培養(yǎng)7 d的幼苗，用蒸餾水洗凈，將根和莖分開，使用軟尺測量幼苗的莖長，使用Espon scanner數字化掃描儀對根系進行掃描，掃描后運用細根分析軟件（Win-RhIZO，2008a，Regent Instruments Inc）計算總根長、總表面積、比表面積等根系形態(tài)指標；采集幼苗的葉片，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定其丙二醛（MDA）含量。幼苗根系首先用0.1 mol·L-1HNO3洗凈，再用蒸餾水洗3遍，經105℃殺青30 min后，在65℃烘箱中烘至恒質量，稱量每個培養(yǎng)皿中幼苗的干物質量，植物樣品采用HNO3微波消解（Multiprep-41，F(xiàn)C2，意大利），石墨爐火焰原子吸收分光光度法測定消解液中的鋅含量。

1.4 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較，P＜0.05表示處理間差異顯著，使用Origin 9.0進行圖形繪制。

植物發(fā)芽率及根系比表面積（SRA）參數計算公式如下：

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數/供試種子數×100%

根比表面積（cm2·g-1）=根表面積（cm2）/根生物量（g）

2 結果與分析

2.1 ZnONPs的表征

利用透射電子顯微鏡觀察去離子水中ZnONPs，如圖1所示，ZnONPs顆粒呈球形，粒徑約為20 nm。ZnONPs溶解度為7.38 mg·L-1，水溶液中會產生團聚效應，形成較大尺寸的團聚體。

2.2 不同濃度ZnONPs處理對4種豆科植物種子發(fā)芽率和生物量的影響

由表1可知，不同濃度的ZnONPs處理下4種豆科種子的發(fā)芽率與CK處理相比均無顯著差異，除了N800處理的紫花苜蓿和白三葉草種子發(fā)芽率分別為84.50%和83.00%，其余濃度ZnONPs處理下的4種豆科種子的發(fā)芽率均達到了發(fā)芽率標準GB 16715.2—2010規(guī)定的種子質量標準（≥85%）。表明ZnONPs對豌豆、綠豆種子的萌發(fā)無顯著影響，在高濃度（400 mg·L-1和800 mg·L-1）ZnONPs處理下會降低紫花苜蓿和白三葉草種子的發(fā)芽率。

由圖2中4種豆科幼苗的干質量及干質量相對百分率可知，隨著ZnONPs濃度的增加，豌豆和綠豆幼苗的干質量呈先增加后減少的趨勢，分別在N100和N50處理時達到最大，較CK處理均顯著增加了23%。紫花苜蓿和白三葉草幼苗的干質量隨著ZnONPs濃度的升高呈降低趨勢，均在N10處理下達到最大，較CK處理分別增加了17%和18%。與CK處理相比，N400和N800處理均顯著降低了4種豆科植物幼苗的干質量，N800處理下豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草的干質量比CK分別降低了13%、31%、25%、35%?？傮w來看，10～200 mg·L-1濃度范圍的ZnONPs利于豌豆幼苗干質量的累積，超過該濃度會顯著降低豌豆幼苗干質量。除豌豆外的3種豆科植物，低濃度（10 mg·L-1和50 mg·L-1）ZnONPs有利于幼苗干質量累積，因豆科植物品種的差異，產生的促進效果不同。而高濃度（≥100 mg·L-1）ZnONPs會降低幼苗的干質量，呈現(xiàn)出一定的植物毒性。

表1不同濃度ZnONPs處理對豆科幼苗發(fā)芽率的影響Table 1 Effectsof different concentrationsof ZnONPson germination rate of leguminous seedlings

