靳冰玉，王 陳，趙 悅，張曉康，梁 賓，向 陽，盧 丹，鄭 芳

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院 a.基因診斷中心;b.超聲影像科，武漢 430071)

成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)，又稱“脆骨病”、“瓷娃娃病”，是一種具有臨床異質(zhì)性的罕見性骨骼遺傳病，在新生兒中發(fā)病率為1/15000～1/20000[1]，其病變范圍不僅限于骨骼，還常累及眼、耳、牙齒、皮膚等，臨床主要特征為身材矮小、多發(fā)性骨折、藍色鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、進行性聽力喪失等[2]。OI的發(fā)生大多數(shù)是由編碼I型膠原α鏈的COL1A1、COL1A2基因突變引起，其中COL1A1基因突變最為常見，通常是常染色體顯性遺傳，此外其他基因如TMEM38B、FKBP10、CRTAP、SERPINF1、PPIB、PLOD2以及WNT等也被報道與常染色體隱性遺傳成骨不全癥密切相關(guān)[3-4]。OI患者從輕微骨骼畸形到嚴重甚至到死亡程度不一，超聲是目前產(chǎn)前診斷OI的主要方法，超聲結(jié)合基因檢測將更有助于明確診斷OI和進行分型。本研究對3例胎兒組織DNA行全外顯子組檢測并對發(fā)現(xiàn)的突變進行Sanger測序驗證，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2019年4月至2019年9月，3例就診于武漢大學(xué)中南醫(yī)院的孕婦產(chǎn)前超聲提示胎兒成骨發(fā)育不全。胎兒1：孕25周，雙頂徑5.56cm，胎頭周徑20.36cm，胎兒腹圍18.96cm，股骨長3.08cm，肱骨長3.16cm，產(chǎn)前超聲提示胎兒顱骨形態(tài)異常，呈“橄欖”狀，雙下肢長骨短小、彎曲成角(圖1A)，充分知情下引產(chǎn)結(jié)束妊娠并提取胎兒組織DNA行全外顯子測序。胎兒2:孕23周，雙頂徑5.52cm，胎頭周徑19.82cm，胎兒腹圍16.8cm，股骨長2.9cm，肱骨長3.01cm，產(chǎn)前超聲可見胎兒雙下肢短、彎曲(圖1B)，孕24周時于我院引產(chǎn)，并將胎兒組織DNA進行全外顯子測序。胎兒3：孕24周，雙頂徑5.94cm，胎頭周徑22.31cm，胎兒腹圍19.64cm，股骨長3.01cm，肱骨長3.68cm，超聲明顯可見雙下肢長骨短小，雙側(cè)股骨彎曲，右側(cè)股骨彎曲成角(圖1C)，B超提示成骨發(fā)育不全的可能性較大，故而引產(chǎn)并行全外顯子測序基因檢測。其母曾在2016年孕第一胎時超聲檢查胎兒雙側(cè)股骨彎曲，股徑測量值小于正常值后引產(chǎn)。本研究經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，胎兒父母均簽署知情同意書。

圖1 3例胎兒產(chǎn)前超聲股骨圖片(箭頭指示股骨)

