陳虹霞， 周 昊,2， 葉建中， 陶 冉， 李文君, 王成章,2*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

沉香為瑞香科沉香屬(Aquilaria)植物中含有黑色樹(shù)脂的木質(zhì)部分，具有極高的藥用和收藏價(jià)值，是我國(guó)以及東南亞地區(qū)的傳統(tǒng)名貴藥材，通常被用作鎮(zhèn)靜劑。它也是名貴的天然香料，在世界范圍內(nèi)被用作熏香[1]。沉香和沉香精油的研究表明，色酮、倍半萜和芳香性小分子化合物是其主要化學(xué)成分[2-3]。目前沉香精油化學(xué)成分的研究通常采用乙醚超聲波法、乙醚冷浸法、超臨界二氧化碳萃取法或水蒸氣蒸餾法提取，然后進(jìn)行檢測(cè)分析。乙醚萃取法溶劑用量大，而超臨界二氧化碳萃取法和水蒸氣蒸餾法的樣品用量大且提取時(shí)間長(zhǎng)?；|(zhì)固相分散(MSPD)是Barker于1989年提出的，在樣品制備中得到了廣泛的應(yīng)用，已被證明是一種簡(jiǎn)單、高效、通用的測(cè)定固體和半固體基質(zhì)中各種分析物的技術(shù)[4-6]。MSPD技術(shù)將固體樣品在介質(zhì)中與分散劑混合研磨，樣品的原始結(jié)構(gòu)被破壞，從而可以釋放出分析物。然后將所得混合物加載到層析柱上，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摲治鑫?。在這種方法中，提取和純化過(guò)程可以集成到一個(gè)步驟中，這與其他傳統(tǒng)方法不同。集成不僅可以大大減少分析時(shí)間和有機(jī)溶劑的消耗，而且可以得到滿意的富集因子[7]。本研究采用MSPD法對(duì)沉香精油進(jìn)行提取，以沉香化學(xué)成分為指標(biāo)，對(duì)吸附基質(zhì)種類和比例、分散溶劑種類和比例、洗脫溶劑用量等幾個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的MSPD條件。建立沉香精油化學(xué)成分檢測(cè)的基質(zhì)固相分散-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與乙醚超聲波法進(jìn)行比較，以期為沉香質(zhì)量評(píng)價(jià)和后續(xù)的調(diào)查研究提供一種新方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

沉香樣品，產(chǎn)自海南，為生物結(jié)香方式，樣品粉碎成粉末，過(guò)0.85 mm的篩，備用。十八烷基硅膠填料(C18)、辛基硅膠填料(C8)購(gòu)于大連依利特分析儀器有限公司； 硅藻土、硅膠、硅酸鎂顆粒、石英砂、甲醇、無(wú)水乙醇、正丙醇、異丙醇、正己烷、乙酸乙酯和1,4-二氧雜環(huán)己烷(二氧六環(huán))購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；芐基丙酮購(gòu)于阿拉丁生化科技股份有限公司；檀香醇購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；2-(2-苯乙基)色酮購(gòu)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。GC2014C型氣相色譜(GC)儀，日本島津公司；Agilent-7890型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國(guó)Agilent Technologies有限公司。

1.2 沉香精油的提取

1.2.1基質(zhì)固相分散提取及單因素試驗(yàn) 稱取沉香粉末0.5 g，加入吸附基質(zhì)和分散溶劑置于研缽中，用研杵使其混勻并研磨完全后，轉(zhuǎn)入到底部墊有脫脂棉的10 mL注射器中。用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過(guò)0.45 μm的濾膜，得到供試樣品溶液，用GC進(jìn)行峰面積的檢測(cè)。沉香精油成分復(fù)雜，根據(jù)文獻(xiàn)[8～10]可知，其精油成分達(dá)到45～77種，一方面化合物種類太多，另一方面相當(dāng)一些化合物沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以采購(gòu)，因此不能完全對(duì)所有成分的提取量變化進(jìn)行研究。沉香精油的主要成分為芳香族化合物、倍半萜和色酮類化合物，最終從芳香族化合物中選擇芐基丙酮，倍半萜中選擇檀香醇，色酮類化合物中選擇2-(2-苯乙基)色酮作為主要分析對(duì)象，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究不同條件對(duì)沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響。選取了5個(gè)因素，分別為吸附基質(zhì)種類、樣品與吸附基質(zhì)的比例、分散溶劑種類、樣品與分散溶劑的比例和洗脫溶劑用量進(jìn)行基質(zhì)分散提取試驗(yàn)?？疾觳煌蛩貙?duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮GC檢測(cè)峰面積的影響。

