錢鳳丹，高岸，汪碩聞，周佳純，李琴，范國(guó)榮（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080）

目前，腦卒中已成為全球范圍內(nèi)第二大死亡原因[1]，而缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占70%[2]。在首次發(fā)生IS后，及時(shí)給予抗血小板藥物作為二級(jí)預(yù)防，可減少缺血性腦卒中的復(fù)發(fā)，降低致殘率和致死率。阿司匹林、氯吡格雷作為IS急性期治療及二級(jí)預(yù)防的抗血小板藥物，已被臨床廣泛推薦使用[3-5]。然而，由于個(gè)體差異，不同人群對(duì)抗血小板藥物的敏感性不同，即使規(guī)范地使用抗血小板藥物治療，臨床上每年仍有不少卒中再發(fā)事件?；颊咚幬锘虼x的位點(diǎn)發(fā)生雜合或純合突變可能引起藥物敏感性降低，即發(fā)生阿司匹林抵抗或氯吡格雷抵抗，從而引起藥效下降，抗血小板聚集不充分，導(dǎo)致缺血性事件發(fā)生[6-7]。本研究同時(shí)分析IS患者中阿司匹林和氯吡格雷兩藥多個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性分布的特點(diǎn)，并隨訪患者一年內(nèi)IS的復(fù)發(fā)情況，以期為IS二級(jí)預(yù)防的精準(zhǔn)用藥提供參考。

1 儀器與試藥

TL988A型熒光檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司）。核酸純化試劑[商品名：耀金保，主要成分：60%聚乙二醇200（PEG200）、20 mmol·L－1KOH 和去離子水]；第一類體外診斷試劑、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司）。TL988A型熒光檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司）。

2 方法

2.1 研究對(duì)象

本研究共納入2017年3月至2019年3月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院，確診為IS的300名患者，行阿司匹林和氯吡格雷代謝相關(guān)位點(diǎn)的基因檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取2017年3月至2019年3月，在上海市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院，經(jīng)顱腦核磁共振成像（MRI）確診為IS，年齡＞18歲，長(zhǎng)期接受阿司匹林和/或氯吡格雷抗血小板治療（≥1年），并同時(shí)行阿司匹林和氯吡格雷代謝相關(guān)基因檢測(cè)的病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：心源型缺血性腦卒中、腦出血史、動(dòng)脈瘤、腦血管畸形等先天性疾病、急性消化道潰瘍或消化道出血病史可能無(wú)法堅(jiān)持長(zhǎng)期服用抗血小板藥物、有其他抗血小板治療禁忌證、未同時(shí)檢測(cè)阿司匹林和氯吡格雷代謝相關(guān)基因位點(diǎn)的患者，以及用藥依從性較差的患者。

2.2 基因分型

采集患者外周靜脈血血標(biāo)本 2～3 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝真空管中，按測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒采用熒光染色原位雜交分析技術(shù)進(jìn)行基因型檢測(cè)。放入熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)；由熒光染色原位雜交分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值，得到熒光曲線圖，進(jìn)行基因分型，同時(shí)作陽(yáng)性質(zhì)控。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料采用IBM SPSS 24.0軟件進(jìn)行各項(xiàng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算入組對(duì)象每個(gè)基因位點(diǎn)等位基因百分比，對(duì)研究對(duì)象Hardy-Weinberg遺傳平衡（H-W平衡）[8]的符合程度進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＞0.05代表入組的樣本符合遺傳平衡；P＜0.05時(shí)，說(shuō)明樣本發(fā)生偏倚，需剔除。

組間差異采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析終點(diǎn)事件IS復(fù)發(fā)與患者臨床特征的相關(guān)性。單因素分析和多因素分析均使用SPSS的Binary Logistic回歸；多因素分析通過(guò)建立Logit概率方程式，分析與IS復(fù)發(fā)的影響因素。