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取胎兒引產(chǎn)組織并提取DNA，采集胎兒父母外周靜脈血樣各2mL,EDTA-K2抗凝，提取基因組DNA(Zymo Research Quick-DNA Miniprep Plus Kit,USA)，所有步驟均按DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 全外顯子測序(WES)及數(shù)據(jù)分析 取胎兒及其父母的基因組DNA，委托上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技有限公司，通過超聲打斷進行文庫構(gòu)建，利用Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6試劑盒進行富集，捕獲的DNA進行固相橋式PCR，并在Illumina HiSeq2500上進行雙端測序。測序數(shù)據(jù)首先去除原始數(shù)據(jù)中不符合質(zhì)控要求的Reads，然后使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)軟件與UCSC(https://genome.ucsc.edu/)提供的hg19版本人類基因組參考序列進行比對，最后使用基因組分析工具包3.7(GATK，Genome Analysis Toolkit)找出變異。進一步與人類基因突變數(shù)據(jù)庫HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和成骨不全癥數(shù)據(jù)庫(http://www.le.ac.uk/genetics/collagen/)比對，確定其是否為已知致病突變位點，用在線工具Mutation taster(http://www.mutationtaster.org/)預(yù)測突變位點的效應(yīng)，可獲得突變效應(yīng)分數(shù)；用在線工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)對錯義突變進行蛋白功能預(yù)測，預(yù)測分數(shù)越接近1，致病可能性越大；用ANTHEPROT 6.3軟件對COL1A1和TMEM38B基因編碼的野生和突變型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和疏水性比對分析，用UniProt(https://www.uniprot.org/)在線分析突變位點在不同物種中氨基酸的差異，以觀察突變位點處氨基酸序列的保守性。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)及Sanger測序驗證 根據(jù)發(fā)現(xiàn)的可疑致病位點,使用Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)針對COL1A1基因c.2533G>A(p.Gly845Arg)、c.932G>A(p.Gly311Asp)以及TMEM38B基因c.286dupT(p.Cys96Leufs*3)位點分別設(shè)計引物，在PCR擴增儀上完成基因目標變異位點的擴增，PCR擴增反應(yīng)體系為20μL，包括DNA模板2μL，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme biotech，P211)混合體系10μL(包含Taq Plus DNA Polymerase、dNTP以及緩沖體系)，上、下游引物混合液1μL，補充ddH2O至20μL。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)30次，72℃繼續(xù)延伸5min，4℃保溫。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果并將家系成員PCR產(chǎn)物用ABI 3730s型DNA序列自動分析儀(3730 DNA Analyzer)測序，與標準序列比對分析，以確定基因突變位點。

2 結(jié) 果

2.1 全外顯子組測序(WES)及Sanger驗證結(jié)果 胎兒1攜帶一個COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)雜合錯義變異，Sanger測序驗證父母均未攜帶該變異(圖2A1-3)，在HGMD數(shù)據(jù)庫中已報道該變異；胎兒2攜帶COL1A1基因c.932G>A(p.G311D)雜合錯義變異,Sanger測序驗證父母未攜帶該變異(圖2B1-3)，該變異收錄在HGMD數(shù)據(jù)庫；胎兒3攜帶TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)純合變異，Sanger測序驗證父母均為該位點雜合變異(圖2C1-3)，檢索HGMD、EXAC、gnomAD數(shù)據(jù)庫、千人基因組等多個數(shù)據(jù)庫，均未收錄該變異位點。

圖2 Sanger法測序驗證COL1A1、TMEM38B基因變異位點結(jié)果(箭頭指示變異峰)

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 Mutation taster和PolyPhen-2在線工具預(yù)測COL1A1、TMEM38B基因變異位點均為有害，提示突變位點可對蛋白質(zhì)的功能造成較大的損害，其中COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)、c.932G>A(p.G311D)雜合錯義變異Mutation taster評分均為0.999，PolyPhen-2評分均為1，TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)純合移碼變異Mutation taster評分為1，經(jīng)ANTHEPROT 6.93軟件比對分析發(fā)現(xiàn)3個變異型蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和疏水性均發(fā)生改變(圖3)，用Uniprot在線比對多個物種在變異位點處的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)3個變異位點處的氨基酸在物種進化中具有高度保守性。

圖3 A、B、C分別是COL1A1 p.845、COL1A1 p.311、TMEM38B p.96野生型和變異型附近蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及疏水性示意圖