1.2.2乙醚超聲波提取 稱取沉香粉末0.5 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入乙醚30 mL，在室溫下，超聲波處理60 min，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過(guò)0.45 μm的濾膜，即為供試樣品溶液，用GC進(jìn)行峰面積的檢測(cè)[11]。

1.3 精油中3種主要化合物的測(cè)定

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備 將芐基丙酮、檀香醇、2-(2-苯乙基)色酮用乙醇溶解于10 mL的容量瓶中，分別配置成1 g/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。

1.3.2氣相色譜分析 色譜柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.32 μm)；程序升溫：初始溫度為50 ℃，3 ℃/min升至200 ℃，然后5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min，運(yùn)行時(shí)間86 min。載氣為高純氨氣，流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL，氣化室溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。

通過(guò)對(duì)比供試樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，確定供試樣品溶液氣相色譜圖中芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮的出峰位置，得到對(duì)應(yīng)的峰面積。

1.4 精油化學(xué)成分的GC-MS分析

氣相色譜分析條件同1.3.2節(jié)。質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，離子源選用EI源，電子能量70 eV，光電倍增管電壓220 V，掃描范圍29～600 u，質(zhì)譜庫(kù)NIST。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響因素

2.1.1吸附基質(zhì)類型 吸附基質(zhì)的類型對(duì)MSPD提取起著關(guān)鍵作用，一方面，吸附基質(zhì)在研磨過(guò)程中，可以破壞樣品的結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)化合物暴露；另外一方面，可以將化合物固定在吸附基質(zhì)上，然后通過(guò)溶劑提取出來(lái)[12]。固定吸附基質(zhì)與樣品(沉香粉末)的質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯(體積比9 ∶1，下同)混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g),考察7種吸附基質(zhì)(C18、C8、沙子、硅藻土、硅膠、硅酸鎂和石英砂)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，C8、硅藻土和硅酸鎂表現(xiàn)出相似的提取效果，效果較好，而沙子和石英砂的效果最差。這可能是由于沙子和石英砂的顆粒較大，比表面積較小，在吸附目標(biāo)化合物時(shí)，效果不理想。C8、硅藻土和硅酸鎂具有較大的比表面積和微孔通道，對(duì)這3個(gè)化合物的吸附效果較好。C18和硅膠的提取效果欠佳，可能是由于它們與化合物之間形成了較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合，使洗脫溶劑難以完全將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)。綜合比較，由于硅酸鎂對(duì)芐基丙酮和檀香醇的吸附效果優(yōu)于C8和硅藻土，因此選擇硅酸鎂作為吸附基質(zhì)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.1.2吸附基質(zhì)與樣品的比例 吸附基質(zhì)與樣品的比例是影響MSPD提取過(guò)程的重要因素之一。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，洗脫溶劑正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1 和5 ∶1)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，當(dāng)質(zhì)量比增至4 ∶1時(shí)， 3個(gè)化合物峰面積隨之增加，這是由于吸附基質(zhì)與樣品的接觸面積增加，從而增強(qiáng)了對(duì)化合物的吸附能力。但到5 ∶1時(shí)， 3個(gè)化合物的峰面積都隨之略微下降，可能由于過(guò)多的吸附基質(zhì)，使化合物的洗脫受到阻礙。因此，選擇吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為4 ∶1。