2.4 患者隨訪

患者出院時(shí)，根據(jù)醫(yī)師是否采納阿司匹林和氯吡格雷基因檢測(cè)結(jié)果選擇藥物治療方案，分為采納建議組和未采納建議組。

采納建議組的用藥情況包括：① 阿司匹林和氯吡格雷基因檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)基因突變或等位基因缺失者，隨機(jī)選擇阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療；② 阿司匹林基因檢測(cè)結(jié)果提示基因突變或等位基因缺失，氯吡格雷未突變者，選擇氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療；③ 氯吡格雷基因檢測(cè)結(jié)果提示基因突變或等位基因缺失，阿司匹林未突變者，選擇阿司匹林100 mg，每日一次單藥治療；④ 阿司匹林和氯吡格雷基因檢測(cè)結(jié)果顯示均存在基因突變或等位基因缺失者，更換為西洛他唑50 mg，每日兩次治療。

未采納建議組的用藥情況：醫(yī)師不參考基因檢測(cè)結(jié)果，隨機(jī)為患者選擇阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療。

隨訪指標(biāo)即主要終點(diǎn)事件：由MRI明確診斷為新發(fā)IS或者短暫性腦缺血復(fù)發(fā)；次要終點(diǎn)事件為死亡，隨訪期為1年。

3 結(jié)果

3.1 患者的基本臨床特征

入組的300名IS患者中基本臨床特征見(jiàn)表1?？梢?jiàn)上海地區(qū)IS男性發(fā)病率高于女性；＞60歲的發(fā)病率高于60歲以下人群；體質(zhì)指數(shù)（BMI）≥24的占44.33%，即BMI偏高發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)較高；合并高血壓的231例（77%）、糖尿病109例（36.33%）、總膽固醇（CH）大于上限的33例（11%）、三酰甘油（TG）大于上限的108例（36%）、低密度脂蛋白（LDL）大于上限的87例（29%）、高密度脂蛋白（HDL）低于下限的144例（48%）、脂蛋白a[Lpo（a）]大于上限的89例（29.67%）、高同型半胱氨酸血癥（HCY）99例（33%）、低葉酸水平153例（51%）、頸動(dòng)脈狹窄195例（65%）。

表1 300例缺血性腦卒中患者的基本臨床特征Tab 1 Clinical data of 300 patiants with ischemic stroke

3.2 符合H-W平衡的阿司匹林和氯吡格雷相關(guān)基因代謝位點(diǎn)基因分布

根據(jù)H-W平衡檢驗(yàn)結(jié)果，PEAR1、PTGS1、GP1BA的P＞0.05，說(shuō)明群體基因遺傳平衡。GPIIIaP1A2的P＜0.05，可能與近交、種群結(jié)構(gòu)、基因分型有關(guān)聯(lián)性，不符合H-W平衡，需剔除。由表2可見(jiàn)，上海地區(qū)IS患者PEAR1的GG型為121例（40.33%），GA型129例（43.00%）；PTGS1的GG型為299例（占99.67%）。GP1BA的CC型為264例（占88.00%）。

表2 符合H-W平衡檢驗(yàn)的阿司匹林相關(guān)基因代謝位點(diǎn)基因型和等位基因分布Tab 2 Genotype and allele distribution of aspirin-related gene metabolism loci in line with H-W test

根據(jù)H-W平衡檢驗(yàn)結(jié)果，CYP2C19*2、CYP2C19*3的P＞0.05，說(shuō)明群體基因遺傳平衡。CYP2C19*17的P＜0.05，可能與近交、種群結(jié)構(gòu)、基因分型有關(guān)聯(lián)性，不符合H-W平衡，需剔除。由表3可見(jiàn)，上海地區(qū)IS患者CYP2C19*2的GG型為127例（占42.33%），GA型137例（占45.67%）；CYP2C19*3的GG型為268例（占89.33%）。

表3 符合H-W檢驗(yàn)的氯吡格雷相關(guān)基因代謝位點(diǎn)基因型和等位基因分布Tab 3 Genotype and allele distribution of clopidogrel-related gene metabolism loci in line with H-W test