2.3 致病性分析結(jié)果 胎兒1攜帶COL1A1基因c.2533G>A(p.Gly845Arg)雜合錯義變異，按ACMG指南標準[5]，該變異為“致病性的”(PS1+PS3+PM2+PM6+PP3)，導(dǎo)致常染色體顯性遺傳成骨不全癥。該突變與已確定為致病性的變異在同一位點有相同的氨基酸改變(PS1)[6]，且體外功能實驗已明確該變異會導(dǎo)致基因功能受損(PS3)[7]。該變異為罕見變異，在千人基因組、EXAC、gnomAD數(shù)據(jù)庫中均沒有收錄(PM2)，經(jīng)一代測序驗證胎兒1父母均未攜帶該變異(PM6)，Mutation taster、PolyPhen-2以及ANTHEPROT 6.93等多種軟件預(yù)測該變異會對基因或基因產(chǎn)物造成有害影響(PP3)。胎兒2攜帶COL1A1基因c.932G>A(p.Gly311Asp)雜合錯義變異，該變異為可能致病性(PM1+PM2+PM6+PP3)，可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳成骨不全癥。該變異位于熱點突變區(qū)域(PM1)，在千人基因組、esp6500和gnomAD數(shù)據(jù)庫中均沒有收錄(PM2)。一代測序結(jié)果顯示胎兒2父母均未攜帶該變異(PM6)，生物信息學(xué)分析工具預(yù)測該變異可損害蛋白質(zhì)的功能(PP3)。而且胎兒1和胎兒2是新發(fā)突變，一般情況下表型比較嚴重。胎兒3攜帶TMEM38B基因c.286dupT(p.Cys96Leufs*3)純合變異，該位點變異為致病性變異(PVS1+PM2+PM3)，導(dǎo)致常染色體隱性遺傳成骨不全癥。有文獻報道在體外功能實驗中該基因的無義突變可引起mRNA降解導(dǎo)致基因功能受損[2,8]，推測TMEM38B基因的功能喪失是OI的致病機制(PVS1)，該變異在EXAC、gnomAD及千人基因組等數(shù)據(jù)庫中頻率為0(PM2)且一代測序結(jié)果顯示胎兒3父母均攜帶雜合變異(PM3)。

3 討 論

OI是一種以骨質(zhì)脆弱和易骨折為特征的遺傳性結(jié)締組織疾病，嚴重成骨不全胎兒難以存活，目前我國關(guān)于成骨不全癥致病基因的研究仍缺乏且臨床尚無治愈方法，故早期診斷、預(yù)防患兒出生尤為重要。Sillence等根據(jù)患者的臨床特征和影像學(xué)資料將成骨不全癥分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種類型，這是OI分型最經(jīng)典的方式并一直使用至今。Ⅰ型癥狀表現(xiàn)較輕，常為輕微的骨質(zhì)脆弱和藍色鞏膜，發(fā)生率高；Ⅱ型又稱致死型，有嚴重的骨質(zhì)減少，長骨常表現(xiàn)為彎曲、短小，較多見于胎兒期，可伴有宮內(nèi)骨折；Ⅲ型是新生兒期存活下來最嚴重的類型，癥狀嚴重程度受年齡、其他并發(fā)癥等多因素影響，常呈進行性加重；Ⅳ型嚴重程度介于Ⅰ至Ⅲ型之間[9-10]，后續(xù)隨著越來越多的OI患者被學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，新類型的OI也逐漸出現(xiàn)，目前OI類型至少已達18型(Ⅰ型至ⅩⅧ型)。