2.3 不同濃度ZnONPs處理對4種豆科植物幼苗總根長、莖長和比表面積的影響

種子萌發(fā)后，ZnONPs懸浮液與幼苗的根直接接觸，進而對其產生影響。與CK處理相比，N10、N50、N100處理促進了豌豆幼苗側根和根毛的生長（圖3）。根據表2可得，N10、N50、N100處理均顯著增加了豌豆和綠豆幼苗根長，高于100 mg·L-1濃度的ZnONPs處理時，豌豆和綠豆幼苗的根長較CK降低。對于紫花苜蓿和白三葉草，只有N10和N50處理促進了幼苗根生長，大于50 mg·L-1濃度的ZnONPs處理對紫花苜蓿和白三葉草的根伸長有顯著的抑制作用。在最大濃度800 mg·L-1處理下，豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草根長比CK處理分別減少了68%、75%、83%、85%，4種豆科幼苗的根伸長受到抑制，根的比表面積減小，但根生長變粗、直徑增加。整體上，4種豆科幼苗根長度隨ZnONPs濃度的升高先增加后降低，但有助于根生長的濃度范圍不同，表明植物不同，促進幼苗根生長的ZnONPs最適濃度也不同。

由表2可知，與CK處理相比，10～800 mg·L-1濃度的ZnONPs處理對豌豆幼苗莖長無顯著影響。綠豆幼苗的莖長隨著ZnO NPs濃度的升高先增加后降低，低濃度（10、50、100 mg·L-1）ZnONPs處理促進了綠豆幼苗的莖伸長，高濃度（200、400、800 mg·L-1）ZnO NPs處理則抑制了綠豆幼苗莖生長。只有N100處理對紫花苜蓿的莖生長有輕微的促進作用，其余處理均降低了紫花苜蓿幼苗的莖長。N10處理顯著增加了白三葉草的莖長，相比CK莖長增加了28%，其余處理（N100除外）顯著抑制了白三葉草幼苗莖的生長。

由表2可知，與CK處理相比，低濃度ZnO NPs（≤100 mg·L-1）對4種豆科植物幼苗的根比表面積有促進作用，其中N10處理顯著增加了豌豆、紫花苜蓿的根比表面積，N50處理顯著增加了綠豆、紫花苜蓿的根比表面積，同時，N100處理也顯著增加了綠豆的根比表面積。而高濃度（200、400、800 mg·L-1）ZnO NPs處理對4種豆科植物幼苗的根比表面積有不同程度的抑制。最大濃度800 mg·L-1處理對豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草根的比表面積抑制率分別達到65%、13%、63%、62%。

表2不同濃度ZnONPs處理對豆科幼苗根長、莖長和比表面積的影響Table 2 Effects of different concentrationsof ZnONPson root length，stemlength and specific surface area of leguminous seedlings

2.4 不同濃度ZnONPs處理對4種豆科植物幼苗MDA含量的影響

由表3可以看出，與CK處理相比，不同濃度ZnONPs處理均增加了豌豆幼苗的MDA含量，隨著ZnO NPs濃度的升高，豌豆幼苗MDA含量呈先增加后減少的趨勢，N50處理豌豆幼苗MDA含量最大。同時，N50處理也增加了綠豆幼苗的MDA含量，但未達到顯著差異。各濃度ZnONPs處理對紫花苜蓿幼苗MDA含量影響未達到顯著差異，高濃度（≥100 mg·L-1）ZnO NPs處理顯著增加了白三葉草幼苗的MDA含量。整體上，高濃度（100～800 mg·L-1）ZnONPs處理對豌豆和白三葉草幼苗的脅迫作用顯著，對綠豆和紫花苜蓿無顯著脅迫作用。

表3不同濃度ZnONPs處理對4種豆科幼苗MDA含量的影響Table 3 MDA content of four legume seedlings treated with different concentrations of ZnONPs