3.3 阿司匹林和氯吡格雷基因代謝位點(diǎn)基因型分布和等位基因分布的比較

由表4和表5可見(jiàn)，PTGS1與IS患者的基本臨床特征無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。PEAR1、GP1BA的基因和等位基因的分布頻率與性別、年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、葉酸水平及血管狹窄情況無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。但PEAR1的基因型在CH＞5.2 mmol·L－1的患者中分布有差異（P＜0.05）；等位基因Lpo（a）＞300 mg·L－1，HCY＞15 μmol·L－1的IS患者中分布有顯著差異（P＜0.05）。GP1BA的基因型在飲酒、CH＞5.2 mmol·L－1、LDL＞2.8 mmol·L－1的患者中分布有差異（P＜0.05）；等位基因在飲酒的IS患者中分布有差異（P＜0.05）。

表4 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者阿司匹林代謝相關(guān)基因位點(diǎn)基因型分布的比較[n(%)]Tab 4 Genotype distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [(n(%)]

表5 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者阿司匹林代謝相關(guān)基因位點(diǎn)等位基因分布的比較[n(%)]Tab 5 Alleles distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

由表6和表7可見(jiàn)，CYP2C19*2的基因型在伴有高脂血癥的IS患者中的分布有顯著差異（P＜0.05），等位基因分布頻率無(wú)相關(guān)性，與其余基礎(chǔ)臨床特征和伴發(fā)疾病均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。CYP2C19*3的基因型分布在有腦卒中家族史、等位基因分布頻率在葉酸＜5.38 ng·mL－1的IS患者中有差異（P＜0.05），與其余基礎(chǔ)臨床特征和伴發(fā)疾病均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

表6 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者氯吡格雷代謝相關(guān)基因位點(diǎn)基因型分布的比較[n(%)]Tab 6 Genotype distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

表7 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者氯吡格雷代謝相關(guān)基因位點(diǎn)等位基因分布的比較[n(%)]Tab 7 Allele distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

3.4 隨訪結(jié)果

患者出院后，二級(jí)預(yù)防用藥采納建議組177例，未采納建議組123例。由表8可知，采納建議組IS復(fù)發(fā)率顯著低于未采納建議組（14.12%vs32.52%，P＜0.001）。

表8 采納建議組與未采納建議組缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的比較Tab 8 Recurrence of ischemic stroke patients between the adoption group and the non-adoption group

3.5 Logistic回歸分析

3.5.1 單因素分析 對(duì)組內(nèi)25項(xiàng)變量進(jìn)行Logistic回歸分析，初始變量結(jié)果見(jiàn)表9。300例IS患者中，單因素分析結(jié)果顯示是否采納基因檢測(cè)結(jié)果用藥、有無(wú)飲酒和有無(wú)糖尿病與IS的復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。

表9 多元逐步回歸單因素分析Tab 9 Multiple stepwise regression analysis of single factors

3.5.2 多因素分析 多因素分析使用似然比檢驗(yàn)逐步法的Logistic回歸擬合，得到方程為：Logit（P）＝ －1.059－1.010×采納＋0.702×糖尿病，由表10可知，300例IS患者中，是否采納基因檢測(cè)結(jié)果用藥和有無(wú)糖尿病與IS復(fù)發(fā)相關(guān)，根據(jù)比值比即OR（odds ratio）值，小于1的是保護(hù)因素，大于1是危險(xiǎn)因素，所以未采納基因檢測(cè)結(jié)果用藥、有糖尿病是IS復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。

表10 多元逐步回歸多因素分析Tab 10 Multiple factor stepwise regression analysis

4 討論

本研究對(duì)象為上海地區(qū)的IS患者，男性發(fā)病率是女性的2.53倍，發(fā)病高峰年齡為61～70歲。有77%的患者合并高血壓，36.33%的患者合并糖尿病，33%的患者合并高型半胱氨酸血癥，51%的患者葉酸水平低于正常值，65%的患者有頸動(dòng)脈狹窄。

