曹金騰， 吳 濤， 董玉蓉， 仇 聰， 姜 艷， 趙林果*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

杜仲是杜仲科杜仲屬植物，有較高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]，含有效活性成分達(dá)200余種，主要包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、多酚類、苯丙素類、多糖類等[2]。桃葉珊瑚苷是杜仲籽中主要的環(huán)烯醚萜苷類成分，具有舒張血管[3]、護(hù)肝解毒[4]、抗氧化[5]、抗骨質(zhì)疏松[6]、延緩光老化[7]等多種藥理活性，但其口服生物利用度低(19.3%)[8]，難以被腸道吸收，需水解為桃葉珊瑚苷元來發(fā)揮療效。另一方面，桃葉珊瑚苷元的生理活性比桃葉珊瑚苷高很多[9]。因此，體外將桃葉珊瑚苷制備為桃葉珊瑚苷元，將大大提高桃葉珊瑚苷的生物利用度、藥理活性及其附加價值。目前，桃葉珊瑚苷元的制備方法有酸水解法和酶水解法，其中酶水解法具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)等優(yōu)勢。但是酶水解法存在兩方面問題，一是酶催化效率不高、酶學(xué)性質(zhì)不適合催化體系的環(huán)境[9]；二是桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性差，特別是桃葉珊瑚苷元含有閉環(huán)環(huán)戊二烯吡喃型半縮醛結(jié)構(gòu)，極易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，因此，難以大量制備純度較高的桃葉珊瑚苷元[10]。國內(nèi)外的相關(guān)研究表明，酶的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在水相中進(jìn)行，也可以在非水相催化體系中進(jìn)行[11]，采用有機(jī)溶劑-水雙相體系反應(yīng)可以減少副反應(yīng)的進(jìn)行，提高苷元產(chǎn)率。Yu等[12]在雙相體系中制備薯蕷皂苷元，苷元產(chǎn)率大幅提高；沈玉萍[13]采用雙相酸水解法制備槲皮素，產(chǎn)率比傳統(tǒng)方法提高了39%。所以，采用有機(jī)溶劑-水雙相體系有望能提高酶的催化效率、改善桃葉珊瑚苷元在酶解及分離過程中的穩(wěn)定性。在桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性方面，盡管國內(nèi)外對桃葉珊瑚苷穩(wěn)定性影響因素及如何提高其穩(wěn)定性做了一些研究[14-15]，但效果都不太理想，而且對苷元穩(wěn)定性分析還不夠深入。本課題組自主研發(fā)了一種β-葡萄糖苷酶[16]，能有效水解桃葉珊瑚苷獲得苷元。在此基礎(chǔ)上，本研究優(yōu)化了單水相和正丁醇-水雙相的酶解條件，分析了溫度、pH值、抗氧化劑VC濃度和有機(jī)溶劑種類等因素對桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性的影響，以期為后續(xù)桃葉珊瑚苷元高效制備、保藏和利用提供技術(shù)支撐。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

桃葉珊瑚苷，江蘇永健醫(yī)藥科技公司；桃葉珊瑚苷元，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(pNPG)，Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨，阿拉丁公司；D-生物素(D-Biotin)，生工生物工程股份有限公司；抗生素Zeocin、無氨基酵母氮源，南京天為公司。甲醇，色譜級；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。β-葡萄糖苷酶由重組畢赤酵母菌pPICZαA-bgl1高效表達(dá)獲得；基因來源于黑曲霉Aspergillussp.NL-1；重組酶為南京林業(yè)大學(xué)微生物技術(shù)研究室研發(fā)，酶制劑制備及酶活力測定參照文獻(xiàn)[16]。酶活力單位(U)定義：在酶的最適溫度和pH下反應(yīng)，每分鐘水解相應(yīng)底物pNPG釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

ZHWY-10X水浴搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀spectraMax190，美國分子儀器公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 單水相酶解桃葉珊瑚苷條件的優(yōu)化