2.5 不同濃度的ZnONPs處理對4種豆科植物鋅含量的影響

由表4可見，與CK處理相比，除了N10處理豌豆幼苗的鋅含量與CK相比無顯著差異外，4種豆科幼苗的鋅含量均隨著ZnONPs濃度的升高呈上升趨勢。豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草的鋅含量分別從CK的9.17、12.04、8.98、17.84 mg·kg-1升高到N800的83.96、82.96、212.48、263.21 mg·kg-1。N10處理的鋅含量豌豆幼苗約是CK處理的1.6倍，綠豆約2.0倍，紫花苜蓿約4.6倍，白三葉草約3.8倍。在N50處理時，豌豆、綠豆、紫花苜蓿和白三葉草幼苗的鋅含量分別約是其對應N10處理的1.7、1.7、2.6倍和2.0倍。隨著ZnO NPs濃度的增加，4種豆科植物幼苗的鋅含量增加緩慢，表明低濃度（10～50 mg·L-1）ZnONPs處理有助于豆科植物幼苗鋅含量的累積。整體看，4種豆科幼苗在各濃度ZnONPs處理下，白三葉草幼苗的鋅含量始終最高。

表4不同濃度ZnONPs處理對豆科幼苗鋅含量的影響Table 4 Effects of different concentrations of ZnONPs on Zn content in leguminous seedlings

3 討論

3.1 ZnONPs對種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

本試驗中不同濃度的ZnONPs處理對4種豆科種子發(fā)芽率無顯著影響，對4種豆科幼苗生物量影響整體呈現(xiàn)“低促高抑”的效果。Lin等[20]通過發(fā)芽試驗將蘿卜、油菜、黑麥草、生菜、玉米、黃瓜等植物種子分別暴露于濃度為2 000 mg·L-1的5種納米材料（MWCNT、Al NPs、Al2O3NPs、Zn NPs、ZnO NPs）中，發(fā) 現(xiàn) 除Zn NPs和ZnONPs顯著降低了黑麥草和玉米種子的發(fā)芽率外，其余納米材料處理對6種植物的發(fā)芽率均無顯著影響。Khodakovskaya等[21]通過在含有碳納米管（10～40μg·L-1）的培養(yǎng)基中測試番茄種子的發(fā)芽和生長速率，發(fā)現(xiàn)碳納米管能夠穿透番茄種皮促進種子內部水分吸收，使番茄種子發(fā)芽率和生物量都顯著增加。而本試驗中各濃度ZnONPs處理對豆科植物發(fā)芽均沒有顯著影響，可能原因是種皮表現(xiàn)出的選擇滲透性，通過限制納米顆粒的進入來保護胚胎不受ZnONPs毒性，直至種子生長出胚根與培養(yǎng)基中的納米顆粒直接接觸[22]。隨著ZnONPs濃度的升高，豌豆和綠豆幼苗的干質量先增加后減少，紫花苜蓿和白三葉草的干質量呈降低趨勢。相關研究報道的納米顆粒對植物生物量的影響也不盡相同。Salehi等[23]在菜豆生長的瓊脂培養(yǎng)基中添加25、50、100 mg·L-1的CeO2NPs，結果最高濃度CeO2NPs分別提高了菜豆莖和根37%和19%的生物量。但Wang等[24]發(fā)現(xiàn)200 mg·L-1和300 mg·L-1ZnONPs會抑制葉綠素的生物合成，降低光合效率，使擬南芥的生物量分別減少20%和80%。綜上，納米顆粒對植物生物量的影響一方面因阻礙植物根際生長和營養(yǎng)吸收，另一方面因阻礙植物葉片光合作用影響能量合成。一般植物體內鋅濃度達到100μg·g-1時就表現(xiàn)過量，濃度為400μg·g-1時就造成嚴重毒害[25]。本試驗中ZnONPs通過對豆科幼苗根和莖的生長產生促進或抑制作用進而對豆科幼苗的生物量產生直接影響。