藥物基因多態(tài)性引起的個(gè)體化差異直接影響臨床的治療效果，如抗血小板不充分，IS復(fù)發(fā)。在美國(guó)每年約795 000例腦卒中患者中，有185 000例反復(fù)發(fā)作的，其中1/3到1/2的缺血性事件復(fù)發(fā)發(fā)生在抗血小板治療期間[9]。

國(guó)內(nèi)外已有較多圍繞心腦血管疾病二級(jí)預(yù)防用藥的單一藥物的某個(gè)基因位點(diǎn)的多態(tài)性的相關(guān)研究[10-11]。而綜合阿司匹林和氯吡格雷兩種藥物、多個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，選擇二級(jí)預(yù)防用藥的療效相關(guān)研究較少。

本研究中IS人群的PEAR1、PTGS1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3位點(diǎn)符合H-W平衡，基本能反映其在上海地區(qū)IS患者中的多態(tài)性分布。并發(fā)現(xiàn)，PEAR1的GG型和GA型分別占40.33%和43.00%，攜帶A等位基因的有179例，服用阿司匹林后更易發(fā)生血小板聚集[12]，抵抗風(fēng)險(xiǎn)增加；PTGS1的GG型占99.67%，阿司匹林抵抗風(fēng)險(xiǎn)較GA型和AA型增加；GP1BA的CC型占88.00%，阿司匹林抵抗風(fēng)險(xiǎn)較CT型和TT型增加，與楊秀峰等[13]的研究一致。

CYP2C19*2的GA型占45.67%，對(duì)CYP2C19的代謝表型起主要決定作用。有研究報(bào)道中國(guó)人群CYP2C19*2，*3的突變率遠(yuǎn)高于歐洲、美洲國(guó)家和其他種族人群，與韓國(guó)和日本相近[14]。與白種人和非裔美國(guó)人人群相比，亞洲人的CYP2C19*2等位基因頻率顯著增高（13%vs18%vs30%）[15]，而CYP2C19*3的突變?cè)趤喼奕巳褐邢噍^其他人群中的出現(xiàn)概率更高（10%vs＜1%）[16-17]。

根 據(jù)PEAR1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型與等位基因的分布特點(diǎn)分析，血脂代謝異常的IS患者，其代謝水平可能與PEAR1和GP1BA的基因分型有關(guān)；HCY代謝水平可能與PEAR1的基因分型有關(guān)；飲酒的習(xí)慣可能與GP1BA的基因分型有關(guān)。伴有高脂血癥IS患者，其血脂代謝水平可能與CYP2C19*2的基因分型有關(guān)；而腦卒中家族史和患者的葉酸水平可能與CYP2C19*3的基因分型有關(guān)。因此，缺血性腦卒中患者，尤其有家族史的，在二級(jí)預(yù)防用藥的同時(shí)，需要保持良好的生活習(xí)慣，包括保持運(yùn)動(dòng)、均衡膳食，控制血脂水平，多食綠色蔬菜，適當(dāng)補(bǔ)充葉酸。

本研究300例IS患者，在出院后規(guī)律服用阿司匹林或氯吡格雷作為二級(jí)預(yù)防用藥，采納基因檢測(cè)結(jié)果用藥組缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的有25例，未采納組為40例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即同時(shí)檢測(cè)阿司匹林、氯吡格雷代謝相關(guān)基因，并可更全面地優(yōu)化IS給藥方案，并提高二級(jí)預(yù)防的療效，降低IS復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

同時(shí)，本研究也存在一定局限性：未納入其他一些干擾因素，如血管狹窄患者是否行介入治療；胃腸疾病患者是否在服用氯吡格雷的同時(shí)服用質(zhì)子泵抑制劑，如奧美拉唑可降低氯吡格雷的有效性[18]；未納入血小板抑制率檢測(cè)[19]。希望未來(lái)能有更全面的研究方案得出更可靠的證據(jù)來(lái)為臨床提供參考。