周 穎， 諶委菊， 李俊彬

（長沙理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 細(xì)胞化學(xué)湖南省重點實驗室， 湖南長沙410114）

0 前言

大腦是人體最重要和最復(fù)雜的器官，嚴(yán)格控制著身體的其他器官[1-2]。 與此同時，任何輕微的疾病和損傷都可能導(dǎo)致大腦功能產(chǎn)生障礙，從而引發(fā)各種腦部疾病，如阿爾茲海默癥、癲癇、抑郁癥及腦缺血等[3-4]。 目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病占全球疾病負(fù)擔(dān)的6．3%， 不僅給患者帶來了難以忍受的痛苦和折磨，同時也給患者家屬帶來了巨大的壓力。 隨著人口老齡化的嚴(yán)重，這一數(shù)據(jù)仍在不斷增加[5]。 研究表明，腦部疾病的發(fā)生和發(fā)展過程與活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性硫（RSS） 以及各種蛋白等物質(zhì)有著密不可分的關(guān)系。如，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的ROS、RNS 可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，造成不可逆的神經(jīng)元功能障礙，進(jìn)而引發(fā)腦部相關(guān)疾病[6-9]。 RSS 作為重要的還原調(diào)節(jié)劑，為氧化還原平衡的維持提供了重要保障[10-11]。淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和高度磷酸化的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）是阿爾茲海默癥的兩種重要的生物標(biāo)志物[12]。 此外，酶含量及活性的變化也與腦部疾病密切相關(guān)。 如腦供血不足會引起缺氧和硝基還原酶的過表達(dá)[13]；乙酰膽堿酯酶(AChE) 是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的關(guān)鍵水解酶，保證生物體內(nèi)神經(jīng)信號的正常傳遞，與抑郁癥等疾病相關(guān)[14]。 因此，實時、原位檢測腦內(nèi)生物活性分子對于揭示腦部疾病的病理機制，預(yù)防、早期診斷及有效治療腦疾病具有重要意義。

目前， 一些腦原位成像技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，如計算機斷層掃描[15]、正電子發(fā)射斷層掃描[16]、磁共振成像和血管造影[17]等。 然而，上述方法難以實現(xiàn)活性分子的原位、實時可視化。 基于小分子探針的熒光成像因具有結(jié)構(gòu)可調(diào)、 高靈敏度、高時空分辨率及操作簡便等優(yōu)點，是腦內(nèi)生物活性分子原位成像的首選。 然而，不同于其他器官的檢測與成像，用于原位檢測腦內(nèi)活性物質(zhì)的探針首先需要穿透血腦屏障。 血腦屏障（BBB）作為將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與血管系統(tǒng)分開的最嚴(yán)格調(diào)節(jié)的界面， 限制了外部物質(zhì)和有毒化學(xué)物質(zhì)的通過，只允許選擇的離子和必需分子通過[1,18]。 然而，血腦屏障的存在使得大約98%的小分子和幾乎所有的大分子都無法進(jìn)入腦實質(zhì)[1,18]，從而導(dǎo)致腦疾病診斷的效率并不理想。 雖然通過各種物理、 化學(xué)和生物刺激， 可瞬時增加BBB 的通透性[6]，在不改變小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下增強其在大腦中的積累，但這種非特異性和非選擇性的方法也會導(dǎo)致一些有毒有害物質(zhì)同時進(jìn)入大腦，帶來新的病理問題。 此外，還可通過腦注射的方式將小分子探針及藥物直接注入腦實質(zhì)，但這種方式有可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，且其準(zhǔn)確性也有待考究。

據(jù)文獻(xiàn)報道， 通過嚴(yán)格的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計，可使其能被動跨細(xì)胞擴散穿過BBB。 親脂性和分子量被認(rèn)為是評估小分子熒光探針穿過BBB 能力的兩個重要參數(shù)。 分子探針應(yīng)具有合適的脂水分配系數(shù)（一般為2．0～5．0 之間），且其分子量一般應(yīng)小于500 Da[19]，才能較好的穿透BBB。 分子氫鍵數(shù)目、分子極性表面積及靈活性等參數(shù)也可能影響其BBB 滲透能力[20-21]。 此外，因可見光的組織穿透深度較淺，為了更好的實現(xiàn)腦組織的原位成像，分子探針的激發(fā)和發(fā)射波長處于近紅外區(qū)域也是重點考慮的。 該文綜述了分子探針在大腦生物活性分子原位成像中的研究進(jìn)展，并探討該領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)與發(fā)展方向。