本試驗中，適宜濃度ZnONPs處理能有效促進豆科幼苗根和莖的生長，但高濃度（400、800 mg·L-1）ZnONPs處理均抑制了4種豆科幼苗根和莖的生長，同時降低了根的比表面積，在最大濃度處理下，4種豆科植物的根幾乎都停止了伸長，表明高濃度ZnONPs對4種豆科植物幼苗生長表現(xiàn)出植物毒性。研究表明低濃度ZnO NPs產生的Zn2+有助于水生植物花葉蘆竹莖葉的生長，而高濃度ZnONPs對其種子萌發(fā)后的莖葉生長產生明顯抑制[26]，這與本試驗研究結果一致。種子萌發(fā)后幼根莖葉沒有種皮的保護，高濃度ZnO NPs直接接觸幼根莖葉，使其生長受到抑制[27]。有研究報道了ZnONPs的毒性效應，Wan等[28]通過生理學和轉錄組學方法比較ZnO NPs和Zn2+對擬南芥的差異毒性，結果表明ZnONPs和Zn2+都抑制了擬南芥初生根的生長，ZnONPs對根伸長區(qū)域的生長有更強的抑制作用，而Zn2+對分生組織細胞有更強的毒性作用，但ZnONPs處理的植物比Zn2+處理的植物能更快的從脅迫中恢復。ZnONPs懸浮液中除了納米顆粒自身，其溶解的Zn2+也會對植物生長產生影響，Zn2+含量隨著ZnO NPs濃度的升高先上升后下降，200 mg·L-1的ZnONPs懸浮液中Zn2+含量最高，高于此濃度的ZnONPs懸浮液中Zn2+含量趨于穩(wěn)定[18]。也有研究報道納米顆粒通過進入植物細胞而抑制根生長，Kurepa等[29]研究表明超小型銳鈦礦型TiO2NPs能夠進入擬南芥植物細胞，積聚在液泡和根細胞核這些亞細胞位置，并導致細胞微管重組和消除，從而抑制根伸長。Loepez-Moreno等[30]通過發(fā)芽試驗研究ZnONPs在大豆幼苗中的生物轉化，結果表明ZnONPs處理的大豆根長先增加后減小，使用同步加速器X吸收光譜在大豆根部未發(fā)現(xiàn)ZnONPs，說明ZnONPs對大豆根伸長的影響可能是由于納米顆粒本身和ZnONPs溶解出的Zn2+。本試驗高濃度（400～800 mg·L-1）ZnONPs處理對4種豆科幼苗根長的抑制作用與上述文獻結果類似，ZnONPs濃度越高，根長越小，表明除了ZnONPs溶解的Zn2+，ZnONPs自身的毒性也抑制了根的生長。

本試驗中ZnONPs對4種豆科幼苗根長的抑制作用要大于對莖長的抑制作用，這與林茂宏等[31]發(fā)現(xiàn)的不同濃度ZnONPs與ZnSO4處理對櫻桃蘿卜和小白菜根伸長脅迫作用均高于對芽伸長脅迫作用的研究結果類似。與植物的全生命周期毒理試驗不同，種子發(fā)芽試驗在短時間內即呈現(xiàn)ZnONPs的植物毒性，原因可能是胚根先伸出種皮與納米顆粒接觸。而在植物全生命周期中，有從根部向地上部營養(yǎng)運輸的過程，在短時間內，幼苗根部吸收的納米粒子或納米粒子溶出的金屬離子不能得到緩釋，從而不能向莖、葉輸送，因此基本表現(xiàn)為根部受到的植物毒性明顯。根比表面積反映植物根系吸收水分和養(yǎng)分的能力，可作為描述根系形態(tài)功能的重要指標之一，其值越大，可得到的養(yǎng)分利用效率越高[32]。本試驗中隨著ZnONPs濃度的升高，4種豆科植物幼苗的根比表面積先增大后減小，與幼苗的干質量變化趨勢保持一致，根比表面積與植物利用養(yǎng)分的效率有關，這可能是導致豆科植物幼苗干質量降低的原因。