精確吸取桃葉珊瑚苷溶液20 μL(50 mmol/L)、一定量的β-葡萄糖苷酶酶液和檸檬酸緩沖溶液(pH值4.5，500 mmol/L)總體積共200 μL，置于離心管中，在設(shè)定溫度下水浴酶解一定時間，分別考察酶用量、酶解時間和反應(yīng)溫度對單水相酶解桃葉珊瑚苷的影響。反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液置于冰上，向其中加入400 μL的甲醇溶液渦旋混勻終止酶解反應(yīng)，混合溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液進(jìn)行HPLC分析并計算桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率。

1.3 雙相體系酶解桃葉珊瑚苷條件的優(yōu)化

分別吸取1 mL桃葉珊瑚苷溶液(50 mmol/L)與酶液(25 U/mL)的混合溶液置于5 mL離心管中，取樣，經(jīng)HPLC測定初始濃度；加入1 mL不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑置于搖床設(shè)定溫度下250 r/min振蕩酶解一定時間后，分別考察有機(jī)溶劑種類及其體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對雙相酶解桃葉珊瑚苷的影響。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于冰上，分離有機(jī)相和水相，用HPLC測定有機(jī)相和水相中桃葉珊瑚苷及苷元濃度，并計算分配系數(shù)lgP。

1.4 桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性分析

1.4.1溫度的影響 酶解反應(yīng)完立刻將酶解液置于-20～90 ℃放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.2溶液pH值的影響 酶解反應(yīng)完立刻將酶解液用檸檬酸和磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)溶液pH值為3.0～8.0，室溫放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.3抗氧化劑濃度的影響 酶解反應(yīng)完立刻向酶解液分別加入2、 5、 10和20 g/L的VC水溶液，室溫放置，于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.4有機(jī)溶劑的影響 取配制好的50 mmol/L桃葉珊瑚苷溶液，與檸檬酸緩沖溶液(pH值4.5)混勻，加入相同體積的正丁醇、正己醇和乙酸乙酯有機(jī)溶劑，構(gòu)成雙相體系，分別加入相同量的糖苷酶(25 U/mL)，于35 ℃振蕩20 min，離心分離有機(jī)相，室溫放置，分別于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，進(jìn)行HPLC分析并計算桃葉珊瑚苷元保留率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1HPLC分析 采用高效液相色譜法測定桃葉珊瑚苷及其苷元的量。以桃葉珊瑚苷和苷元為標(biāo)準(zhǔn)品，以水為溶劑配制質(zhì)量濃度為50、 25、 12.5、 6.25和3.125 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。桃葉珊瑚苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1 772.7x+170.14，R2=0.999 6。桃葉珊瑚苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2 307.7x-62.036，R2=0.999 8。

HPLC條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；二極管陣列檢測器(DAD)，紫外檢測波長206 nm；流動相為甲醇/水(體積比10 ∶90)。

1.5.2產(chǎn)率計算 分配系數(shù)(lgP)按照式(1)計算，單水相桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)化率(ηau1)按式(2)計算，桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率(Yaug1)按式(3)計算，雙相桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)化率(ηau2)按式(4)計算，桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率(Yaug2)按式(5)計算。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：Co—桃葉珊瑚苷或苷元在有機(jī)相中的濃度，mmol/L；Cw—桃葉珊瑚苷或苷元在水相中的濃度，mmol/L；Vw—水相的體積，L；Vo—有機(jī)相的體積，L；Cauw—水相中桃葉珊瑚苷的初始濃度，mmol/L；Cauw1—反應(yīng)后水相中桃葉珊瑚苷的濃度，mmol/L；Cauo—有機(jī)相中桃葉珊瑚苷的初始濃度，mmol/L；Cauo1—反應(yīng)后有機(jī)相中桃葉珊瑚苷的濃度，mmol/L；Caugw—水相中桃葉珊瑚苷元的濃度，mmol/L；Caugo—有機(jī)相中桃葉珊瑚苷元的濃度，mmol/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 單相酶解條件的優(yōu)化