2.1.3分散溶劑種類 分散溶劑的選擇是植物精油類樣品提取過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù)，分散溶劑既要能與樣品中的化合物相似相溶，又要能夠與洗脫溶劑混溶。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察5種分散溶劑(甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和1,4-二氧六環(huán))對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，乙醇和異丙醇作為分散溶劑時(shí)，化合物的峰面積相對(duì)較強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，乙醇作為分散溶劑時(shí)，樣品的萃取過(guò)程非常緩慢，需要借助真空系統(tǒng)才能達(dá)到。因此，綜合考慮，采用異丙醇作為分散溶劑。

2.1.4樣品與分散溶劑的比例 固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，考察分散溶劑與樣品的比例(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1、 5 ∶1和6 ∶1， mL ∶g)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著分散溶劑與樣品的比例從1 ∶1增加至4 ∶1， 3個(gè)化合物的峰面積隨之增加，這可能是由于正丙醇量的增加，可以加速這些化合物的溶出，促進(jìn)它們?cè)谙疵撊軇┲械姆稚?。然而，進(jìn)一步將正丙醇的量增加至5 ∶1和6 ∶1時(shí)，3種化合物的峰面積反而略有下降，可能是由于過(guò)量的正丙醇使化合物與吸附基質(zhì)之間形成強(qiáng)列的相互作用，使化合物不能夠完全解吸下來(lái)。因此，分散溶劑與樣品的比例選擇為4 ∶1(mL ∶g)。

表1 不同條件對(duì)沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響

2.1.5洗脫溶劑用量 為了能有效地洗脫精油成分，基本都采用正己烷/乙酸乙酯體積比9 ∶1作為洗脫體系[13-14]。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，分散溶劑正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察洗脫溶劑用量(2、 4、 6、 8和10 mL)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著洗脫溶劑用量的增大，3個(gè)化合物峰面積逐漸增大，到6 mL時(shí)趨于平穩(wěn)，說(shuō)明6 mL的正己烷/乙酸乙酯混合液作為洗脫溶劑，可以達(dá)到較好的洗脫效果。

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到沉香精油基質(zhì)固相分散提取的最佳工藝條件為：硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，沉香精油的提取得率平均值為(9.19±0.15)%，而傳統(tǒng)的乙醚超聲波提取的得率為(6.65±0.22)%。

2.2 沉香精油的化學(xué)組成

2.2.1化學(xué)組成分析 基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油的總離子流圖見(jiàn)圖1，2種提取方法的色譜峰的整體差異不大?；|(zhì)固相萃取的色譜峰的豐度比乙醚超聲波提取的高，這與基質(zhì)固相萃取的得率大有關(guān)。各峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖通過(guò)Nist17標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖系統(tǒng)檢索，結(jié)合質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照確定其化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法確定各化合物的含量(以相對(duì)峰面積計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表2。

a.基質(zhì)固相分散提取matrix solid-phase dispersion; b.乙醚超聲波提取ultrasonic assisted ether extraction

表2 不同提取方法所得沉香精油的化學(xué)成分

2種提取方法共鑒定出54種主要成分，其中基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取分別鑒定出48和41種。基質(zhì)固相分散提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類占25.67%，色酮類占26.85%，脂肪族占7.50%；乙醚超聲波提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的77.90%，其中芳香族占3.68%，倍半萜類占25.78%，色酮類占32.83%，脂肪族占11.38%。

2.2.2兩種提取方法對(duì)比 基質(zhì)固相分散提取檢測(cè)出的總化合物的數(shù)量略高于乙醚超聲波提取，增加的成分主要為倍半萜類化合物，如γ-芹子烯、β-檀香醇、纈草- 4,7(11)二烯、α-愈創(chuàng)木烯、白菖醇和1,9-馬兜鈴二烯。芹子烯具有泥土或根部的氣味；β-檀香醇呈現(xiàn)典型的檀香木香氣，帶有濃烈的木香和奶香，以及略帶尿的氣味[15]，這些化合物的存在賦予沉香精油更豐富的香氣組成。但2種方法得到的倍半萜類化合物的總含量沒(méi)有明顯區(qū)別。在基質(zhì)固相分散提取得到的沉香精油中，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)小的成分較多，而乙醚超聲波提取得到的沉香精油中，Mr大的成分較多?；|(zhì)固相分散提取沉香精油中色酮類和脂肪族化合物總含量較乙醚超聲波提取的精油略低。這可能是由于乙醚超聲波提取的主要溶劑乙醚的極性較低，同時(shí)鑒于超聲波的存在，產(chǎn)生了空化、機(jī)械和熱效應(yīng)，可以有效破壞沉香的細(xì)胞壁，加速乙醚滲透到沉香細(xì)胞中，使得色酮類和脂肪族這些Mr大的化合物能更好地傳質(zhì)和溶出[16-17]。