1 小分子熒光探針在腦原位成像中的應(yīng)用

近年來，科研工作者已設(shè)計并合成了多種小分子熒光探針用于腦原位成像，其傳感機制主要涉及光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移[22]、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移[23-24]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[25-27]、聚集誘導(dǎo)發(fā)光[28]等。 探針的分析對象主要為ROS、RNS、RSS 以及蛋白質(zhì)，為相關(guān)腦疾病的病理機制研究、診斷及治療提供了有效工具。

1.1 ROS 熒光探針

研究表明，較低水平的ROS 對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要，而細(xì)胞中ROS 的過度產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。 2017 年，冉崇昭等設(shè)計并合成了探針CRANAD-61 用于成像阿爾茲海默癥和腦淀粉樣血管病中的ROS[29]。 該探針對ROS響應(yīng)快速、靈敏度高且能穿透BBB，可同時通過微觀和宏觀水平的成像監(jiān)測大腦ROS 含量變化（圖1）。

圖1 用于ROS 敏感成像的探針CRANAD-61 的設(shè)計原理[29]Fig．1 Schematic of the design of probe CRANAD-61 for ROS-sensitive imaging[29]

劉志洪等報道了一種近紅外發(fā)射熒光探針Mito-NIRHV 用于粘度和H2O2的高靈敏檢測[30]。探針在近紅外區(qū)域有兩個獨立的發(fā)射，且兩者都具有＞200 nm 的斯托克斯位移。 基于探針良好的光物理特性和BBB 穿透能力， 該探針成功實現(xiàn)了活細(xì)胞和阿爾茲海默癥大腦中H2O2和粘度變化的成像（圖2）。

圖2 探針Mito-NIRHV 對粘度和H2O2 的響應(yīng)機理及其在AD 大腦中的成像[30]Fig．2 Response mechanism of Mito-NIRHV to viscosity and H2O2 and its imaging application in AD brain[30]

2019 年，唐波等構(gòu)建了一種雙光子熒光探針TCE 用于生命系統(tǒng)的·OH 原位成像[31]。該探針以3-甲基-吡唑啉酮的單電子氧化作為特異性識別位點，具有優(yōu)異的選擇性。 通過對抑郁癥小鼠大腦中的·OH 成像，他們發(fā)現(xiàn)·OH 的增加與抑郁嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。 此外，·OH 已被證明可以使去乙酰化酶SIRT1 失活，從而誘導(dǎo)抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展（圖3）。

圖3 探針TCE 的結(jié)構(gòu)和熒光響應(yīng)機理[32]Fig．3 Structure and fluorescence response mechanism of TCE[32]

受喹諾酮類神經(jīng)保護(hù)藥物的啟發(fā)，2020 年，錢勇等構(gòu)建了一種雙光子HClO 熒光探針HCP用于對髓過氧化物酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激進(jìn)行成像[33]。利用該探針可在具有癲癇行為的小鼠大腦中可視化過表達(dá)的HClO。 此外，他們采用探針設(shè)計了一種高通量篩選方法來篩選潛在的抗癲癇藥物以調(diào)節(jié)髓過氧化物酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。 篩選所得的黃酮類化合物芹菜素可緩解髓過氧化物酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激并抑制神經(jīng)元細(xì)胞的鐵死亡（圖4）。

圖4 探針HCP 對MPO 介導(dǎo)產(chǎn)生的HClO 的響應(yīng)機理及高通量篩選抗癲癇藥物的策略[32]Fig．4 Response mechanism of HCP to MPO-mediated HClO and strategy for high-throughput screening of antiepileptic drugs[32]

梁磊等基于噠嗪酮骨架開發(fā)了一種超靈敏的腦靶向熒光探針PCAB，用于腦內(nèi)H2O2的成像和腦缺血再灌注損傷的快速檢測[33]。作為一種雙光子熒光探針， 該探針具有較好的BBB 穿透能力，且對H2O2表現(xiàn)出快速、特異性響應(yīng)。 通過追蹤活體小鼠腦內(nèi)H2O2的動態(tài)變化， 他們發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷與H2O2誘導(dǎo)的不同大腦區(qū)域的自噬有關(guān)（圖5）。

圖5 探針PCAB 的結(jié)構(gòu)及其在腦缺血小鼠體內(nèi)對H2O2 的成像[33]Fig．5 The structure of PCAB and its imaging of H2O2 in mice with cerebral ischemia[33]

1.2 RNS 熒光探針

RNS 是一類高活性分子，在各種生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。 2019 年，錢勇等曾基于亞甲基藍(lán)報道了一種近紅外熒光探針ONP用于跟蹤活細(xì)胞和體內(nèi)過氧亞硝酸根離子（ONOO-）的動態(tài)變化[34]。 該探針具有高靈敏度和選擇性的優(yōu)點，可用于紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的大腦中內(nèi)源性O(shè)NOO-原位成像。 實驗表明ONOO-在癲癇腦中過度表達(dá)會引起神經(jīng)元損傷，而采用姜黃素給藥可消除該損傷，進(jìn)一步有效保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞（圖6）。