2.1.1酶用量 綜合考慮酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值，設(shè)定反應(yīng)溫度為37 ℃，緩沖液pH值為4.5，酶解時間30 min，考察酶用量對桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖1(a)所示。隨著酶用量的增加，苷元的產(chǎn)率也在增加，當(dāng)酶用量大于10 U/mL時，苷元產(chǎn)率的增加趨于平穩(wěn)；當(dāng)酶用量為25 U/mL時，苷元產(chǎn)率達(dá)到最大值。因此，為了獲得更高產(chǎn)率的桃葉珊瑚苷元，確定適宜酶用量為25 U/mL。

2.1.2酶解時間 設(shè)定反應(yīng)溫度為37 ℃，緩沖液pH值為4.5，酶用量25 U/mL，考察酶解時間對桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖1(b)所示。酶解時間在10 min以內(nèi)時，桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率隨著時間的延長而快速增加；10～20 min時，苷元的產(chǎn)率增長緩慢，且在20 min時達(dá)到最大值，當(dāng)酶解時間超過20 min時，苷元產(chǎn)率下降，表示桃葉珊瑚苷元確實存在進(jìn)一步分解。因此桃葉珊瑚苷適宜酶解時間是20 min。

2.1.3反應(yīng)溫度 設(shè)定緩沖液pH值為4.5，酶用量25 U/mL，酶解時間為20 min，考察反應(yīng)溫度對桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖1(c)所示。當(dāng)反應(yīng)溫度小于35 ℃時，隨著溫度升高產(chǎn)物產(chǎn)率也在上升；反應(yīng)溫度大于35 ℃時苷元產(chǎn)率隨著溫度增高而降低，因采用的β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，表明溫度大于35 ℃時苷元降解速度大于產(chǎn)物積累速度，因此適宜反應(yīng)溫度選擇35 ℃。在此條件下，單水相酶解制備桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率達(dá)到最高，為46.3%。

a.酶用量enzyme dosage； b.酶解時間enzymolysis time； c.反應(yīng)溫度reaction temperature

2.2 雙相酶解條件的優(yōu)化

2.2.1有機(jī)溶劑的篩選 在水-有機(jī)溶劑兩相體系中，有機(jī)溶劑的種類及體積分?jǐn)?shù)不僅對催化反應(yīng)有顯著的影響，還影響到桃葉珊瑚苷和苷元的溶解性，以及產(chǎn)物分離難易程度。因此實驗考察了桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在不同有機(jī)溶劑和水雙相中的分配情況，分配效果通過lgP值評價，lgP值越大說明該物質(zhì)在有機(jī)相中的分布比例越高。lgP值是桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在有機(jī)相與水相中濃度的比值再取對數(shù)，lgP=0表明水相中分布比例與有機(jī)相中相同，lgP>0表明水相中分布比例小于有機(jī)相中，lgP<0表明水相分布比例大于有機(jī)相分布比例。從表1中可知，產(chǎn)物桃葉珊瑚苷元在多種雙相體系中l(wèi)gP值均小于0，表明其在水相中的分布比例大于其在有機(jī)相中的分布比例。其中，桃葉珊瑚苷元在正丁醇中l(wèi)gP值最高，表明桃葉珊瑚苷元在正丁醇中溶解性最好，最有利于苷元的穩(wěn)定[9]。從底物桃葉珊瑚苷的lgP值可知，桃葉珊瑚苷在乙酸乙酯中溶解性能最好，由于酶解反應(yīng)主要在水相中進(jìn)行，因此乙酸乙酯-水雙相體系不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，但桃葉珊瑚苷在正丁醇-水雙相體系中具有比較適中的分配比例。所以選用正丁醇開展后續(xù)雙相酶解制備桃葉珊瑚苷元反應(yīng)。