3.2 ZnONPs對植物MDA及植株鋅含量的影響

植物在逆境脅迫下，細胞內活性氧產生和清除之間的平衡遭到破壞，導致氧自由基的大量積累，從而引發(fā)膜脂過氧化，其最終產物MDA含量的高低通常用來表示膜脂過氧化水平[33]。豆科植物受到ZnONPs脅迫時會產生少量自由基，從而激發(fā)植物的多種生理功能，促進植物生長，但當ZnONPs處理脅迫過強時，大量的自由基超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力，此時將會抑制植物生長。研究報道Fe3O4NPs會引起黑麥草和南瓜植物的氧化應激，增加其體內的MDA含量[34]。本試驗中高濃度（100～800 mg·L-1）ZnO NPs處理下，豌豆和白三葉草的MDA含量較CK顯著提升，表明對其有一定的脅迫作用，對綠豆和紫花苜蓿的脅迫作用不顯著，這可能是由于不同植物對鋅的響應程度不同，由于鋅是植物生長必需的營養(yǎng)元素，其氧化物的納米顆粒對植物影響更為復雜。

不同濃度ZnONPs處理不僅影響豆科植物幼苗的干質量、根長，而且影響幼苗體內的鋅含量。與對豆科植物幼苗干質量和根長的影響趨勢不同，本試驗中4種豆科植物的鋅含量隨ZnONPs濃度的升高而逐漸增加，同一處理，紫花苜蓿和白三葉草的鋅含量大于豌豆和綠豆。植物的存在有利于ZnONPs懸浮液中可溶性鋅含量增加[35]。植物對金屬元素的吸收取決于金屬元素的可利用性、吸收量以及植物的儲存能力[36]，因此不同植物對鋅的吸收利用效率存在差別。Loepz-Moreno等[30]通過發(fā)芽試驗研究ZnO NPs和CeO2NPs在大豆幼苗中的生物轉化，結果表明在500 mg·L-1的ZnO NPs處理下大豆幼苗鋅累積量最大，達到229 mg·kg-1，而1 000、2 000、4 000 mg·L-1的ZnONPs處理鋅累積量為135～150 mg·kg-1不等，分析原因可能是基質中納米顆粒的聚集影響了植物對鋅的吸收。Franklin等[37]研究表明ZnONPs在100 mg·L-1時發(fā)生團聚，形成大小（納米級至微米級）不同的絮狀物，數據表明ZnONPs在500 mg·L-1發(fā)生團聚低于4 000 mg·L-1，因此有更多的NPs和Zn2+可供植物吸收。本試驗的研究結果與上述文獻結果相似，本試驗中N50處理較N10處理鋅含量約增加2倍，在N400、N800處理時，4種豆科幼苗的鋅含量較前一濃度處理增長緩慢，分析原因可能與較高濃度ZnONPs的團聚以及釋放的Zn2+含量密切相關。

綜上，較高濃度的ZnONPs對植物造成不同程度的毒害效應，不同植物對納米顆粒的吸收能力不同，導致不同植物對ZnONPs響應存在一定差異。根據4種豆科植物的根伸長閾值，不同濃度的ZnONPs處理對白三葉草的根長抑制率最大，再由高濃度ZnONPs對白三葉草的脅迫作用較顯著，白三葉草幼苗的鋅含量最大，可得4種豆科植物對鋅的敏感性高低依次為白三葉草、紫花苜蓿、綠豆、豌豆。

4 結論

（1）不同濃度ZnONPs處理不影響豆科植物的發(fā)芽率，適宜濃度的ZnONPs處理有助于豆科幼苗干質量的累積。

（2）不同豆科植物對ZnO NPs的耐受性存在差異，豌豆、綠豆、紫花苜蓿、白三葉草幼苗根伸長閾值分別為200、100、50、50 mg·L-1ZnO NPs。高濃度（100～800 mg·L-1）ZnONPs處理對豌豆和白三葉草的脅迫作用強于綠豆和紫花苜蓿。

（3）在最大800 mg·L-1ZnONPs處理濃度范圍內，4種豆科植物的鋅含量隨ZnO NPs濃度的升高而增加，不同豆科植物品種ZnONPs敏感程度由大到小依次為白三葉草、紫花苜蓿、綠豆、豌豆?？傮w上，ZnO NPs對豆科幼苗生長產生促進或抑制的效果與處理濃度密切相關，ZnONPs在農業(yè)生產中的應用應根據其劑量-影響效果合理施用。