圖6 （A）探針ONP 對ONOO-的響應(yīng)機制；（B）探針ONP 在小鼠體內(nèi)進(jìn)行熒光成像[34]Fig．6 (A)The proposed response mechanism of ONP;(B)In vivo NIR fluorescence imaging with ONP[34]

2020 年，李新等設(shè)計開發(fā)了一種超靈敏探針B545b，用于腦中風(fēng)疾病中亞硝化應(yīng)激成像[35]。探針顯示出幾乎為零的背景熒光信號，與ONOO-響應(yīng)后熒光增強近1000 倍。 經(jīng)靜脈注入后，探針可順利穿透BBB，在腦內(nèi)迅速積聚并監(jiān)測局部血管損傷。 他們進(jìn)一步研究了中風(fēng)中亞硝基應(yīng)激的病理影響（圖7）。

圖7 （A）探針B545b 的結(jié)構(gòu)及其對ONOO-的響應(yīng)機理；（B）探針B545b 應(yīng)用于微血管堵塞的成像原理圖[35]Fig．7 (A)The structure of B545b and its response mechanism to ONOO-；(B)The imaging principle of B545b applied to microvascular occlusion[35]

1.3 RSS 熒光探針

RSS 常作為生命活動的調(diào)節(jié)劑，在損傷和氧化應(yīng)激下作為抗氧化劑發(fā)揮關(guān)鍵作用。 2019 年，唐波等報道了一種用于監(jiān)測Cys 的新型雙光子熒光探針TCS[36]，該探針具有優(yōu)異的靈敏度和生物相容性，能實現(xiàn)Cys 特異性響應(yīng)。 探針成功用于二硫蘇糖醇刺激的PC12 細(xì)胞中Cys 檢測。 通過構(gòu)建抑郁癥小鼠模型，探針成功揭示了Cys 水平與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)（圖8）。

圖8 探針TCS 的結(jié)構(gòu)及其對Cys 的響應(yīng)機理[37]Fig．8 The structure of Mito-CP and its response mechanism to Cys[37]

劉志洪等設(shè)計了一種近紅外熒光探針Mito-CP 用于跟蹤戊四唑誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作大腦中的內(nèi)源性Cys[37]。 探針具有良好的線粒體靶向和BBB穿透能力，不僅能實現(xiàn)在戊四唑刺激下PC12 細(xì)胞中Cys 的檢測， 還可以在斑馬魚中實時監(jiān)測到由脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的Cys 波動， 并成功應(yīng)用于活體小鼠癲癇模型中Cys 原位成像（圖9）。

圖9 （A）Mito-CP 的結(jié)構(gòu)及其對Cys 的響應(yīng)機理；（B）Mito-CP 應(yīng)用于小鼠中進(jìn)行熒光成像[38]Fig．9 (A)The structure of Mito-CP and its response mechanism to Cys;(B)In vivo fluorescence imaging of Mito-CP[38]

王卓等基于半花菁和Si-羅丹明結(jié)構(gòu)設(shè)計并合成了一種近紅外熒光探針SiR-Bs，用于精神分裂癥中H2S 的成像研究[38]。 Mindo-SiR 表現(xiàn)出良好的線粒體靶向性、BBB 穿透能力。 探針成功實現(xiàn)活細(xì)胞和小鼠大腦外源性和內(nèi)源性H2S 變化，并對精神分裂癥小鼠模型腦內(nèi)H2S 的變化進(jìn)行原位成像，表明精神分裂癥小鼠腦內(nèi)H2S 水平會異常升高（圖10）。

圖10 Mindo-SiR 的結(jié)構(gòu)及其對H2S 的響應(yīng)原理[38]Fig．10 Structure of Mindo-SiR and its response to H2S[38]

1.4 蛋白類熒光探針

2019 年， 崔夢超等基于多光譜熒光成像報道了一系列近紅外環(huán)境敏感型探針用于區(qū)分阿爾茲海默癥患者大腦中Aβ 斑塊和NFT[39]。 其中，探針18 與Aβ 斑塊和NFT 之間均存在強烈的相互作用， 并分別在體外和體內(nèi)熒光實驗中證實了其分辨Aβ 斑塊和Tau 聚集體的能力（圖11）。

圖11 近紅外環(huán)境敏感型探針的合成路線及其在阿爾茲海默癥小鼠中的成像應(yīng)用[39]Fig．11 Synthetic route of a series of near-infrared environment-sensitive probes and its imaging application in Alzheimer＇s disease[39]