OI主要由I型膠原蛋白缺陷引起，I型膠原蛋白作為皮膚、肌腱和骨的細胞外基質(zhì)的主要組成部分[11]，由兩條α1鏈和一條α2鏈組成，具有三螺旋結(jié)構(gòu)，膠原蛋白的正確折疊以及三重螺旋的穩(wěn)定性對其功能發(fā)揮有重要作用，最常見的三肽單位是甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸，通常描述為G-X-Y，它對三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性貢獻最大[12-13]。COL1A1基因位于17q21.33，包含51個外顯子，編碼I型膠原蛋白兩條α1鏈，COL1A1基因突變可使I型膠原的數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常，從而導(dǎo)致骨質(zhì)脆弱促使OI的發(fā)生[13-14]。如COL1A1突變使I型膠原螺旋區(qū)域的甘氨酸被取代后延遲了螺旋折疊，延長了修飾酶的進入時間，三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改變，影響膠原蛋白的功能發(fā)揮進而導(dǎo)致OI[1]。本研究中的另一種基因TMEM38B定位于9q31.2，包含6個外顯子，編碼具有291個氨基酸殘基的跨膜蛋白鈣離子通道蛋白B(TRIC-B)，TRIC-B在大多數(shù)哺乳動物組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達，參與胞內(nèi)鈣離子的釋放[15]。參與膠原代謝的多個蛋白具有鈣依賴性，TRIC-B缺乏可通過破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣依賴性基因表達以及蛋白與蛋白之間相互作用從而影響膠原合成或者通過抑制骨礦化的有效性而導(dǎo)致OI[11，16]。2012年首次報道TMEM38B基因是一個新的OI致病基因，可導(dǎo)致OI XIV型[8]，目前在國內(nèi)外已被報道的TMEM38B基因突變導(dǎo)致OI的病例中，均為常染色體隱性遺傳。然而這些突變導(dǎo)致的臨床結(jié)果是復(fù)雜的，僅根據(jù)突變的位置和類型難以預(yù)測OI嚴重程度[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，胎兒1的COL1A1基因中錯義變異c.2533G>A(p.G845R)導(dǎo)致第845位密碼子編碼的甘氨酸被精氨酸替代。1988年Byers等[18]首次報道在成骨不全癥II型患者中發(fā)現(xiàn)該變異，有研究在1例致死性圍產(chǎn)期OI患者中發(fā)現(xiàn)該突變[7]。胎兒2COL1A1基因中發(fā)現(xiàn)的1個雜合錯義變異c.932G>A(p.G311D)，使COL1A1基因的第311位密碼子編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)樘於彼帷Ｒ陨蟽蓚€突變所在結(jié)構(gòu)域是G-X-Y重復(fù)序列的膠原蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，G-X-Y三聯(lián)體中甘氨酸的錯義變異可破壞蛋白結(jié)構(gòu)和降低蛋白分泌水平而促使OI發(fā)生。有研究表明，I型膠原蛋白α1鏈不同殘基被替換導(dǎo)致OI嚴重程度不同，當帶電荷的氨基酸如天冬氨酸和精氨酸取代甘氨酸時更容易產(chǎn)生致死性后果[19]。胎兒3TMEM38B基因中發(fā)現(xiàn)一個純合移碼插入變異c.286dupT(p.C96Lfs*3)，第96位密碼子編碼的半胱氨酸變?yōu)榱涟彼?，隨后移碼了兩個氨基酸產(chǎn)生了一個終止密碼子，缺少了193個氨基酸，導(dǎo)致TRIC-B蛋白被截斷，蛋白降解致含量不足，膠原蛋白結(jié)構(gòu)改變以及合成受損從而造成功能異常，影響正常的骨骼發(fā)育，目前尚無文獻報道該變異。前面兩個新發(fā)突變，再發(fā)風(fēng)險一般認為是1/100，但不能排除生殖腺嵌合的可能。后面這個常染色體隱性遺傳的再發(fā)風(fēng)險是1/4。三個家系都要進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，妊娠時可行介入性產(chǎn)前診斷進行基因檢測或變異位點的驗證，避免患兒的出生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了COL1A1基因c.2533G>A(p.G845R)、c.932G>A(p.G311D)雜合變異以及TMEM38B基因c.286dupT(p.C96Lfs*3)純合變異。其中，TMEM38B基因變異是新發(fā)現(xiàn)的致病變異位點，研究結(jié)果豐富了成骨不全癥基因變異圖譜，并為家系的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供了重要依據(jù)。