色酮類化合物是沉香及沉香精油的主要活性成分，也是品質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。色酮類化合物在加熱裂解時(shí)，會(huì)產(chǎn)生苯甲醛和對(duì)甲氧基苯甲醛，可以產(chǎn)生持久的香味[18]，同時(shí)具有多種生物及藥理活性，如神經(jīng)保護(hù)[19]、抗腫瘤細(xì)胞毒[20]、抑制酶活性[21]、抗菌[22]和抗炎[23]等。沉香中色酮類化合物主要分為4種類型：四氫-2-(2-苯乙基)色酮、環(huán)氧四氫-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮和二環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮[24]。采用氣相色譜-質(zhì)譜法從基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油共檢測(cè)出4種色酮化合物，分別為2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-苯乙基色酮、6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮和6,7-二甲氧基-2-[2 -(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮。兩種提取方式在色酮類化合物的種類上沒(méi)有區(qū)別，但是乙醚超聲波提取的色酮類化合物含量較基質(zhì)固相分散提取的高。從色酮類含量來(lái)看，乙醚超聲波提取較優(yōu)。脂肪族化合物在受到微生物、光、熱和空氣的作用下，容易氧化形成過(guò)氧化物，再分解生成低Mr的酸[25]。從表2的分析來(lái)看，乙醚超聲波提取的脂肪族化合物的含量較基質(zhì)固相分散提取的高。而沉香精油中的脂肪族化合物不是越多越好，脂肪族化合物含量較多時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存容易使沉香精油發(fā)生酸敗，產(chǎn)生特殊有刺激性的氣味，從而影響沉香精油的品質(zhì)。因此，從一這方面考慮，基質(zhì)固相分散提取較優(yōu)。從精油的化學(xué)組成上來(lái)看，兩種提取方法在主要成分上較一致，主要為芳香族、倍半萜類、色酮類和脂肪族化合物。相比乙醚超聲波提取，基質(zhì)固相分散提取的沉香精油中倍半萜化合物的組成更為豐富。但是乙醚超聲波提取的沉香精油中色酮類化合物和脂肪族化合物的含量較高。因此也很難確定兩種提取方法哪個(gè)更優(yōu)。從提取過(guò)程和得率上來(lái)看，基質(zhì)固相分散提取具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) 提取得率較高；2) 提取過(guò)程有機(jī)溶劑的用量少，僅為乙醚超聲提取的五分之一； 3) 提取過(guò)程常溫就可以進(jìn)行，且提取過(guò)程對(duì)化學(xué)成分的破壞小。因此，綜上所述，基質(zhì)固相分散提取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法能夠真實(shí)反映沉香精油的化學(xué)成分，可作為沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的一種快速鑒別方法。

3 結(jié) 論

3.1建立了基質(zhì)固相分散提取沉香精油的方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了最佳工藝條件：硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，沉香精油的提取得率為(9.19±0.15)%。

3.2采用GC-MS分析了基質(zhì)固相分散提取沉香精油的化學(xué)成分，總共鑒定化合物48種，已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類占25.67%，色酮類占26.85%，脂肪族占7.5%，沉香精油化學(xué)成分組成與乙醚超聲波提取得到的相似。

3.3基質(zhì)固相分散提取具有提取得率高，溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法能夠真實(shí)反映沉香精油的化學(xué)成分，可作為沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的一種快速鑒別方法。