唐波等報道了一種雙光子熒光探針MCYN用于實時可視化乙酰膽堿酯酶[14]。探針的氨基甲酸酯基團(tuán)可被乙酰膽堿酯酶特異性識別，釋放出染料，熒光顯著增強。 采用雙光子成像，探針在抑郁癥小鼠模型中成功實現(xiàn)乙酰膽堿酯酶原位成像。 作者發(fā)現(xiàn)抑郁癥小鼠大腦中的乙酰膽堿酯酶活性明顯增加（圖12）。

圖12 MCYN 的結(jié)構(gòu)及其對乙酰膽堿酯酶的響應(yīng)機制[14]Fig．12 Structure of MCYN and its response mechanism to acetylcholinesterase[14]

腦供血不足會引起缺氧和硝基還原酶（NTR）過表達(dá)。 吳水珠等設(shè)計了一種近紅外NTR熒光探針TPAQS-NO2用于監(jiān)測腦缺血小鼠模型中的缺氧[13]。 探針因存在光致電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光猝滅。 在NTR 的催化下，探針的硝基被還原為伯胺基團(tuán)，隨后發(fā)生1,6-重排消除反應(yīng)，光致電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)被阻斷，熒光增強。 探針成功用于監(jiān)測小鼠腫瘤模型中早期腫瘤和晚期腫瘤的缺氧情況及腦缺血小鼠模型中的缺氧狀態(tài)（圖13）。

圖13 探針TPAQS-NO2 對腦缺血中硝基還原酶的響應(yīng)機理[13]Fig．13 Response mechanism of TPAQS-NO2 to nitroreductase in cerebral ischemia[13]

朱為宏等通過引入親脂性π 共軛噻吩橋來紅移探針的發(fā)射波長并增強BBB 穿透性，構(gòu)建了一種近紅外聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針QM-FN-SO3[28]。探針避免了如商業(yè)硫黃素衍生物等存在的熒光自猝滅現(xiàn)象。探針與Aβ 斑塊具有出色的結(jié)合力，且結(jié)合后熒光顯著增強。 探針成功用于小鼠腦內(nèi)Aβ 斑塊的原位成像（圖14）。

圖14 探針QM-FN-SO3 的結(jié)構(gòu)及其在野生型和APP/PS1 型小鼠腦內(nèi)和離體腦切片中Aβ 斑塊的熒光成像[28]Fig．14 Structure of QM-FN-SO3 and fluorescence imaging of Aβ plaques in wild-type and APP/PS1-typemouse brains and in isolated brain sections[28]

2021 年，錢勇等通過引入分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)供體基團(tuán)， 構(gòu)建了一種基于姜黃素的近紅外熒光探針CAQ 用于選擇性監(jiān)測體內(nèi)Aβ 斑塊[40]。 探針具有出色的BBB 穿透性，可在復(fù)雜生物體系中對Aβ斑塊進(jìn)行選擇性近紅外熒光成像。 探針成功應(yīng)用于阿爾茲海默癥小鼠模型腦內(nèi)Aβ 斑塊的原位成像（圖15）。

圖15 探針CAQ 的結(jié)構(gòu)及其對Aβ 斑塊的成像原理[40]Fig．15 Structure of CAQ and its imaging principle of Aβ plaques[40]

2 結(jié)論與展望

腦疾病的預(yù)防、早期診斷及有效治療對于生命健康至關(guān)重要。 近年來，科研工作者投入了大量精力來開發(fā)用于腦原位成像的可激活小分子熒光探針，為闡明相關(guān)信號通路、實現(xiàn)腦疾病的早期診斷及治療提供了有效工具。 盡管已取得了一定進(jìn)展，但仍面臨較大的挑戰(zhàn)。 首先，探針在腦實質(zhì)中的富集效率仍然有限，并且大部分探針無法穿透BBB；其次，大多數(shù)探針的穿透深度和分辨率仍不足，雖然采取雙光子成像解決了部分問題，但是激發(fā)光能量高，面臨創(chuàng)傷的挑戰(zhàn)；再次，用于原位腦成像的分子探針構(gòu)建不僅要考慮合適的脂水分配系數(shù)， 同時也要兼顧分子量及激發(fā)、發(fā)射處于近紅外區(qū)域，難以進(jìn)行通用的設(shè)計。針對以上挑戰(zhàn)，開發(fā)具有通用的設(shè)計思路，如篩選合適的熒光基團(tuán)及合適的靶向基團(tuán)構(gòu)建探針，滿足大腦內(nèi)更多生物活性分子的實時、原位成像需求可能是未來的發(fā)展方向之一。