表1 桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在不同有機(jī)溶劑的分配情況

2.2.2正丁醇體積分?jǐn)?shù) 雙相酶解體系中體積分?jǐn)?shù)為0、 20%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和90%的正丁醇對桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)化率和苷元產(chǎn)率的影響如圖2(a)所示。正丁醇體積分?jǐn)?shù)小于80%時，桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率隨著有機(jī)相含量的增加而提高，轉(zhuǎn)化率不斷下降。體積分?jǐn)?shù)大于80%時，隨著有機(jī)相比例增加，產(chǎn)率逐漸下降，推測是有機(jī)溶劑抑制了酶的活性。因此選擇體積分?jǐn)?shù)80%的正丁醇用于后續(xù)雙相酶解。

2.2.3反應(yīng)溫度 雙相酶解體系中反應(yīng)溫度對桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)化率和苷元產(chǎn)率的影響如圖2(b)所示。隨著溫度的升高，桃葉珊瑚苷的轉(zhuǎn)化率不斷提高。相同酶解時間時，桃葉珊瑚苷元在35 ℃產(chǎn)率最高，溫度高于35 ℃后桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率開始下降。主要原因可能是生成的苷元的量低于因溫度上升降解的苷元的量。因此，選擇雙相酶解反應(yīng)溫度為35 ℃。

2.2.4酶解時間 雙相酶解體系中酶解時間對桃葉珊瑚苷轉(zhuǎn)化率和苷元產(chǎn)率的影響如圖2(c)所示。30 min以內(nèi)，轉(zhuǎn)化率隨著時間增加而不斷升高；桃葉珊瑚苷在30 min時幾乎完全轉(zhuǎn)化，30 min以后隨著酶解時間的延長，轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定，60 min時能達(dá)到完全轉(zhuǎn)化。0～20 min，桃葉珊瑚苷元產(chǎn)率隨著時間增加而提高，在20 min時產(chǎn)率達(dá)到最大值。因此，選擇雙相酶解時間為20 min。在此條件下，雙相酶解制備桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率高達(dá)87.9%。

a.正丁醇體積分?jǐn)?shù) volume fraction of n-butanol； b.反應(yīng)溫度reaction temperature； c.酶解時間enzymolysis time

本研究結(jié)果表明，采用雙相水解工藝更有利于桃葉珊瑚苷元的穩(wěn)定，同時能有效提高桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率。由于桃葉珊瑚苷是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，在水解過程中會生成半縮醛結(jié)構(gòu)的苷元，苷元在水溶液中會發(fā)生自身聚合，生成二聚體，并且苷元易與具有蛋白結(jié)構(gòu)的酶發(fā)生反應(yīng)，伴隨褐色副產(chǎn)物的生成。副反應(yīng)一方面鈍化了酶的活力[17]，使環(huán)烯醚萜苷的水解難以徹底完成，同時消耗了水解產(chǎn)物環(huán)烯醚萜苷元，降低了產(chǎn)率。本研究利用水解產(chǎn)物桃葉珊瑚苷元與桃葉珊瑚苷在有機(jī)溶劑中溶解性的差異，選用了較為合適的有機(jī)溶劑正丁醇，在酶解反應(yīng)的同時，從反應(yīng)液中及時萃取分離出酶解生成的苷元，減少酶的鈍化和產(chǎn)物的聚合，因而能顯著提高苷元的產(chǎn)率。

2.3 桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性分析

2.3.1溫度的影響 在不同溫度下測定桃葉珊瑚苷元含量的變化，結(jié)果如圖3(a)所示。桃葉珊瑚苷元在-20和0 ℃條件下非常穩(wěn)定，-20 ℃保溫12 h內(nèi)不會降解。37 ℃保溫12 h時幾乎全部降解，隨著溫度增高苷元穩(wěn)定性降低，70 ℃下保溫僅4 h苷元就幾乎全部降解，表明桃葉珊瑚苷元熱穩(wěn)定性很差。

2.3.2pH值的影響 在不同pH值條件下分析桃葉珊瑚苷元含量，結(jié)果如圖3(b)所示。桃葉珊瑚苷元在酸性條件下較為穩(wěn)定，在中性和堿性條件下極易分解，在pH值3.0條件下8 h僅降解12%。

2.3.3抗氧化劑質(zhì)量濃度的影響 桃葉珊瑚苷元極易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，通過添加抗氧化劑如VC溶液可以一定程度緩解桃葉珊瑚苷元的降解。在不同VC質(zhì)量濃度下測定桃葉珊瑚苷元含量，結(jié)果如圖3(c)所示。桃葉珊瑚苷元在抗氧化劑存在條件下相對穩(wěn)定，VC加入后苷元分解量明顯減少，隨著加入VC質(zhì)量濃度的增加，苷元分解持續(xù)減少，VC質(zhì)量濃度高于5 g/L時，苷元分解量不再持續(xù)減少，因此最適VC質(zhì)量濃度為5 g/L，此時桃葉珊瑚苷元2 h內(nèi)僅降解8%。

2.3.4有機(jī)溶劑的影響 苷元在有機(jī)溶劑正丁醇、正己醇中溶解性較好，且桃葉珊瑚苷元在低溫的乙酸乙酯中比較穩(wěn)定[9]，因此考察了3種有機(jī)溶劑對桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖3(d)所示。以苷元在水相溶液中穩(wěn)定性作為對照，可以看出桃葉珊瑚苷元在正己醇中穩(wěn)定性較差，4 h內(nèi)完全降解；在乙酸乙酯和正丁醇中比較穩(wěn)定，8 h內(nèi)幾乎不降解。但乙酸乙酯-水體系易發(fā)生乳化現(xiàn)象，影響苷元的分離。

a.溫度temperature； b.pH值 pH value； c.VC質(zhì)量濃度 VC mass concn.； d.有機(jī)溶劑種類types of organic solvents

顯然，有機(jī)溶劑對桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性有較大影響，可能是由于有機(jī)溶劑對桃葉珊瑚苷元產(chǎn)生了溶劑化效應(yīng)[18]。溶劑化效應(yīng)可以提高異構(gòu)體的穩(wěn)定性，極性較大時穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，因此桃葉珊瑚苷元在極性較高的正丁醇中穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。研究結(jié)果也表明，在今后制備桃葉珊瑚苷元的整個過程中，要將酶法轉(zhuǎn)化影響因素、分離方法、保藏手段與桃葉珊瑚苷元穩(wěn)定性影響因素結(jié)合起來。

3 結(jié) 論

3.1適宜的單水相酶解桃葉珊瑚苷條件為：酶用量25 U/mL、酶解時間20 min、反應(yīng)溫度35 ℃，在此條件下，桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率為46.3%；雙相酶解法催化桃葉珊瑚苷生成桃葉珊瑚苷元的適宜條件為：正丁醇體積分?jǐn)?shù)為80%、酶用量25 U/mL、酶解時間20 min、反應(yīng)溫度35 ℃，在此條件下，桃葉珊瑚苷元的產(chǎn)率高達(dá)87.9%，是目前有關(guān)報道中最高的產(chǎn)率。而且雙相酶解法能在反應(yīng)的同時萃取分離生成的苷元，將其保留在有機(jī)相中，減少酶的鈍化和產(chǎn)物的聚合。

3.2桃葉珊瑚苷元熱穩(wěn)定性較差，在-20和0 ℃條件下非常穩(wěn)定；在pH值3.0時較為穩(wěn)定，8 h內(nèi)僅降解12%；苷元極易氧化聚合，添加5 g/L的VC可在一定程度緩解桃葉珊瑚苷元的氧化聚合；有機(jī)溶劑極性影響著桃葉珊瑚苷元的穩(wěn)定性，桃葉珊瑚苷元在正丁醇和乙酸乙酯中都比較穩(wěn)定，但由于乙酸乙酯相與水相極易產(chǎn)生乳化，正丁醇更利于分離、保存桃葉珊瑚苷元。